一種用于蛋白聚糖高靈敏度檢測的試劑盒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于蛋白聚糖高靈敏度檢測的試劑盒及其制備方法，屬于生物分 析和醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白聚糖(proteoglycan，PG)是一類復(fù)雜的生物大分子，在核心蛋白上共價偶聯(lián) 著一條或多條糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)鏈。GAG是由重復(fù)的二糖單位組成的直鏈 多糖，主要分為四類:透明質(zhì)酸(HA)、硫酸軟骨素(CS)/硫酸皮膚素(DS)、硫酸角質(zhì)素(KS)及 肝素(Hep)/硫酸乙酰肝素(HS)。其中透明質(zhì)酸不與核心蛋白結(jié)合組成蛋白聚糖。蛋白聚糖 除含糖胺聚糖鏈外，還偶聯(lián)一些N-或0-鏈接的寡糖鏈。
[0003] PG在細(xì)胞外基質(zhì)中廣泛分布，也存在于細(xì)胞表面以及細(xì)胞內(nèi)的分泌顆粒中。在機 體中PG參與了眾多生理學(xué)過程，如作為組織結(jié)構(gòu)的構(gòu)成原件存在，調(diào)控細(xì)胞的增殖、粘附、 迀移和變異等過程，還參與生長因子、細(xì)胞因子的結(jié)合，細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，神經(jīng)元的生長和 形態(tài)發(fā)生等過程。在癌變微環(huán)境中，PG的表達(dá)顯著改變，因此一部分蛋白聚糖被用作檢測某 些疾病的特異性標(biāo)志分子，如蛋白聚糖Glypican的家族成員之一Glypican-3(GPC3)，目前 被普遍認(rèn)為是肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的特異性標(biāo)志分子。
[0004] GPC3由單鏈核心蛋白、硫酸乙酰肝素 (Heparin Sulfate，HS)鏈和糖基化磷脂酰肌 醇（81}^〇87]^11〇8。1131:丨(171;[1108；[1:01，6?1)組成，通過6?1錨定于細(xì)胞膜上。6?03在75%的 HCC中顯著表達(dá)，但在肝臟正常組織和良性病變中并不表達(dá)，因此是比甲胎球蛋白更為特異 和靈敏的新型HCC標(biāo)志分子。
[0005] 由于蛋白聚糖核心蛋白分子量的大小及其結(jié)構(gòu)不同，且共價偶聯(lián)的GAG鏈的數(shù)量、 種類、長度、硫酸化程度及偶聯(lián)部位不同，使得蛋白聚糖組成復(fù)雜，結(jié)構(gòu)多樣，因而給其檢測 帶來了諸多困難。在GPC3的檢測中，目前最常用的檢測方法為夾心ELISA法，但其檢測靈敏 度偏低，只能檢測到50%左右HCC病人血清中有明顯GPC3存在;且由于第一抗體在酶標(biāo)板上 的吸附包被及第二抗體與抗原的結(jié)合需要孵育過夜，完成一次實驗需要三天時間，耗時較 長，這極大的限制了此方法的應(yīng)用，給GPC3的檢測帶來了困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于蛋白聚糖高靈敏度檢測的試劑盒及其 制備方法。該試劑盒可運用耦聯(lián)抗體的石墨烯與GPC3核心蛋白的結(jié)合，對結(jié)合在GPC3 HS側(cè) 鏈上的ScGFP的熒光淬滅作用達(dá)到對血清/血漿中HCC的標(biāo)志物GPC3的高靈敏度快速檢測。
[0007] -種用于蛋白聚糖高靈敏度檢測的試劑盒，包括：
[0008] 偶聯(lián)單克隆抗體的羧基石墨烯和/或偶聯(lián)多克隆抗體的羧基石墨烯;偶聯(lián)單克隆 抗體的羧基石墨烯包括:偶聯(lián)單克隆抗體1的羧基石墨烯，所述單克隆抗體1為蛋白聚糖的 核心蛋白的羧基端氨基酸序列做為抗原免疫后制得的抗體;偶聯(lián)單克隆抗體2的羧基石墨 烯，所述單克隆抗體2為蛋白聚糖的核心蛋白的氨基端氨基酸序列做為抗原免疫后制得的 抗體;偶聯(lián)多克隆抗體的羧基石墨烯包括:偶聯(lián)多克隆抗體3的羧基石墨烯，所述多克隆抗 體3為蛋白聚糖的核心蛋白的羧基端氨基酸序列做為抗原免疫后制得的抗體;偶聯(lián)多克隆 抗體4的羧基石墨烯，所述多克隆抗體4為蛋白聚糖的核心蛋白的氨基端氨基酸序列做為抗 原免疫后制得的抗體；
[0009] 帶高正電荷的熒光蛋白；
[0010] 緩沖液:含有濃度5~50mM Tris-HCl和濃度50~200mM NaCl的溶液。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述蛋白聚糖為GPC3、GPC1、GPC2、GPC4、GPC5、GPC6、 Syndecan-1、Syndecan_2、Syndecan_3、Syndecan-4、Versican、Aggrecan、Brevican、 0〇(3〇1'；[11、1^1111；^311、？61'1630311、481'；[11、0)44或如2;進一步優(yōu)選的，所述的蛋白聚糖為GPC3或 蛋白聚糖Syndecan-2;最優(yōu)的，所述蛋白聚糖為GPC3時，羧基端氨基酸序列長度為50~90個 氨基酸，氨基端氨基酸序列長度為490~530個氨基酸。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述偶聯(lián)單克隆抗體1的羧基石墨烯的濃度為5~20yg/mL。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述偶聯(lián)單克隆抗體2的羧基石墨烯的濃度為5~20yg/mL。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述偶聯(lián)多克隆抗體3的羧基石墨烯的濃度為5~20yg/mL。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述偶聯(lián)多克隆抗體4的羧基石墨烯的濃度為5~20yg/mL。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述帶高正電荷的熒光蛋白的濃度為0.001~O.OlygAiL;進 一步優(yōu)選的，所述的帶尚正電荷焚光蛋白為尚正電荷綠色焚光蛋白（ScGFP)。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，還包括裝配試劑盒必須的微孔板、錫箱紙。
[0018] 上述用于蛋白聚糖高靈敏度檢測的試劑盒的制備方法，步驟如下：
[0019] (1)將單克隆抗體1加入到羧基石墨烯溶液中，混勻，靜置lmin，然后加入表面活性 劑，再加入封閉劑，混合均勻，靜置封閉1~3min，制得偶聯(lián)單克隆抗體1的羧基石墨烯；
[0020] 將單克隆抗體2加入到羧基石墨烯溶液中，混勻，靜置lmin，然后加入表面活性劑， 再加入封閉劑，混合均勻，靜置封閉1~3min，制得偶聯(lián)單克隆抗體2的羧基石墨烯；
[0021 ]將多克隆抗體3加入到羧基石墨烯溶液中，混勻，靜置lmin，然后加入表面活性劑， 再加入封閉劑，混合均勻，靜置封閉1~3min，制得偶聯(lián)多克隆抗體3的羧基石墨烯；
[0022] 和/或，
[0023] 將多克隆抗體4加入到羧基石墨烯溶液中，混勻，靜置lmin，然后加入表面活性劑， 再加入封閉劑，混合均勻，靜置封閉1~3min，制得偶聯(lián)多克隆抗體4的羧基石墨烯；
[0024] (2)制備帶尚正電荷焚光蛋白，配制帶尚正電荷焚光蛋白溶液；
[0025] (3)配制含有濃度5~50mM Tris-HCl和濃度50~200mM NaCl的溶液，制得緩沖液；
[0026] (4)分別將步驟（1)制得的偶聯(lián)單克隆抗體1的羧基石墨烯、步驟（1)制得的偶聯(lián)單 克隆抗體2的羧基石墨烯、步驟(2)制得的帶高正電荷熒光蛋白溶液和步驟(3)制得的緩沖 液經(jīng)裝配后，制得用于蛋白聚糖高靈敏度檢測的試劑盒。
[0027]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（1)中，表面活性劑為乙二胺四乙酸(EDTA)或十二烷 基磺酸鈉(SDS)，每毫升反應(yīng)體系加入表面活性劑1~5yL;封閉劑為牛血清白蛋白（BSA)，反 應(yīng)體系中加入封閉劑至質(zhì)量濃度為0.5 %~2 %。
[0028]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟（1)中，所述羧基石墨烯的反應(yīng)質(zhì)量濃度為0.8~ 1.2mg/mL，羧基石墨稀與單克隆抗體1的反應(yīng)質(zhì)量濃度比為10:1，羧基石墨稀與單克隆抗體 2的反應(yīng)質(zhì)量濃度比為10:1，羧基石墨烯與多克隆抗體3的反應(yīng)質(zhì)量濃度比為10:1，羧基石 墨烯與多克隆抗體4的反應(yīng)質(zhì)量濃度比為10:1。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中，單克隆抗體1的制備方法如下：
[0030] (i)蛋白聚糖的核心蛋白的羧基端氨基酸序列的表達(dá)基因插入PTRACER真核表達(dá) 載體(購自INVITR0GEN)，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞(購自上海細(xì)胞所），從細(xì)胞培養(yǎng)上清中純化，PBS 稀釋至1.0~2.0mg/mL，制得抗原；
[0031] (i i)將步驟⑴制得的抗原免疫BALB/C小鼠3次，抗原免疫量為50~100yg/次，然 后用PEG法將效價2 2000的小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進行融合，并篩選出陽性克??；
[0032] (ii i)向BALB/C小鼠腹腔中注射弗氏不完全佐劑(購自SIGMA公司），待小鼠腹腔中 產(chǎn)生足量腹水后，于小鼠腹腔中接種步驟(ii)制得的陽性克隆，兩周后抽取腹水，離心取上 清，純化后，制得單克隆抗體1。
[0033]根據(jù)本發(fā)明進一步優(yōu)選的，所述步驟（i)的純化，為用NI-NTA親和層析柱進行純 化。
[0034]根據(jù)本發(fā)明進一步優(yōu)選的，所述步驟(iii)的純化，步驟如下：
[0035]將上清用PBS緩沖液稀釋2.5倍，上蛋白A/G親和層析柱(GE)，分別用含0.5M NaCl 的TRIS-HC1 pH 8.0的緩沖液和含0.5M NaCl的TRIS-HC1 pH 9.0的緩沖液充分洗脫除雜， 最后用1 OOmM三乙胺洗脫回收抗體，收集前三柱體積的洗脫液，并立即用1M的NaH2P〇4中和， 最后用截流分子量為10KD的超濾管脫鹽，并將抗體置換到PBS中，即得。
[0036]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中，單克隆抗體2的制備方法如下：
[0037] (a)蛋白聚糖的核心蛋白的氨基端氨基酸序列的表達(dá)基因插入PTRACER真核表達(dá) 載體，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，從細(xì)胞培養(yǎng)上清中純化，PBS稀釋至1.0~2. Omg/mL，制得抗原； [0038] (b)將步驟(a)制得的抗原免疫BALB/C小鼠3次，抗原免疫量為50~100yg/次，然后 用PEG法將效價2 2000的小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞進行融合，并篩選出陽性克??；
[0039] (c)向BALB/C小鼠腹腔中注射弗氏不完全佐劑，待小鼠腹腔中產(chǎn)生足量腹水后，于 小鼠腹腔中接種步驟(b)制得的陽性克隆，兩周后抽取腹水，離心取上清，純化后，制得單克 隆抗體2。
[0040] 根據(jù)本發(fā)明進一步優(yōu)選的，所述步驟(a)的純化，為用NI-NTA親和層析柱進行純 化。
[0041] 根據(jù)本發(fā)明進一步優(yōu)選的，所述步驟(c)的純化，步驟如下：
[0042]將上清用PBS緩沖液稀釋2.5倍，上蛋白A/G親和層析柱(GE)，分別用含0.5M NaCl 的TRIS-HC1 pH 8.0的緩沖液和含0.5M NaCl的TRIS-HC1 pH 9.0的緩沖液充分洗脫除雜， 最后用1 〇〇mM三乙胺洗脫回收抗體，收集前三柱體積的洗脫液，并立即用1M的NaH2P〇4中和， 最后用截流分子量為10KD的超濾管脫鹽，并將抗體置換到PBS中，即得。
[0043] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中，多克隆抗體3的制備方法如下：
[0044] a、蛋白聚糖的核心蛋白羧基端氨基酸序列的表達(dá)基因插入PTRACER真核表達(dá)載 體，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，從細(xì)胞培養(yǎng)上清中純化，PBS稀釋至1.0~2.0mg/mL，制得抗原；
[0045] b、將步驟a制得的抗原免疫雌性新西蘭大白兔3次，抗原免疫量為200~400yg/次， 然后取血，離心取上清，純化后，制得多克隆抗體3;
[0046] 所述步驟b的純化，步驟如下：
[0047]將上清用PBS緩沖液稀釋2.5倍，上蛋白A/G親