專利名稱：哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶活性的檢測以及哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶的純化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測存在于各種哺乳動(dòng)物組織、細(xì)胞和體液(包括血清以及正常細(xì)胞和組織與癌細(xì)胞和組織)中的哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶活性的分析方法，而且該分析方法可用于測定各種組織和細(xì)胞源的哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶活性，作為診斷工具用于測定轉(zhuǎn)移潛能，并用于開發(fā)乙酰肝素酶活性和轉(zhuǎn)移的特異性抑制劑。
本發(fā)明還涉及純化哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶、尤其是人血小板乙酰肝素酶的方法，并涉及可通過該方法獲得的純化的哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶。純化的哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶(如人血小板乙酰肝素酶)的可用性將會(huì)促進(jìn)開發(fā)哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶活性的抑制劑，抗該酶的單克隆抗體的生產(chǎn)，以及為了最終克隆和表達(dá)該酶的、該酶氨基酸和cDNA序列的鑒定。
血液負(fù)載的惡性腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞侵入組織的重要過程包括它們在血管內(nèi)皮的腔表面的粘附，它們穿過血管內(nèi)皮細(xì)胞層，隨后下面的基底層和胞外基質(zhì)(ECM)被一組分泌性和/或細(xì)胞表面蛋白酶和糖苷酶活性降解(Nakajima等，1983；Schmitt等，1992；Vlodavsky等，1992)。基底層和下層結(jié)締組織基質(zhì)主要包括纖連蛋白、層粘連蛋白、Ⅳ型膠原和玻連蛋白的復(fù)合網(wǎng)絡(luò)，它們中每一種都與埋置于基質(zhì)內(nèi)的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)的硫酸乙酰肝素(HS)側(cè)鏈相互作用(Yurichenco和Schittny,1990)。HS鏈一般包括被低度硫酸化或未硫酸化區(qū)(主要是1→4連接到β-D-葡糖醛酸的N-乙酰葡糖胺的二糖單元)分隔的硫酸二糖單元(主要是1→4連接到α-L-艾杜糖醛酸殘基上的N-硫酸葡糖胺)的聚束(Turnbull和Gallagher,1990,1991)。因此，侵入細(xì)胞產(chǎn)生的內(nèi)切糖苷酶或乙酰肝素酶活性引起的HS鏈切割可能有助于ECM的分解并促進(jìn)細(xì)胞遷移。已證實(shí)乙酰肝素酶活性與鼠的和人的纖維肉瘤細(xì)胞系和黑素瘤細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移潛能有關(guān)(Nakajima等，1983,1986a、b,1988；Ricoveri和Cappelletti,1986)。此外，已描述了一些組織和細(xì)胞類型中的乙酰肝素酶活性，這些組織和細(xì)胞類型包括大鼠肝(Gallagher等，1988；Hook等，1975)，人胎盤(Klein和Von Figura,1979；Lider等，1989)，人血小板(Hoogewerf等，1995；Oldberg等，1980；Oosta等，1982)，培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞(Klein和Von Figura,1976)，人嗜中性粒細(xì)胞(Matzner等，1985,1992)，活化但未靜息的大鼠T-淋巴細(xì)胞(Naparstek等，1984)，正常的和致瘤性鼠B-淋巴細(xì)胞(Laskov等，1991)，人單核細(xì)胞(Sewell等，1989)以及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Bartlett等，1995；Godder等，1991)。因?yàn)镠S的切割似乎對轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞通過基膜很重要，所以乙酰肝素酶抑制劑的研究有可能開發(fā)各種新的和高度選擇性的抗轉(zhuǎn)移藥物和抗炎藥物(Coombe等，1987；Irimura等，1986；Parish等，1990；Vlodavsky等，1992；Willenborg和Parish1988)。
乙酰肝素酶活性被血小板、免疫系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞和循環(huán)細(xì)胞表達(dá)與它們的血細(xì)胞和外滲物中包括它們相關(guān)。研究表明，雖然轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞初始被毛細(xì)管內(nèi)皮截留與血小板無關(guān)，但不久后出現(xiàn)的血小板聚集可導(dǎo)致血小板活化和脫粒，致使間隙形成和內(nèi)皮細(xì)胞收縮，露出下層基膜與腫瘤細(xì)胞粘連(Tanaka等，1986；Crissman等，1985；Yahalom等，1985)。已證實(shí)人血小板包含高水平量的乙酰肝素酶活性，能降解內(nèi)皮細(xì)胞表面、腫瘤衍生的和ECM衍生的HSPG(Bartlett等，1995a,1995b；Castellot等，1982；Hoogewerf等，1995；Wasteson等，1976,1977；Yahalom等，1984；)以及游離的HS和肝素鏈(Graham等，1995a和b；Oldberg等，1980；Oosta等，1982；Wasteson等，1976,1977)。迄今，已報(bào)道了3種不同的哺乳動(dòng)物細(xì)胞乙酰肝素酶活性只切割HS的小鼠黑素瘤B16乙酰肝素酶，既切割肝素也切割HS的人血小板乙酰肝素酶以及據(jù)報(bào)道可切割新合成的肝素前體但不切割肝素或HS的小鼠肥大細(xì)胞瘤內(nèi)切葡糖苷酸酶(Hoogewerf等1995；Nakajima等，1988；Thunberg等，1982)。更近期研究表明，鼠黑素瘤和巨噬細(xì)胞提取物實(shí)際上既能降解HS也能降解肝素，但肝素被降解的程度小于被人血小板提取物降解的程度(Graham和Underwood,1996)。雖然Hennes等(1988)報(bào)道了腫瘤衍生的乙酰肝素酶能降解基質(zhì)HS但不能降解內(nèi)皮細(xì)胞表面HS，不過已證實(shí)人血小板可降解內(nèi)皮細(xì)胞表面HS(Wasteson等，1977)，該內(nèi)皮細(xì)胞表面HS由Gamse等(1978)證實(shí)在結(jié)構(gòu)上與肝素更相似。因此，有可能血小板乙酰肝素酶(它既能降解肝素也能降解HS)在降解病灶粘著斑的細(xì)胞表面HS中起關(guān)鍵作用，并幫助血液負(fù)載的細(xì)胞外滲。
Oldberg等(1980)在部分純化人血小板乙酰肝素酶后，確定了該酶是一種內(nèi)切葡糖苷酸酶，它作用于N-硫酸化含艾杜糖醛酸的肝素生物合成中間體；通過6-柱法將該酶以6％收率純化240,000倍至表觀同質(zhì)性(Oosta等，1982)。該酶是134kDa單亞單位蛋白質(zhì)，它對125I-肝素有活性并被確定為內(nèi)切葡糖苷酸酶。在后續(xù)的研究中，證實(shí)了血小板乙酰肝素酶可切割抑制平滑肌細(xì)胞增殖的內(nèi)皮細(xì)胞表面肝素樣物質(zhì)(Gastellot等，1982)，并可切割GlcA-GlcNS3S之間的抗凝血酶Ⅲ(AT Ⅲ)-結(jié)合八糖(Thunberg等，1982)，可能導(dǎo)致在其降解后肝素抗凝血活性的損失(Oldberg等，1980)。不過，已證實(shí)該純化的酶可作用于八糖底物，也證實(shí)了血小板提取物可降解ECM衍生的HS鏈至10kDa(Yahalom等，1984)片段和5kDa片段(Freeman和Bartlett，未公開的觀察結(jié)果)，表明存在確定該切割位點(diǎn)的專一結(jié)構(gòu)基元。尚未確定血小板乙酰肝素酶作用后的肝素切割產(chǎn)物的尺寸(Graham和Underwood,1996；Oldberg等，1980；Oosta等，1982)。然而，最近Hoogewerf等(1995)報(bào)道了人血小板乙酰肝素酶活性的4100倍純化(8％收率)，在放射標(biāo)記消化產(chǎn)物后證實(shí)該酶是內(nèi)切氨基葡糖苷酶(endoglucosaminidase)，它將肝素和HS二者切割主要成二糖。該活性存在于8～10kDa亞單位CXC趨化因子結(jié)締組織激活肽-Ⅲ(CTAP-Ⅲ)和嗜中性粒細(xì)胞激活肽-2(NAP-2)中，這些肽屬于血小板堿性蛋白族。反之，Graham和Underwood(1996)曾指出人血小板提取物中的乙酰肝素酶活性具有Mr為40～60kDa，并且切割HS和肝素，不過未確定降解產(chǎn)物的尺寸。
如下問題的解決，即報(bào)道的分子尺寸差異(8～134kDa)，底物專一性(該酶是內(nèi)切葡糖苷酸酶活性還是內(nèi)切氨基葡糖苷酶活性)差異，底物切割產(chǎn)物的尺寸(二糖或5～10kDa)差異，要求以高收率純化該酶至同質(zhì)性。雖然報(bào)道了一些有關(guān)該血小板酶的底物專一性的研究(Oldberg等，1980；Oosta等，1882；Thunberg等，1982)，但意外地，除了研究某些修飾的肝素和肝素本身在抑制ECM相關(guān)性HSPG的血小板降解方面的應(yīng)用(Eldor等，1987)之外，關(guān)于硫酸化多糖對該酶的抑制(類似于Nakajima等(1986a和b))對腫瘤細(xì)胞乙酰肝素酶活性抑制的研究)方面報(bào)道得很少。考慮到在腫瘤細(xì)胞外滲的初始階段中血小板的潛在重要作用，這就特別令人感到意外。
為了純化和鑒定哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶活性并篩選和開發(fā)有效的乙酰肝素酶抑制劑，要求對乙酰肝素酶活性進(jìn)行簡單而迅速的分析。然而，以前的乙酰肝素酶分析法在放射性底物的制備和降解產(chǎn)物與未切割底物的分離兩方面既麻煩又費(fèi)時(shí)。通常乙酰肝素酶分析包括ECM相關(guān)性HSPG的生物合成放射性標(biāo)記以及通過從ECM釋放的放射性標(biāo)記物質(zhì)的凝膠過濾分析檢測HS鏈降解(Bartlett等，1995；Vlodavsky等，1992及其中的參考文獻(xiàn))。這種方法的主要缺點(diǎn)是ECM中HS鏈的降解包括了蛋白酶的協(xié)同作用，需要這些蛋白酶使HS鏈面臨后續(xù)的乙酰肝素酶攻擊(Bar-Ner等，1985,1986；Benezra等，1992；Vlodavsky等，1988)。此外，多數(shù)乙酰肝素酶分析要求放射性標(biāo)記的HS(或ECM衍生的HSPG)底物的徹底降解以便通過凝膠過濾將降解產(chǎn)物與底物分離(Bartlett等，1995；Klein和Von Figura,1979；Nakajima等，1986a；Vlodavsky等，1992)，不過單一位點(diǎn)上HS鏈的切割可能正是讓白細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞通過基膜所需要的全部條件。也已開發(fā)了固相乙酰肝素酶分析，其中化學(xué)法和生物合成法放射性標(biāo)記的肝素和HS鏈被連接到固相支持體上，以放射性標(biāo)記物從固相支持體的釋放為酶活性的量度(Nakajima等，1986a；Oosta等，1982；Sewell等，1989)。然而，這類分析方法的缺點(diǎn)在于，固定化底物可能較不易與哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶接觸，而且放射性標(biāo)記的底物通過該底物的還原端與固相支持體的偶合是復(fù)雜而低效的方法。以前的研究也已對肝素和HS兩者通過天然存在的葡糖胺殘基上的碘化(Oosta等，1982)或通過部分脫-N-硫酸化底物的N-乙?；?Nakajima等，1986a)而進(jìn)行放射性標(biāo)記。但是這類方法可能導(dǎo)致掩蔽或產(chǎn)生新的乙酰肝素酶切割位點(diǎn)。
本發(fā)明一方面提供了檢測樣品如哺乳動(dòng)物組織、細(xì)胞或體液中的哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶活性的方法。
按該方面，本發(fā)明提供了檢測樣品中哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶活性的方法，它包括如下步驟(ⅰ)將待測樣品與乙酰肝素酶底物在樣品中的乙酰肝素酶足以降解該乙酰肝素酶底物的條件下接觸一段時(shí)間；(ⅱ)通過把未降解的或部分降解的乙酰肝素酶底物與硫酸乙酰肝素結(jié)合蛋白結(jié)合將降解產(chǎn)物與未降解的或部分降解的乙酰肝素酶底物分離；以及(ⅲ)檢測分離的降解產(chǎn)物以指示樣品中的乙酰肝素酶活性。
在該方面，本發(fā)明還提供了用于檢測樣品中哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶活性的試劑盒，它包括呈區(qū)室化形式的(ⅰ)乙酰肝素酶底物；(ⅱ)硫酸乙酰肝素結(jié)合蛋白；以及(ⅲ)任選地，進(jìn)行如前面廣泛描述的本發(fā)明方法的說明。
本發(fā)明的另一方面提供了迅速純化哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶活性、更確切地說人血小板乙酰肝素酶活性的新方法，以及通過該方法制備的純化了的哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶。
按該方面，本發(fā)明提供了從含乙酰肝素酶的物質(zhì)純化哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶的方法，它包括下列步驟
(ⅰ)在去污劑存在下將含乙酰肝素酶的物質(zhì)與固定化凝集素親和層析基質(zhì)接觸，使乙酰肝素酶活性結(jié)合到所述基質(zhì)上；(ⅱ)從所述基質(zhì)洗脫第一個(gè)含純化的乙酰肝素酶的級分；(ⅲ)任選將所述第一個(gè)含純化的乙酰肝素酶的級分與固定化金屬離子親和層析基質(zhì)接觸；(ⅳ)將所述第一個(gè)含純化的乙酰肝素酶的級分與染料-樹脂基質(zhì)接觸，使乙酰肝素酶活性結(jié)合到所述染料-樹脂基質(zhì)上；以及(ⅴ)從所述染料-樹脂基質(zhì)洗脫第二個(gè)含純化的乙酰肝素酶的級分。
在該方面，本發(fā)明還提供了通過前面廣義描述的方法制備的充分純化的哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶，尤其是充分純化的人血小板乙酰肝素酶，其特征在于通過凝膠過濾層析和通過SDS-PAGE進(jìn)行分析時(shí)它的本征分子質(zhì)量(Mr)約為50kDa，其特征還在于它既降解肝素，也降解硫酸乙酰肝素。通過凝膠過濾分析得出，本發(fā)明充分純化的人血小板乙酰肝素酶將牛肺肝素和豬粘膜肝素從12kDa分別降解至6kDa和4kDa片段，并以逐步方式將豬粘膜硫酸乙酰肝素從22kDa降解至5kDa片段。
前面廣義描述的本發(fā)明的乙酰肝素酶純化方法還可用于純化其它乙酰肝素酶，包括大鼠肝、大鼠13762MAT腺癌細(xì)胞和人HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞乙酰肝素酶。充分純化的MAT和HCT細(xì)胞乙酰肝素酶具有與如上討論的人血小板乙酰肝素酶相似的Mr，而充分純化的大鼠肝素肝素酶的本征Mr約為45kDa，并在SDS-PAGE上43和47kDa之間有3條帶。
在說明書全文中，除非文中另外要求，“包括”這個(gè)詞應(yīng)理解為包含一個(gè)規(guī)定的整體或一組整體，但不排除其它任何整體或一組整體。
本發(fā)明一方面尤其涉及下列物質(zhì)中哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶活性的檢測血清，包括人癌患者的血清，以及各種組織和細(xì)胞勻漿或提取物，包括例如人血小板、結(jié)腸癌細(xì)胞、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和大鼠乳腺癌細(xì)胞(轉(zhuǎn)移和非轉(zhuǎn)移變體)和肝勻漿。本方法可用于測定人和非人(例如大鼠和小鼠)血清、細(xì)胞和組織勻漿或提取物中的乙酰肝素酶活性。
優(yōu)選地，該乙酰肝素酶底物是標(biāo)記的底物，更優(yōu)選是放射性標(biāo)記的底物。該底物優(yōu)選是硫酸乙酰肝素(HS)，特別優(yōu)選的底物是3H-豬粘膜HS和3H-牛腎HS。優(yōu)選地，豬粘膜HS是部分脫-N-乙?；暮屯?H-乙酸酐再-N-乙?；伤璧姆派湫詷?biāo)記底物。
如前面廣義描述的那樣，將待測樣品與乙酰肝素酶底物在足以使樣品中的乙酰肝素酶(如果有的話)降解該底物的條件下接觸一段時(shí)間。合適的溫育時(shí)間和條件無需過度的實(shí)驗(yàn)即可輕易確定。例如，樣品與底物的溫育可在35℃～40℃范圍內(nèi)、優(yōu)選約37℃的溫度下進(jìn)行2～48小時(shí)，優(yōu)選約16小時(shí)，在4.2～7.5范圍內(nèi)的pH下，優(yōu)選約pH5.1。優(yōu)選地，該溫育步驟是在牛血清白蛋白、N-乙酰甘露糖胺和/或去污劑(如Triton X-100)的存在下進(jìn)行的。如下面詳細(xì)所述，在合適的溫育時(shí)間和條件下乙酰肝素酶活性以逐步方式使優(yōu)選的豬粘膜硫酸乙酰肝素底物從22降解至17，然后至8且最后至5kDa片段或降解產(chǎn)物。
降解產(chǎn)物與未降解的或部分降解的乙酰肝素酶底物的分離是通過結(jié)合到硫酸乙酰肝素結(jié)合蛋白上而進(jìn)行的。本文應(yīng)用的術(shù)語“硫酸乙酰肝素結(jié)合蛋白”包括但不限于肝素結(jié)合蛋白。用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的硫酸乙酰肝素結(jié)合蛋白是富含組氨酸的糖蛋白。更優(yōu)選地，該富含組氨酸的糖蛋白(HRG)是雞HRG，但其它HRG(包括人HRG)也可應(yīng)用。然而應(yīng)懂得，本發(fā)明推廣到除HRG之外的其它硫酸乙酰肝素結(jié)合蛋白和肝素結(jié)合蛋白的應(yīng)用，包括例如蛋白酶抑制劑，如抗凝血酶111和肝素輔因子11；血漿脂蛋白如載脂蛋白B-100和載脂蛋白E；生長因子，如酸性和堿性成纖維細(xì)胞生長因子，血管內(nèi)皮生長因子，肝細(xì)胞生長因子和血小板衍生的生長因子；胞外基質(zhì)蛋白如層粘連蛋白，膠原和彈性蛋白；酶如脂蛋白裂合酶，超氧化物歧化酶，組織蛋白酶G，彈性蛋白酶和細(xì)菌肝素裂合酶1、11和111；以及其它合適的結(jié)合蛋白如血小板因子4，病毒胞吞因子(von willebrand factor)，和β-血小板球蛋白。本發(fā)明還推廣到源于這些硫酸乙酰肝素結(jié)合蛋白或肝素結(jié)合蛋白(特別是HRG)的肽，它們包含硫酸乙酰肝素結(jié)合區(qū)或肝素結(jié)合區(qū)。
優(yōu)選地，是通過結(jié)合到固定化硫酸乙酰肝素結(jié)合蛋白上而進(jìn)行分離的。任何合適的固定化方法都可應(yīng)用，但現(xiàn)在優(yōu)選通過結(jié)合到瓊脂糖珠、更優(yōu)選為Sepharose珠上而固定化HRG或其它合適的結(jié)合蛋白。在該優(yōu)選的方面，可將HRG-Sepharose珠裝入柱中，施加溫育混合物并洗過該柱以結(jié)合未降解的或部分降解的乙酰肝素酶底物，使降解產(chǎn)物未結(jié)合或低效結(jié)合到HRG-Sepharose珠上。也可將HRG或其它合適的結(jié)合蛋白加到溫育混合物中以結(jié)合未降解的或部分降解的乙酰肝素酶底物復(fù)合體，然后可以例如通過在底物(如Immobilon或StrataClean)上的固定化而分離該復(fù)合體，在例如通過離心或過濾除去該固定化復(fù)合體之后將降解的乙酰肝素酶底物片段留在溫育混合物中。
在本發(fā)明該方面的方法的最后步驟中，檢測分離的降解產(chǎn)物以指示試驗(yàn)樣品中乙酰肝素酶活性的存在。該檢測步驟可包括降解產(chǎn)物的定量和/或定性檢測。若應(yīng)用放射性標(biāo)記的乙酰肝素酶底物如3H-豬粘膜HS，則檢測步驟可包括未結(jié)合的降解產(chǎn)物放射性量的檢測。
本發(fā)明在該方面提供了從乙酰肝素酶底物分離降解產(chǎn)物的新方法，它利用了切割的乙酰肝素酶降解產(chǎn)物對硫酸乙酰肝素結(jié)合蛋白如HRG、尤其是雞的富含組氨酸的糖蛋白(cHRG)的降低的親和性。將溫育混合物施加到cHRG-Sepharose柱上，未結(jié)合的物質(zhì)對應(yīng)于乙酰肝素酶降解產(chǎn)物。已對各種人、大鼠和小鼠細(xì)胞和組織勻漿測定了乙酰肝素酶活性。例如，高度轉(zhuǎn)移的大鼠乳腺癌和鼠黑素瘤細(xì)胞系的乙酰肝素酶活性是非轉(zhuǎn)移變體的4～10倍，證實(shí)乙酰肝素酶活性與轉(zhuǎn)移潛能的關(guān)系。人癌患者的血清乙酰肝素酶量是正常健康成人的2倍。
本發(fā)明該方面提供了用于檢測哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶對天然放射性標(biāo)記底物的活性的新型、簡單而迅速的定量分析法，它能檢測活體內(nèi)可能發(fā)生的HS鏈切割的最小量，而且它基于新的原理，即在鏈切割之后HS鏈上蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的減少。該分析中，利用初步觀測，即HS結(jié)合血漿蛋白HRG掩蔽HS鏈上乙酰肝素酶切割位點(diǎn)。在乙酰肝素酶消化后，與殘余的完整底物和部分降解的底物不一樣，放射性標(biāo)記的HS片段(產(chǎn)物)未被HRG-偶合的Sepharose珠的微型柱結(jié)合，使得迅速將切割的產(chǎn)物與底物分離。
本發(fā)明該方面的分析法與常規(guī)分析法相比具有如下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)(a)容易制備較大量的放射性標(biāo)記天然底物同時(shí)保持其天然結(jié)構(gòu)，(b)可迅速并同時(shí)測定大量樣品以及(c)可通過檢測底物的單一位點(diǎn)切割而準(zhǔn)確量化乙酰肝素酶活性。
本發(fā)明另一方面涉及從含乙酰肝素酶的物質(zhì)純化哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶。用作本發(fā)明方法中起始原料的含乙酰肝素酶的物質(zhì)可以是任意來源的哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶活性，例如人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞，大鼠乳腺癌13762MAT細(xì)胞，或大鼠肝組織。不過，本發(fā)明尤其涉及人血小板乙酰肝素酶的純化，該物質(zhì)的便利來源是通過從冷凍、洗滌后的人血小板勻漿中溶解酶活性得到的。
在去污劑(如Triton X-100)存在下，將含乙酰肝素酶的物質(zhì)進(jìn)行固定化凝集素親和層析，優(yōu)選為伴刀豆球蛋白A-Sepharose層析，使乙酰肝素酶活性結(jié)合到層析柱上。洗脫結(jié)合的乙酰肝素酶活性而提供第一個(gè)含純化的乙酰肝素酶的級分。
任選且優(yōu)選地，再將第一個(gè)含純化的乙酰肝素酶的級分進(jìn)行固定化金屬離子親和層析(IMAC)，優(yōu)選應(yīng)用一種基質(zhì)如Zn2+-螯合Sepharose，它不結(jié)合乙酰肝素酶活性，但它除去其它污染蛋白質(zhì)。再將第一個(gè)含純化的乙酰肝素酶的級分進(jìn)行染料-樹脂層析，優(yōu)選順次用IMAC基質(zhì)，以再次結(jié)合乙酰肝素酶活性。合適的染料-樹脂基質(zhì)包括Blue-A瓊脂糖基質(zhì)，不過，也可應(yīng)用其它染料如Reactive Red以及其它基質(zhì)載體如Sepharose和丙烯酰胺。從染料-樹脂基質(zhì)洗脫第二個(gè)含純化的乙酰肝素酶的級分后，可接著進(jìn)行辛基瓊脂糖層析，它再次結(jié)合污染蛋白質(zhì)但不結(jié)合乙酰肝素酶活性。
第二個(gè)含純化的乙酰肝素酶的級分的最后純化可通過凝膠過濾層析法(例如Superose12層析)進(jìn)行，任選接著濃縮該純化了的酶。
如前所述，按本發(fā)明該方面得到的產(chǎn)物是充分純化的哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶，尤其是充分純化的人血小板乙酰肝素酶。用于本說明書中的術(shù)語“充分純化的”表示已接受純化處理的產(chǎn)物，乙酰肝素酶活性是含乙酰肝素酶原料活性的至少1000倍，優(yōu)選至少1500倍。
還優(yōu)選地，該充分純化的哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶是均勻的，并且相對于在其天然形式中通常與之有關(guān)的其它蛋白質(zhì)來說，它優(yōu)選含至少75wt％、更優(yōu)選至少85wt％、最優(yōu)選至少95-99wt％乙酰肝素酶。
按本發(fā)明該方面，人血小板乙酰肝素酶已從預(yù)先冷凍、洗滌過的血小板被純化至均一。已證實(shí)，與轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞和其它種類細(xì)胞相比，當(dāng)以活性/mg蛋白質(zhì)表示時(shí)，人血小板含很高量的乙酰肝素酶活性。
在本發(fā)明方法該方面的一個(gè)實(shí)施方案(下面的實(shí)施例中詳細(xì)描述了)中，人血小板乙酰肝素酶已通過5柱處理而被純化1500倍至均一(收率為19％)，這5個(gè)柱包括伴刀豆球蛋白A-Sepharose、Zn2+-螯合-Sepharose、Blue A-瓊脂糖、辛基瓊脂糖和凝膠過濾層析。該同樣純化處理可用于純化其它哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶活性，例如從人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞、大鼠乳腺癌13762MAT細(xì)胞以及從大鼠肝純化。既可降解肝素又可降解HS的人血小板乙酰肝素酶，通過凝膠過濾層析和通過SDS-PAGE進(jìn)行分析時(shí)的本征分子質(zhì)量為50kDa。通過凝膠過濾分析得知，該酶使豬粘膜HS以逐步方式從22kDa降解至17、10和最后5kDa片段，使牛肺和豬粘膜肝素從12kDa分別降解至6和4kDa片段。
從下述實(shí)施例和附圖的詳細(xì)描述將會(huì)更詳細(xì)地理解本發(fā)明，這些實(shí)施例和附圖是為了闡述而不是限制本發(fā)明。
圖中

圖1作為溫育pH的函數(shù)的HS降解。37℃和pH4.2(○)、5.1(□)、6.5(△)和7.5(▲)下將HS與大鼠13762MAT勻漿以及不存在添加的酶時(shí)在pH5.1(■)下將HS溫育16h。通過Superose-6凝膠過濾層析將該溫育混合物分級分離。示出的Mr標(biāo)準(zhǔn)物是a)16.7,b)10.6,c)6.7,d)3.1和e)0.2kDa。至于全部細(xì)節(jié)，見方法部分。
圖2作為溫育時(shí)間的函數(shù)的HS降解。在37℃和pH5.1下將HS與大鼠13762MAT勻漿溫育達(dá)2(△)、4(▲)和16hr(□)以及不存在添加的酶時(shí)將HS溫育4hr(■)。通過Superose6凝膠過濾層析將該溫育混合物分級分離。Mr標(biāo)準(zhǔn)物a-e如圖1中所述。至于全部細(xì)節(jié)，見方法部分。
圖3通過轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性大鼠乳腺癌細(xì)胞系勻漿來降解HS。在37℃和pH5.1下將HS分別與下列物質(zhì)一起溫育16h沒有酶(■)，非轉(zhuǎn)移性變體DMBA-Sask(□)和13762MAT(J-克隆)(▲)的勻漿，以及為方便起見一起示出高度轉(zhuǎn)移性13762 MAT和DMBA-8A細(xì)胞系(△)的勻漿。通過Superose6凝膠過濾層析將溫育混合物分級分離。Mr標(biāo)準(zhǔn)物a-e如圖1中所述。至于全部細(xì)節(jié)，見方法部分。
圖4:HS的降解作為溫育時(shí)間和消化的HS產(chǎn)物對cHRG-Sepharose的親和性的函數(shù)。在37℃和pH5.1下將HS溫育2(□)、4(△)和16hr(▲)以及不存在添加的酶時(shí)將HS溫育4hr(■)。將溫育混合物加到PBS中的cHRG-Sepharose柱中，用PBS洗滌并通過NaCl-梯度洗脫。箭頭表示NaCl梯度的起始。一，NaCl的濃度。至于全部細(xì)節(jié)，見方法部分。
圖5:cHRG對HS降解的抑制。將HS在pH5.1和37℃下以及分別在下列條件下溫育8h不存在添加的酶或cHRG時(shí)(■)，存在(△)和不存在(▲)3∶1(cHRG∶HS)摩爾比的cHRG時(shí)與大鼠13762MAT細(xì)胞勻漿。通過Superose6凝膠過濾層析將溫育混合物分級分離。Mr標(biāo)準(zhǔn)物a-e如圖1中所述。至于全部細(xì)節(jié)，見方法部分。
圖6作為溫育時(shí)間的函數(shù)的HS降解。在pH5.1和37℃下將HS與大鼠13762MAT勻漿溫育達(dá)2(□)、4(▲)、6(△)、8(●)和10hr(○)，以及不存在添加的酶時(shí)將HS溫育4hr(■)。通過A)Sepharose6凝膠過濾層析和B)結(jié)合到cHRG-Sepharose柱上將溫育混合物分開和分級分離，此時(shí)在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上測定未結(jié)合的級分。Mr標(biāo)準(zhǔn)物a-e如圖1中所述。至于全部細(xì)節(jié)，見方法部分。
圖7人血小板乙酰肝素酶的Superose12層析。如方法部分中所述，將步驟4的血小板乙酰肝素酶通過凝膠過濾法純化。對各級分分析乙酰肝素酶活性(○)并監(jiān)測蛋白質(zhì)(-A280)。箭頭1和2分別指示牛血清白蛋白和卵清蛋白的Ve。
圖8純化的人血小板乙酰肝素酶的SDS-PAGE。用二硫赤蘚糖醇還原步驟5純化的血小板乙酰肝素酶，再將它在10％聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳處理。至于實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，見方法部分。泳道1,Mr標(biāo)準(zhǔn)物；泳道2，步驟5的乙酰肝素酶。
實(shí)施例1應(yīng)用的縮寫bFGF，堿性成纖維細(xì)胞生長因子；BSA，牛血清白蛋白；cHRG，雞富含組氨酸的糖蛋白；CNBr，溴化氰；CR-HS，羧基還原的硫酸乙酰肝素；ECM，胞外基質(zhì)；GlcA，葡糖醛酸；GlcNAc,N-乙?；咸前?；GlcNS,N-硫酸化葡糖胺；GlcNS3S,N,3-二硫酸葡糖胺；hHRG，人富含組氨酸的糖蛋白；HRG，富含組氨酸的糖蛋白；HS，硫酸乙酰肝素；HSPG，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖；HUVEC，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；IdoA2S,2-硫酸艾杜糖醛酸；NAM,N-乙酰甘露糖胺；PBS，磷酸鹽緩沖鹽水。
Ⅰ-原料肝素衍生的16.7、10.6、6.7和3.1kDa的分子質(zhì)量(Mr平均)標(biāo)準(zhǔn)物是Nova Nordisk(Gentofte，丹麥)慷慨贈(zèng)送的(見Kristensen等，1991)。豬粘膜HS(ORG553)是Organon Int.Bv.(Oss，荷蘭)慷慨贈(zèng)送的。Pharmaeia Fine Chemicals(Uppsala，瑞典)提供了PD-10柱、DEAE-Sepharose和溴化氰活化的Sepharose4B。Sigma Chemical Co.(St Louis,MO)提供了結(jié)晶牛血清白蛋白、牛肺肝素、軟骨素ABC-裂合酶、水合肼和硫酸肼。3H-乙酸酐(500mCi/mmol)的甲苯溶液得自Amersham International(悉尼，澳大利亞)。Beckmann(Gladesville，澳大利亞)提供了Ready Safe閃爍液。Dowex AG50W-X8(100-200目；H+形式)得自Bio-RadLaboratories(Richmond，加拿大)。
按以前描述的方法培養(yǎng)和收獲如下細(xì)胞系轉(zhuǎn)移性人結(jié)腸癌HCT116(Schlechte等，1989)和KM12SM(Morikawa等，1988)；轉(zhuǎn)移性鼠黑素瘤B16-F10，高度轉(zhuǎn)移性的13762MAT和DMBA-8A大鼠乳腺癌，以及它們的非轉(zhuǎn)移性變體J-克隆和DMBA-Sask(Parish等，1992)；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞系U937(Bartlett等，1995)；人平滑肌，人肺成纖維細(xì)胞和人角質(zhì)形成細(xì)胞系(KJD)。人血小板是通過Bartlett等(1995)的方法獲得的。鼠Lewis肺癌細(xì)胞系(轉(zhuǎn)移性(D122)和非轉(zhuǎn)移性(LLC)變體)以及鼠肺癌細(xì)胞系(轉(zhuǎn)移性(A3a)和非轉(zhuǎn)移性(SP1)變體)分別是Samuel Lunenfeld Research Institute,Mount Sinai Hospital,Toronto(加拿大)的James W.Dennis博士和Department ofImmunology,The Weizmann Institute of Science,Rehovot(以色列)的Lea Eisenbach博士慷慨贈(zèng)送的。這些細(xì)胞系的冷凍(-80℃)細(xì)胞粒狀沉淀是由Peter MacCallum Cancer Institute,Melbourne(澳大利亞)的Robin Anderson博士提供的。細(xì)胞勻漿是這樣制備的，即將106個(gè)細(xì)胞或108個(gè)血小板(預(yù)先用生理鹽水洗滌過)懸浮于0.2ml 0.1％(v∶v)Triton X-100水溶液，再通過在固態(tài)CO2/乙醇混合物中凍融三次使之破裂。
應(yīng)用polytron勻漿器在含0.5M NaCl的3體積(w∶v)15mM-戊二酸二甲酯緩沖液(pH6.0)中勻化從10周齡的Fischer F344大鼠新切下的肝。人癌患者的血清以及致瘤性肺組織和相鄰的正常肺組織以冷凍(-80℃)形式得自the Royal North Shore Hospital，悉尼(澳大利亞)。將該組織融化后按上述方法勻化。將得自癌患者和健康志愿者的冷凍血清融化后對4℃下的生理鹽水透析16h。通過Bio-RadCoomassie蛋白質(zhì)分析試劑盒(Bio-Rad Laborato ries,Richmond,CA)應(yīng)用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)物估測蛋白質(zhì)濃度。
Ⅱ-方法放射性標(biāo)記的硫酸乙酰肝素將粗制的豬腸粘膜硫酸乙酰肝素ORG553(100mg)溶于2ml H2O，在4℃下的透析袋中對2l生理鹽水透析4h，并對2lH2O透析16h，透析袋的截?cái)嘀禐?0kDa。將透析液與含0.1mg/ml BSA和2單位軟骨素ABC-裂合酶的2ml 0.1MTris·HCl(pH8.0)混合，在37℃下溫育16h。在4℃下對21PBS透析16h后，將溶液加到用PBS平衡過的DEAE-Sepharose柱(1.0×6.0cm)上。先后用各為12ml的PBS和0.3M NaCl洗滌該柱，再用10ml 2M NaCl洗脫，接著凍干。將固體溶于最少量的H2O，應(yīng)用Pharmacia PD-10柱使之脫鹽。將先于NaCl出現(xiàn)的洗脫液(通過添加一滴20％硝酸銀溶液檢測)凍干得33mg純化的硫酸乙酰肝素。
將純化的硫酸乙酰肝素(26mg)溶于含硫酸肼(20mg)的水合肼(1ml)中，再將混合物于具塞玻璃小瓶中在100℃下加熱2h。使該混合物冷卻后在氮?dú)饬髦懈稍?。添加甲?1ml)，干燥該混合物，將該操作再重復(fù)兩次。將殘余物溶于2ml 1M NaCl，在PD-10柱上脫鹽，使脫鹽后的物質(zhì)通過Dowex 50X-8(Na+形式)柱(1.0×6.0cm)，該柱用10ml H2O洗滌。將流過的溶液和洗滌液合并后冷凍干燥得19mg部分地脫-N-乙?；牧蛩嵋阴８嗡亍?br> 將脫-N-乙?；牧蛩嵋阴８嗡?19mg)溶于含10％(v∶v)甲醇的1ml 0.5M NaHCO3中，在冰浴中冷卻至0℃，添加0.1ml3H-乙酸酐(5mCi,500mCi/mmol)的甲苯溶液，在0℃下劇烈攪拌該混合物3h。進(jìn)一步添加0.05ml甲醇、0.1ml Na2CO3和0.05ml乙酸酐，在0℃下攪拌30分鐘。再重復(fù)該操作兩次，檢查將pH保持堿性，然后用乙酸酸化該混合物至pH4.0。當(dāng)該混合物被暖至22℃后，在氮?dú)饬髦谐ゼ妆?，在PD-10柱上使該溶液脫鹽，所述柱在10％(v∶v)乙醇水溶液中平衡和展開過。在3H-乙酸鹽峰之前出現(xiàn)的放射性物質(zhì)被凍干得21mg放射性標(biāo)記的硫酸乙酰肝素，將它以2mg/ml的濃度溶于10％(v∶v)乙醇水溶液，在-20℃下貯存。
富含組氨酸的糖蛋白-Sepharose通過磷酸纖維素離子交換層析法(Rylatt等，1981)從雞血漿制備雞富含組氨酸的糖蛋白(cHRG)。通過SDS-PAGE展示該制劑的純度，此處檢測到分子質(zhì)量為135kDa的單一考馬斯藍(lán)(Coomassie Blue)染色的帶。將該物質(zhì)濃縮至蛋白質(zhì)濃度為2mg/ml，對PBS透析后在-20℃下貯存?zhèn)溆谩?br> 將牛肺肝素(50mg)溶于10ml含10％(v∶v)甲醇的0.5MNaHCO3，冷卻至4℃，再以5分鐘間隔添加5等份0.04ml乙酸酐。用1M Na2CO3將pH保持在8.0以上。進(jìn)一步攪拌該混合物30分鐘，然后在4℃下將該乙?；嗡貙?l含0.15M NaCl的1M NaHCO3(偶聯(lián)緩沖液)透析16h。
將cHRG(10mg)在4℃下對2l偶聯(lián)緩沖液透析16h，再在4℃下與上面制備的乙酰化肝素溶液混合30分鐘，以防cHRG的HS-結(jié)合位點(diǎn)偶聯(lián)到Sepharose珠上。使溴化氰(CNBr)活化的Sepharose4B(2g)在50ml 1mM HCl中溶脹30分鐘，在真空下的燒結(jié)漏斗中用150ml 1mM HCl洗滌，再用20ml偶聯(lián)緩沖液洗滌。立即將洗滌過的CNBr-Sepharose加到肝素-cHRG溶液中，并在4℃下輕輕地混合24h。添加4ml 2M乙醇胺的偶聯(lián)緩沖液溶液(用1M HCl調(diào)節(jié)至pH8.0)，再輕輕地混合16h。將該漿液傾入色譜柱(1.5×5.0cm)，在4℃下依次用各50ml的偶聯(lián)緩沖液、含2M NaCl的0.05M Tris-HCl緩沖液(pH8.0)和最后用PBS洗滌。在4℃下將cHRG-Sepharose于PBS中貯存。偶聯(lián)形成濃度為每ml珠粒結(jié)合0.8mg蛋白質(zhì)，它分別結(jié)合6.2nmol和3.1nmol放射性標(biāo)記的肺肝素和HS。
乙酰肝素酶分析將cHRG-Sepharose珠(0.2ml柱床)置于一次性1ml填充玻璃棉的注射器中，再將該微型柱置于放在冰斗內(nèi)靜置的10ml離心管中。在應(yīng)用前用1ml PBS預(yù)洗滌這些柱。所有的柱操作都是在冰上進(jìn)行的。
要分析乙酰肝素酶活性，將多達(dá)2μl的樣品加入溫育混合物，該混合物包括于0.05M乙酸鈉緩沖液(pH5.1)中的90pmol放射性標(biāo)記的HS，其中含5mM N-乙酰甘露糖胺和0.1mg/ml BSA，總體積為20μl，再在37℃下溫育適當(dāng)時(shí)間。通過冷凍這些管而終止反應(yīng)，添加0.3ml冷的PBS，必要的話在4℃下離心該溶液，將0.1ml樣品加到預(yù)先在PBS中平衡過的cHRG-Sepharose微型柱上。用0.7ml PBS洗滌該柱，將洗滌液和流過物質(zhì)轉(zhuǎn)至閃爍小瓶，添加10ml閃爍液，測定放射性。酶活性以每小時(shí)每mg蛋白質(zhì)或106個(gè)細(xì)胞或每ml血清形成產(chǎn)物的pmol數(shù)表示。通過添加1ml含2M NaCl的0.05M Tris-HCl緩沖液(pH7.5)再生該cHRG-Sepharose柱，再用PBS平衡。
還通過溫育混合物在Superose6 HR 10/30柱(Pharmacia LKBBiotechnology,Uppsala，瑞典)上的凝膠過濾層析法檢測乙酰肝素酶活性，在PBS中平衡后接著展開。在0.25ml/分的流速下操作該P(yáng)harmacia FPLC體系，直接將0.5ml的各級分收集入閃爍小瓶，往其中加入3ml閃爍液，測定放射性。用3H-N-乙酰葡糖胺(221Da)、牛肺肝素(12.5kDa)和肝素衍生的Mr平均標(biāo)準(zhǔn)物(16.7、10.6、6.7和3.1kDa)校正該柱，如前述關(guān)于放射性標(biāo)記HS的制備那樣，先使這些物質(zhì)部分地脫-N-乙酰化和用3H-乙酸酐再-N-乙?；＿€通過上述方法制備放射性標(biāo)記的6-硫酸軟骨素和羧基還原的HS(通過Karamanos等(1988)的方法制備)。
HS與cHRG-Sepharose的結(jié)合將200μlPBS中的樣品加到4℃下在PBS中平衡過的cHRG-Sepharose微型柱(0.5×4.0cm)上。用2ml PBS洗滌該柱，用PBS和含1.2M NaCl的10mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)的線性梯度(2×10mls)洗脫，在0.5ml/分下展開，將0.5ml的各級分直接收集入閃爍小瓶，往其中加入4ml閃爍液，測定放射性。將這些柱在PBS中重新平衡后供進(jìn)一步應(yīng)用。
Ⅲ-結(jié)果和討論放射性標(biāo)記的乙酰肝素酶底物的制備。
以前有關(guān)乙酰肝素酶對肝素或HS的活性的研究已應(yīng)用了連接試劑以允許放射性碘化(Oosta等，1982)，它能掩蔽潛在的切割位點(diǎn)，或者原先脫-N-硫酸化HS的乙酰化或肝素與放射性標(biāo)記的乙酸酐的乙?；?Nakajima等，1986a)。但是，如報(bào)道的那樣，后一種方法既影響底物的表觀Mr，又影響肝素中產(chǎn)生的乙酰肝素酶易感性鍵合，以前已證實(shí)它抗鼠B16黑素瘤乙酰肝素酶活性(Nakajima等，1986a)。為保障產(chǎn)生放射性標(biāo)記的、生物活性的天然底物以測定各種生物樣品中的乙酰肝素酶活性，將純化的豬粘膜HS部分地脫-N-乙?；陀?H-乙酸酐再-N-乙?；帘然钚詾?650～2000cpm/pmol，它高達(dá)以前報(bào)道的14C標(biāo)記HS(Nakajima等，1986a)的100倍。該標(biāo)記處理的主要優(yōu)點(diǎn)在于，未在底物中引入新的或改變了的切割位點(diǎn)。將該底物在-20℃下貯存于10％(v∶v)乙醇水溶液中，該底物能穩(wěn)定一年，即使反復(fù)冷凍和融化也不產(chǎn)生可測量到的降解產(chǎn)物。以前由Hahnenberger等(1993)分離的豬粘膜HS已被證實(shí)其平均Mr為22kDa，它含dp2～16的類肝素酶抗性糖類，富含介導(dǎo)bFGF活性的IdoA2S-GlcNS序列(Walker等，1994)。它還包含dp6～14-16的伸展亞硝酸抗性(含GlcNAc的)序列(J.E.Turnbull，未發(fā)表的觀察值)，因此包含HS物質(zhì)典型的硫酸化和非硫酸化交替區(qū)。乙酰肝素酶消化HS底物的分析。
在可以開發(fā)出新的乙酰肝素酶分析法之前，關(guān)鍵是要應(yīng)用常規(guī)凝膠過濾來分離和鑒定降解產(chǎn)物以證實(shí)放射性標(biāo)記的HS是一種合適的底物。確定用于該研究中的乙酰肝素酶的降解性能也很重要。應(yīng)用高度侵襲性大鼠乳腺癌13762MAT和人血小板勻漿來估測乙酰肝素酶對放射性標(biāo)記底物的降解，因?yàn)橐郧耙炎C實(shí)該腫瘤和血小板衍生的酶具有不同的底物特異性，要么只降解HS，要么既降解肝素又降解HS(Nakajima等，1988)。為防止后續(xù)的乙酰肝素酶降解產(chǎn)物的胞外酶降解，將5mMN-乙酰甘露糖胺(NAM)加入溫育混合物以抑制在α-N-乙酰氨基葡糖苷酶活性之后釋放3H-標(biāo)記的N-乙酰葡糖胺殘基(Hopwood和Elliott,1982)。
在37℃下，在NAM存在下將HS與13762MAT細(xì)胞勻漿在pH4.2、5.1、6.5和7.5下溫育16h，通過凝膠滲透層析法分析反應(yīng)混合物(圖1)。將乙酰肝素酶衍生的產(chǎn)物的尺寸與一系列放射性標(biāo)記的肝素衍生的Mr標(biāo)準(zhǔn)物對比。HS在pH5.1下被最大程度地降解至表觀Mr為5kDa的片段，對比分別在pH6.5和7.5下表觀Mr為8和16kDa。pH4.2下的降解速度低于pH6.5下的降解速度，更不明顯的逐步分解至產(chǎn)物。延長HS與13762MAT細(xì)胞勻漿的溫育時(shí)間至40h，再次導(dǎo)致在pH6.5和7.5下的不完全降解(未示出數(shù)據(jù))。為測定在更高pH值下是否存在不同的酶活性或者是否產(chǎn)生了不同的切割位點(diǎn)，在16h溫育后，收集在pH5.1、6.5和7.5下降解的各產(chǎn)物，脫鹽后在pH5.1或6.5下與新鮮的勻漿進(jìn)一步溫育16h。各情況下，各測試片段都被降解至5kDa的最小尺寸(未示出數(shù)據(jù))。將乙酰肝素酶消化的5kD產(chǎn)物加到DEAE-Sepharose上導(dǎo)致即使存在0.3M NaCl時(shí)也保持結(jié)合所有的放射性，表明乙酰肝素酶消化產(chǎn)生的所有HS片段都包含高度硫酸化的HS域。
13762MAT細(xì)胞勻漿與HS在pH5.1下的時(shí)程溫育達(dá)2、4和16h再次證明了HS明顯的逐步降解(圖2)，伴隨3次明顯的切割，即從22至16至8和最后至5kDa。在pH5.1、6.5或7.5下溫育16h后未檢測到對6-硫酸軟骨素或者對羧基還原的HS(CR-HS)的活性(未示出結(jié)果)。人血小板勻漿乙酰肝素酶活性同樣未作用于CR-HS但消化HS至5kDa的片段，通過DEAE-Sepharose將這些片段保持在0.3M NaCl中。各種細(xì)胞系(包括高度轉(zhuǎn)移性人結(jié)腸癌HCT116和KM12-SM系、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)、小鼠黑素瘤B16-F10細(xì)胞)的勻漿和大鼠肝提取物，都通過凝膠過濾分析證實(shí)在16h溫育期間能將HS水解成17、8和最后5kDa的片段(未示出結(jié)果)，表明各細(xì)胞系中的乙酰肝素酶活性都將HS切割成相似尺寸的產(chǎn)物。以前還證實(shí)了人血小板、HUVEC、淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和白細(xì)胞乙酰肝素酶對牛內(nèi)皮ECM結(jié)合的HSPG的活性導(dǎo)致形成相似尺寸的HS消化終產(chǎn)物(Vlodavsky等，1992)。
高度轉(zhuǎn)移性大鼠13762MAT和DMBA-8A細(xì)胞系以及非轉(zhuǎn)移性變體J-克隆和DMBA-Sask的提取物與HS溫育導(dǎo)致HS被13762MAT和DMBA-8A乙酰肝素酶活性完全降解至5kDa片段，而J-克隆和DMBA-Sask提取物只部分地降解HS至分別為8和17kDa的表觀Mr的片段(圖3)。以前在基膜滲透性分析中已證實(shí)，高度轉(zhuǎn)移性13762MAT和DMBA-8A細(xì)胞系降解人造基膜Matrigel的效能比J-克隆和DMBA-Sask變體更大(Parish等，1992)，于是證實(shí)了轉(zhuǎn)移潛能與乙酰肝素酶活性的關(guān)系(Nakajima等，1983)。
因此，建議將豬粘膜HS作為合適的天然底物用于檢測各種細(xì)胞、血小板和組織提取物中的乙酰肝素酶活性，并用于估測腫瘤細(xì)胞系的乙酰肝素酶含量和轉(zhuǎn)移潛能。但是，由于切割位點(diǎn)的多重性，應(yīng)用凝膠過濾作為將產(chǎn)物與未消化底物分離的方法使得難于準(zhǔn)確地量化乙酰肝素酶活性，尤其是因?yàn)橐螽a(chǎn)生多重切割以便將底物與產(chǎn)物分離。此外，不知道相對速度或每次切割是否相似，或者消化的初始產(chǎn)物是否可通過產(chǎn)物抑制作用而抑制進(jìn)一步的切割，這就導(dǎo)致該分析法關(guān)于時(shí)間缺乏線性，大多數(shù)有關(guān)HS降解體外活性研究中已觀察到該情況(Freeman和Hopwood,1986,1987,1989a,1989b)。結(jié)合通過凝膠過濾分析法分析單個(gè)樣品所需的時(shí)間和人力考慮，乙酰肝素酶活性的量化方法的缺乏特別需要一種能檢測最少數(shù)目的底物切割的迅速、定量分析乙酰肝素酶的方法。乙酰肝素酶定量分析法的開發(fā)HS結(jié)合蛋白和肝素結(jié)合蛋白(例如抗凝血酶Ⅲ、酸性和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、血小板因子4、β-血小板球蛋白和富含組氨酸的糖蛋白(HRG))與HS的相互作用已有很好的文獻(xiàn)記載(Jackson等，1991)，以及最近的研究以試圖弄清楚在化學(xué)的(主要是亞硝酸降解)或細(xì)菌乙酰肝素酶和類肝素酶消化后它們在HS分子上的結(jié)合基元(Turnbull和Gallagher,1990,1991；Turnbull等，1992；Walker等，1994)。但是，除了證實(shí)哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶能從ECM釋放活性bFGF(Ishai-Michaeli等，1990)之外，關(guān)于哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶降解后HS結(jié)合蛋白與HS之間的相互作用方面的研究報(bào)道得很少。
在研究雞HRG(cHRG)(一種豐富的血漿衍生的HS結(jié)合蛋白)與HS的相互作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)不但cHRG掩蔽了HS鏈上的哺乳動(dòng)物MAT細(xì)胞乙酰肝素酶切割位點(diǎn)，而且在乙酰肝素酶切割HS之后，HS上的cHRG結(jié)合基元也損失了。因此，在乙酰肝素酶消化之后，切割了的HS片段與cHRG-偶聯(lián)Sepharose珠低效地結(jié)合，使得可開發(fā)將HS底物與乙酰肝素酶消化產(chǎn)物分離的有效而新型的方法。
當(dāng)將HS加到cHRG-Sepharose柱上，再在pH7.2下用鹽梯度洗脫時(shí)，與0.6M NaCl洗脫的肺肝素(未示出結(jié)果)相比，0.27M NaCl洗脫的是較弱結(jié)合的HS(圖4)。然而，HS被13762MAT細(xì)胞勻漿完全消化后形成的5kDa片段未結(jié)合到cHRG-Sepharose上。然后應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)分析法在pH5.1下由13762MAT細(xì)胞乙酰肝素酶降解HS達(dá)2、4和16h時(shí)，將分析混合物分成3組，通過凝膠過濾層析法、結(jié)合到DEAE-Sepharose和結(jié)合到cHRG-Sepharose上進(jìn)行分析。凝膠過濾分析得出與圖1相似的曲線圖，產(chǎn)物分別在17、8和5kDa。該分析混合物的施加，以及隨后放射性標(biāo)記的HS產(chǎn)物通過鹽梯度從cHRG-Sepharose柱洗脫，證實(shí)了通過凝膠過濾分析得出的HS片段表觀Mr的降低與未結(jié)合在cHRG-Sepharose上的物質(zhì)的增多有關(guān)(圖4)，表明了在乙酰肝素酶消化之后HS上的HRG結(jié)合基元損失了。溫育期后結(jié)合的HS片段對cHRG-Sepharose柱的親和性沒有明顯變化。HS與cHRG-Sepharose的結(jié)合(以及凝膠過濾分析中HS的表觀Mr)未受只含緩沖液(0.1mg/ml BSA)、熱滅活的酶或在4℃下與HS層析分離的活性酶的分析空白樣的影響(未示出數(shù)據(jù))。在將溫育混合物加到DEAE-Sepharose上之后，在0.3M NaCl的存在下所有放射性仍保持結(jié)合，表明消化產(chǎn)物不是因?yàn)楸荒承﹥?nèi)硫酸酯酶活性脫硫酸鹽的緣故(Bartlett等，1995；Dawes和Pepper,1992；Wells和Dawes,1995)。
為了研究HS與HRG的結(jié)合是發(fā)生在乙酰肝素酶敏感性切割位點(diǎn)上還是位點(diǎn)附近，當(dāng)不存在和存在3∶1摩爾比的cHRG∶HS時(shí)用13762MAT細(xì)胞勻漿消化HS(HS似乎有3個(gè)可能的切割位點(diǎn)，它們中每一個(gè)都可能結(jié)合到HRG分子上)。圖5顯示了，與不存在cHRG時(shí)(此時(shí)底物被完全降解)相比，在cHRG存在下，HS的降解(導(dǎo)致形成小(5kDa)片段)速度顯著被減緩了。乙酰肝素酶活性的測定應(yīng)用cHRG-Sepharose分析法，在pH5.1下觀測到最大的乙酰肝素酶活性(未示出結(jié)果)，類似于以前通過凝膠過濾法分析的結(jié)果(圖1)。將NAM加入溫育混合物以抑制3H-GlcNAc(它不會(huì)結(jié)合到cHRG-Sepharose上)的外切糖苷酶釋放。HS和消化產(chǎn)物對cHRG-Sepharose的親和性未受含最終濃度為0.1mg/ml BSA、0.1％(v∶v)Triton X-100或高達(dá)0.2M NaCl的溫育混合物的影響。但是，在0.1％Triton X-100存在下分析時(shí)，組織勻漿乙酰肝素酶活性增大達(dá)2倍。反之，可溶性乙酰肝素酶活性(在通過離心除去膜之后)未因溫育混合物中BSA或Triton X-100的添加而受影響，不過高度純化的酶制劑要求溫育混合物中存在BSA以獲得最適活性和穩(wěn)定性。在關(guān)于HS降解外切酶活性的測定方面廣泛報(bào)道了需要BSA以測定高度純化的酶的最適活性，并需要Triton X-100用于組織勻漿的最大活性(Freeman和Hopwood,1986,1987,1989a,b,1992)。該cHRG-Sepharose柱按常規(guī)用高濃度的鹽洗脫，然后在PBS中再平衡。在4℃下的PBS中貯存這些柱，常用達(dá)2年之久也不會(huì)明顯降低結(jié)合容量。
圖6將13762MAT勻漿乙酰肝素酶消化HS之后表觀Mr的變化(圖6A)，與將溫育混合物加到cHRG-Sepharose上之后未結(jié)合的放射性HS片段的表現(xiàn)作了比較(圖6B)。對于在6h的溫育后未結(jié)合到cHRG-Sepharose上的物質(zhì)的凝膠過濾分析示出表觀Mr為17kDa(未示出結(jié)果)。通過cHRG-Sepharose分析測定的酶活性關(guān)于長達(dá)10h的溫育時(shí)間和高達(dá)30％的底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率呈線性(圖6B)。在延長的溫育時(shí)間(24h)后，84％的放射性通過了該cHRG-Sepharose柱，表觀Mr為5kDa。猜測保持與柱結(jié)合的物質(zhì)含更高親和性的HRG-結(jié)合基元或是乙酰肝素酶抗性的，這是未曾研究過的現(xiàn)象。未結(jié)合到cHRG-Sepharose上的本底物質(zhì)通常是低Mr(小于6kDa)的物質(zhì)，可能代表在從豬粘膜分離HS期間得到的先前切割的HS片段。這些片段可這樣除去，即先通過應(yīng)用cHRG-Sepharose親和純化HS底物，或者先通過凝膠過濾除去較小的Mr物質(zhì)。
可應(yīng)用人HRG(hHRG)-Sepharose有效地代替cHRG-Sepharose來測定乙酰肝素酶。然而，hHRG對BALB/c3T3細(xì)胞表面HSPG的結(jié)合親和力弱于觀測到的cHRG的結(jié)合親和力(Brown和Parish1994)，由cHRG-Sepharose對豬粘膜HS的親和力高于觀測到的hHRG-Sepharose的親和力(未示出結(jié)果)反映了這一點(diǎn)。雞HRG的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于它可從血漿以比hHRG更高的收率被純化(C.Parish，未公開的觀測結(jié)果)?？蓱?yīng)用可商購的牛腎HS(Mr 17kDa)代替豬腸HS以測定乙酰肝素酶活性。反之，可商購的牛腸HS不能用來測定乙酰肝素酶活性，因?yàn)樗腗r小于5kDa，而且通過凝膠過濾分析和cHRG-Sepharose分析得知它根本不是哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶敏感性的。不同生物樣品中乙酰肝素酶活性的分析應(yīng)用定量的cHRG-Sepharose乙酰肝素酶分析法測試了得自正常人和癌患者的各種細(xì)胞系、組織和血小板勻漿以及血清的乙酰肝素酶活性。表1示出，存在于高度轉(zhuǎn)移性的大鼠乳腺癌13762MAT和DMBA-8A細(xì)胞系勻漿中的乙酰肝素酶活性分別比各個(gè)非轉(zhuǎn)移性J-克隆和DMBA-Sask變體高4倍和10倍。這些值既與這些細(xì)胞系降解人造(Matrigel)基膜的相對能力密切相關(guān)(Parish等，1992)，也與通過凝膠過濾分析估測的細(xì)胞勻漿降解HS的相對能力密切相關(guān)(見前面)。鼠Lewis肺癌(D122)和肺癌(A3a)的轉(zhuǎn)移性變體降解HS分別比它們各自的非轉(zhuǎn)移性變體快2.5倍和4.8倍(表1)。以前，Nakajima等(1986a,b)報(bào)道了應(yīng)用其對脫N-硫酸化、再N-乙?；疕S的固相分析得出，在差轉(zhuǎn)移性B16-F1亞系的提取物與更高轉(zhuǎn)移性B16-BL6、B16-F10和B16-B16b亞系的提取物之間乙酰肝素酶活性只差1.5～2.2倍。
本發(fā)明乙酰肝素酶分析法的靈敏度可適用于臨床估測癌患者。測定了取自6名肺癌患者的肺腫瘤組織中乙酰肝素酶活性。這些患者中，5名患者的原發(fā)腫瘤中乙酰肝素酶活性比患者的相鄰非腫瘤肺組織中的高2～4倍(未示出結(jié)果)。雖然幾乎檢測不出人血漿中的乙酰肝素酶活性(小于4pmol/hr/ml血漿)，但在正常成人血清和患有轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的患者血清中檢測到明顯的乙酰肝素酶活性。測得癌患者中血清乙酰肝素酶活性比正常對比組的高2倍(癌患者為229.7±28.8(n=8)，對比組為116.6±13.3(n=5)pmol/hr/ml血清)，證實(shí)了從惡性黑素瘤患者的血清觀測到的結(jié)果(Nakajima等，1988)。實(shí)際上，這些作者們觀察到存在組織轉(zhuǎn)移的患者中血清乙酰肝素酶活性增大了4倍。Nakajima等(1986c,1988)還觀察到，注射高度轉(zhuǎn)移性13762NF乳腺癌細(xì)胞30天后的大鼠中的血清乙酰肝素酶含量比正常大鼠的高17倍，而攜帶MTLn3腫瘤的大鼠的血清中酶活性與轉(zhuǎn)移程度相關(guān)性良好。
也檢測了多種人的和大鼠的細(xì)胞系血小板和組織勻漿中的乙酰肝素酶活性(表2)，這些勻漿應(yīng)該代表供將來純化的有價(jià)值乙酰肝素酶來源。為了方便細(xì)胞和組織之間的比較，以/mg提取的蛋白質(zhì)表示乙酰肝素酶活性。該迅速、定量分析乙酰肝素酶的方法的開發(fā)對于從各種來源純化乙酰肝素酶活性很有價(jià)值，它將能使得迅速篩選推定的乙酰肝素酶抑制劑。表1．轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞系的乙酰肝素酶活性腫瘤細(xì)胞勻漿乙酰肝素酶活性是在將溫育混合物在cHRG-Sepharose上分級分離后估測的。除了另外指出外，酶活性都以3次單獨(dú)試驗(yàn)的平均值±SEM表示。至于全部細(xì)節(jié)，見方法部分。腫瘤類別細(xì)胞系轉(zhuǎn)移性 乙酰肝素酶活性(pmol/hr/106個(gè)細(xì)胞)大鼠乳腺癌 13762MAT 是47.4±2.213762MAT 非12.8±0.5(J-克隆)DMBA-8A 是35.6±3.2DMBA-Sask非3.4±0.1人結(jié)腸癌HCT116 是10.3,10.4人單核細(xì)胞 U937 非7.6,8.2人角質(zhì)形成細(xì)胞 KJD 非7.8,10.2鼠Lewis肺癌 D122 是16.4±1.1LLC 非6.5±0.5鼠肺癌 A3a 是16.3±1.2SP1 非 3.4±0.2表2．人的和大鼠的細(xì)胞和組織中乙酰肝素酶活性。
將溫育混合物在cHRG-Sepharose上分級分離后估測人的和大鼠的組織和培養(yǎng)細(xì)胞的各種勻漿中乙酰肝素酶活性范圍。至于全部細(xì)節(jié)，見方法部分。細(xì)胞或組織 乙酰肝素酶活性(pmol/hr/mg蛋白質(zhì))人血小板2178-3591(n=6)人結(jié)腸癌(HCT116)38.2-66.6(n=4)HUVECS 21.0-42.6(n=4)人平滑肌細(xì)胞50.3,75.9人肺成纖維細(xì)胞 1.5,3.0人角質(zhì)形成細(xì)胞(KJD) 62.2,78.4大鼠13762MAT細(xì)胞141.1-349.2(n=6)大鼠肝 9.5-28.3(n=6)實(shí)施例2應(yīng)用的縮寫B(tài)SA，牛血清白蛋白；cHRG，雞富含組氨酸的糖蛋白；HRG，富含組氨酸的糖蛋白；HS，硫酸乙酰肝素；HSPG，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖；HUVEC，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；PBS，磷酸鹽緩沖鹽水。
Ⅰ-原料肝素衍生的16.7、10.6、6.7和3.1kDa的分子質(zhì)量(Mr平均)標(biāo)準(zhǔn)物是Nova Nordisk(Gentofte，丹麥)慷慨贈(zèng)送的(見Kristensen等，1991)。豬粘膜HS(ORG553)是Organon Int.Bv.(Oss，荷蘭)慷慨贈(zèng)送的。Pharmacia Fine Chemicals(Uppsala，瑞典)提供了伴刀豆球蛋白A-Sepharose4 B、螯合-Sepharose4 B、Superose6和12HR 10/30凝膠層析柱，用于校準(zhǔn)凝膠過濾柱和SDS-PAGE凝膠及辛基-Sepharose的分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)試劑盒。Sigma Chemical Co.(StLouis,MO)提供了結(jié)晶牛血清白蛋白(BSA)、牛肺和豬粘膜肝素、牛腎HS、3,3-二甲基戊二酸、Blue A-瓊脂糖、辛基-瓊脂糖、CHAPS、乙酸鋅。Amicon Corp.(Beverly,MA)提供了Centricon100和30微量濃縮器。Beckmann(Gladesville，澳大利亞)提供了Ready Safe閃爍液。Stratagene USA(La Jolla,CA)提供了StrataClean Resin。
富含死亡血小板的血漿得自the Canberra Hospital，用生理鹽水通過在20℃下以1600xg將懸浮的血小板離心15分鐘洗滌兩次，在-80℃下冷凍貯存粒狀沉淀。人血小板也通過Bartlett等(1995)的方法獲得，并在生理鹽水中洗滌兩次。細(xì)胞勻漿的制備如下將108個(gè)血小板懸浮于0.2ml 0.1％(v∶v)Triton X-100水溶液中，通過在固態(tài)CO2/乙醇混合物中冷凍和融化三次使之破裂。蛋白質(zhì)濃度是通過Bio-RadCoomassie蛋白質(zhì)分析試劑盒(Bio-Rad Laboratories,Richmond,CA)應(yīng)用BSA作標(biāo)準(zhǔn)物估測的。
Ⅱ-方法放射性標(biāo)記底物的制備放射性標(biāo)記的豬腸粘膜硫酸乙酰肝素(ORG553)、豬腸粘膜肝素和牛肺肝素是應(yīng)用實(shí)施例1的方法通過用肼進(jìn)行N-脫乙?；陀?H-乙酸酐進(jìn)行N-乙酰化而制備的。乙酰肝素酶分析分析方法1。測定了人血小板乙酰肝素酶對HS的活性，應(yīng)用實(shí)施例1的雞富含組氨酸的糖蛋白(cHRG)-Sepharose珠分離方法將產(chǎn)物與底物分離。將多達(dá)2μl的樣品加入溫育混合物，該溫育混合物包括于0.05M乙酸鈉緩沖液(pH5.1)中的90pmol放射性標(biāo)記的HS，其中含5mM N-乙酰甘露糖胺和0.1mg/ml BSA，總體積為20μl；在37℃下溫育適當(dāng)時(shí)間至5～20％的底物分解成產(chǎn)物。通過冷凍試管終止反應(yīng)，添加0.3ml冷磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，如果需要的話在4℃下離心該溶液，將0.1ml樣品加到預(yù)先用PBS平衡的cHRG-Sepharose微型柱(0.2ml)上。用0.7ml PBS洗滌這些柱，將洗滌液和流過的物質(zhì)轉(zhuǎn)移到閃爍小瓶中，添加10ml閃爍液，測定放射性。酶活性以每小時(shí)每mg蛋白質(zhì)形成的產(chǎn)物pmol數(shù)表示。分析方法2。如前所述在37℃下分析乙酰肝素酶對2μg放射性標(biāo)記的HS或肝素類似物的活性達(dá)16h，通過溫育混合物在Superose6上(對于HS降解)或Superose12上(對于肝素降解)的凝膠過濾分析進(jìn)行檢測。用PBS在0.25ml/分的流速下平衡和展開這些層析柱，將0.5ml的各級分直接收集入閃爍小瓶，添加3ml閃爍液，測定放射性。用3H-N-乙酰葡糖胺(221Da)、牛肺肝素(12.5kDa)和肝素衍生的Mr平均標(biāo)準(zhǔn)物(16.7、10.6、6.7和3.1kDa)校正這些柱，這些標(biāo)準(zhǔn)物已如前面關(guān)于放射性標(biāo)記HS的制備所述被部分地脫N-乙酰化和用3H-乙酸酐再N-乙?；Ｑ“逡阴８嗡孛傅募兓橇碛姓f明，所有操作都在4℃下進(jìn)行。應(yīng)用分析方法1測定乙酰肝素酶對HS的活性。在各步驟(除了步驟3中0.8M NaCl洗滌BlueA-瓊脂糖之外)中，緩沖液對柱的洗滌持續(xù)到應(yīng)用Bio-Rad蛋白質(zhì)分析法在柱的洗脫液中不再能檢測到蛋白質(zhì)為止。
步驟1．酶活性的增溶將50單位冷凍、洗滌過的人血小板懸浮于4體積含0.5M NaCl的15mM二甲基戊二酸鈉緩沖液(pH6.0)(緩沖液A)中而使之融化，將樣品浸入固態(tài)CO2/乙醇浴中后凍/融三次。在35000xg下將懸浮血小板勻漿離心60分鐘，上清液被用于步驟2中。將沉淀物重懸浮于200ml緩沖液A中，再次凍/融，再如上述那樣離心。重復(fù)該操作兩次，最后將沉淀物在含1％(v∶v)CHAPS的緩沖液A中勻化，如上述那樣離心。嚴(yán)格按下述方法純化該CHAPS上清液中的乙酰肝素酶活性，只是在步驟2中向提取物中加入Triton X-100。
步驟2．伴刀豆球蛋白A-Sepharose層析將步驟1的上清液在Triton X-100中配成0.2％(v∶v)，然后在約1ml/分下加到在含0.2％Triton X-100的緩沖液A(緩沖液B)中平衡過的伴刀豆球蛋白A-Sepharose柱(1.5×5.0cm)上。在4℃下依次用25ml緩沖液B和40mls緩沖液A洗滌該柱，再用預(yù)先暖至20℃的40ml緩沖液A洗滌。應(yīng)用預(yù)先被暖至20℃的、含20％α-甲基甘露糖苷(w∶v)的40ml緩沖液A洗脫乙酰肝素酶活性。將洗脫液收集入保持在冰斗中的容器。
步驟3．Zn2+螯合Sepharose/Blue A-瓊脂糖層析將步驟2的酶溶液在1ml/分下加到與Blue A-瓊脂糖柱(1.0×2.0cm)串聯(lián)連接的Zn2+螯合Sepharose柱(1.0×10.0cm)上。用50ml緩沖液A洗滌組合的柱，接著依次用20ml含0.5M NaCl的Tris緩沖液(60mM Tris/HCl緩沖液，pH7.4，配于10％(v∶v)甘油中)和1.5ml含0.8M NaCl的Tris緩沖液洗滌斷開的Blue A-瓊脂糖柱。
步驟4．Blue A-瓊脂糖/辛基瓊脂糖層析將步驟3的Blue A-瓊脂糖柱連接到在含2M NaCl的Tris緩沖液中平衡過的辛基-瓊脂糖柱(1.0×1.5cm)上。用15ml含2M NaCl的Tris緩沖液在0.5ml/分下洗脫該Blue A-瓊脂糖柱。立即將辛基-瓊脂糖洗脫液在包括一層PM10膜的Amicon超濾攪拌池中濃縮至5ml體積，再通過Centricon30離心濃縮至0.2ml體積。添加含10％(v∶v)甘油的緩沖液A(緩沖液C)，再將該酶溶液濃縮至0.4ml。
步驟5．Superose12層析將步驟4的濃縮了的酶溶液分成各200μ1的兩份加到串聯(lián)連接的兩個(gè)Superose12HW 10/30柱上，用緩沖液C平衡該柱并在0.5ml/分下展開。收集0.5ml的各級分而分析乙酰肝素酶活性，通過Centricon30離心來濃縮含乙酰肝素酶活性的級分至0.4ml。該純化的酶在4℃下的緩沖液C中貯存時(shí)可穩(wěn)定數(shù)月。
步驟6．Centricon100和30離心對于從小于20單位的已洗滌的血小板獲得的血小板制劑，將得自步驟4中辛基-Sepharose柱的2M NaCl洗脫液通過在Centricon100微量濃縮器中離心而濃縮，再如步驟4中所述應(yīng)用Centricon30微量濃縮器濃縮含乙酰肝素酶活性的濾液并對緩沖液C透析。本征Mr和亞單位Mr通過上面步驟5中所述在兩個(gè)串聯(lián)連接的Superose12 HW 10/30柱上的層析測定了純化的人血小板乙酰肝素酶活性的本征Mr。用下列Mr標(biāo)準(zhǔn)物校正該柱，即甲狀腺球蛋白(669kDa)、鐵蛋白(440kDa)、過氧化氫酶(232kDa)、果糖-二磷酸醛縮酶(158kDa)、牛血清白蛋白(67kDa)、卵清蛋白(43kDa)、胰凝乳蛋白酶原(25kDa)和核糖核酸酶A(13kDa)。
按Laemmli(1981)的方法操作不連續(xù)SDS-PAGE，并用CoomassieBrilliant Blue R250染色。用下列Mr標(biāo)準(zhǔn)物校正10％聚丙烯酰胺凝膠，即磷酸化酶b(94kDa)、牛血清白蛋白(67kDa)、卵清蛋白(43kDa)、碳酸酐酶(30kDa)、大豆胰蛋白酶抑制劑(20kDa)和α-乳清蛋白(14kDa)。這樣濃縮樣品，即添加10μl StrataClean Resin，按生產(chǎn)廠商的說明渦動(dòng)和離心該懸浮液。通過在二硫蘇糖醇中煮沸而還原該沉淀物，再通過標(biāo)準(zhǔn)方法將懸浮液加到積層凝膠上。
Ⅲ-結(jié)果和討論血小板乙酰肝素酶的純化以前，已證實(shí)人血小板勻漿含2.2-3.6nmol/h/mg蛋白質(zhì)乙酰肝素酶對HS的活性，比在轉(zhuǎn)移性人結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞系HCT116中觀測到的活性高60倍(實(shí)施例1)。因此，血小板是哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶活性的極豐富資源。乙酰肝素酶活性可從通過凝血酶誘導(dǎo)的脫粒(Hoogewerf等，1995)而獲得的新鮮血小板中釋放，但發(fā)現(xiàn)通過凝血酶刺激過時(shí)的血小板而釋放的乙酰肝素酶活性水平可變性很大。所以乙酰肝素酶活性是通過凍/融預(yù)先冷凍的已洗滌血小板使之溶解而得到的。
由于報(bào)道過的該酶的不穩(wěn)定性(Oldberg等，1980)以及在該酶的純化期間所得活性的較低回收率(Hoogewerf等，1995；Oosta等1982)，所以改進(jìn)了層析條件以最大程度地濃縮洗脫的蛋白質(zhì)。這是通過分批(或等度)洗脫而不是梯度洗脫達(dá)到的，并設(shè)計(jì)條件使酶通過一個(gè)柱時(shí)未被結(jié)合，但通過串聯(lián)連接的下一個(gè)柱時(shí)被結(jié)合。這使得可在鹽梯度洗脫之后節(jié)省分析酶活性的時(shí)間，并將因酶的稀釋引起的活性損失減至最小程度。
事先冷凍的已洗滌血小板在緩沖液A(它含0.5M NaCl)中的勻化不會(huì)釋放任何明顯的可溶性酶活性。然而，通過反復(fù)凍/融血小板接著將勻漿離心把總乙酰肝素酶活性的大約75％溶解(表3)。殘余的膜相關(guān)性酶只能通過在含1％(v∶v)CHAPS的緩沖液A中勻化而被釋放。該膜與含1％TritonX-100的緩沖液A一起勻化溶解了該酶，但它迅速失去活性。該膜結(jié)合酶是通過與用于分離可溶性酶相同的方法從50個(gè)單位已洗滌的血小板純化的。
當(dāng)在去污劑存在下施加時(shí)，加到伴刀豆球蛋白A-Sepharose柱上的所有酶活性被牢固地結(jié)合了。在20℃下應(yīng)用緩沖液A洗滌該柱比單獨(dú)在4℃下洗滌除去了更多非特異性地結(jié)合的蛋白質(zhì)。與在4℃下的正常洗脫相比，在20℃下洗脫該柱大大提高了酶活性的回收率和洗脫速度(用小于5個(gè)柱體積的洗脫液)。乙酰肝素酶活性被純化了19倍，從原血小板上清液回收了56％的酶活性(表3)。該步驟中酶活性的回收率一般在55～70％范圍內(nèi)。用含α-甲基甘露糖苷和0.1％Triton X-100的緩沖液在20℃下不再能從柱中洗脫乙酰肝素酶活性。已被相當(dāng)成功地用于純化HS-降解胞外酶活性(Bielicki等，1990；Clements等，1985；Freeman和Hopwood,1986,1987,1989)的螯合-Sepharose和染料-基質(zhì)層析的應(yīng)用，以前未被用于分離哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶活性。不結(jié)合到鋅螯合柱上的該酶，被牢固地結(jié)合到染料柱上，這就使得將肝素降解胞外酶活性α-L-艾杜糖苷酸酶、β-D-葡糖苷酸酶和α-N-乙酰氨基葡糖苷酶與血小板乙酰肝素酶完全分離(未示出結(jié)果)。在未結(jié)合的級分中或者在該染料柱的低鹽(0.5和0.8M NaCl)Tris緩沖液洗滌液中未檢測到乙酰肝素酶活性。從該Blue A-瓊脂糖柱高鹽(2M NaCl)洗脫乙酰肝素酶導(dǎo)致多數(shù)污染蛋白結(jié)合到該辛基-瓊脂糖柱上，同時(shí)通過凝膠層析的最后純化以幾乎純凈的形式濃縮未結(jié)合的乙酰肝素酶。雖然該酶未結(jié)合到辛基-瓊脂糖上，但在2M NaCl中施加時(shí)它確實(shí)結(jié)合到辛基-Sepharose上，不過用1M NaCl可將它從柱上洗脫(未示出結(jié)果)。比步驟2進(jìn)一步將乙酰肝素酶活性純化了80倍，給出總純化程度為1500倍，活性的回收率為26％。用分別含0.1M咪唑和1％Triton X-100的緩沖液A從柱上洗脫余下的結(jié)合蛋白質(zhì)之后從螯合-Sepharose柱或者從辛基-瓊脂糖柱不再能回收到活性。此外，與Hoogewerf等(1995)報(bào)道的相反，在Centricon30濃縮該幾乎純凈的酶之后的濾液中檢測不到乙酰肝素酶活性。
凝膠過濾層析(圖7)導(dǎo)致比步驟4又將酶純化1.1倍，使得從原始勻漿最后將酶活性純化1900倍，回收率達(dá)19％。這比得上Oosta等(1982)和Hoogewerf等(1995)分別報(bào)道的從富含血小板的血漿以5.6％的收率純化240000倍和以8％的收率純化4100倍。應(yīng)用本實(shí)施例中所述方法可在2天內(nèi)以高達(dá)30％的收率制備純化的人血小板乙酰肝素酶(應(yīng)用小于20單位的洗滌了的血小板)的更小制劑。此時(shí)，應(yīng)用按比例更小的柱，且凝膠過濾步驟5代之以通過Centricom100過濾該辛基-瓊脂糖洗脫液，再通過Centricom30濾器濃縮。還純化了膜相關(guān)性酶，酶活性的收率為25％，比活性為6600nmol/h/mg蛋白質(zhì)，與對于可溶性酶所觀測到的情況相似。該酶的膜相關(guān)形式表現(xiàn)出與該酶的可溶形式相同的層析性能。本征分子質(zhì)量對純化的乙酰肝素酶(見圖7)和在伴刀豆球蛋白A-Sepharose層析(步驟2)之后所得酶的凝膠過濾分析證實(shí)該酶的表現(xiàn)Mr為50kDa。在相應(yīng)于8～10kDa的Mr值或者相應(yīng)于如Hoogewerf等(1995)報(bào)道的趨化因子二聚體或四聚體尺寸的血小板乙酰肝素酶活性的情況下都未檢測到酶活性，在相應(yīng)于如Oosta等(1982)報(bào)道的表觀Mr為134kDa的情況下也未檢測到任何活性。然而，本實(shí)施例中給出的結(jié)果類似于Graham和Underwood(1996)關(guān)于人血小板提取物獲得的40～60kD的Mr值。該值也類似于報(bào)道的關(guān)于純化了的人胎盤乙酰肝素酶的45kDa本征Mr(Gilat等，1995)和報(bào)道的關(guān)于部分純化了的人脾乙酰肝素酶的50kDa(Sewell等，1989)，但不同于報(bào)道的關(guān)于鼠黑素瘤酶的94kDa的Mr值(Jin等，1990)。此外，純化了的人乙酰肝素酶未被Centricon 100kDa膜阻留，但被Centricon 30kDa膜阻留。如Hoogewerf等(1995)報(bào)道的那樣，在30kDa膜濾液中未檢測到乙酰肝素酶活性。然而，在步驟2的層析之后，酶活性被Centricon 100kDa膜阻留了，這表明在濃縮過程中與其它蛋白質(zhì)的顯著相互作用，因?yàn)橥ㄟ^凝膠過濾分析得知步驟2的物質(zhì)表觀Mr為50kDa(未示出結(jié)果)。已純化的酶的SDS-PAGE分析指出在還原條件(圖8)和非還原條件(未示出結(jié)果)下相應(yīng)于50kDa的Mr值的單一考馬斯藍(lán)染色帶，它與凝膠過濾分析所得的值相同。通過凝膠過濾分析和SDS-PAGE分析測得已純化的膜相關(guān)性酶也具有50kDa的本征Mr和亞單位Mr(在還原條件下)。尚不知該酶如何與膜有關(guān)。因?yàn)樗某叽珙愃朴诳扇苄悦?，所以有可能乙酰肝素酶可呈可溶性形式和膜相關(guān)性形式存在，這類似于溶酶體酶酸性磷酸酶，它通過與甘露糖-6-磷酸無關(guān)的途徑被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體，而且它具有一個(gè)2kDa C端跨膜肽，該跨膜肽導(dǎo)致該酶以膜結(jié)合的形式和可溶性形式存在于溶酶體中。(Peters等，1990)。以前，Gallagher等(1988)報(bào)道了大鼠肝膜乙酰肝素酶活性的存在。然而，與本文報(bào)道的酶不同，該酶在小于7.5的pH值下無活性。純化的血小板乙酰肝素酶的底物特異性如通過分析方法1測定的，純化了的人血小板乙酰肝素酶對HS的活性在pH5.1下最大，類似于關(guān)于血小板勻漿乙酰肝素酶活性所報(bào)道的情況(實(shí)施例1)。通過凝膠過濾分析得知該純化的酶既切割HS也切割肝素。如報(bào)道過的關(guān)于血小板勻漿乙酰肝素酶對粘膜HS的活性(實(shí)施例1)那樣，豬粘膜HS(22kDa)、和牛腎HS(17kDa)各自都被切割至5kDa的片段。以前，證實(shí)了豬粘膜HS呈逐步方式從22kDa被切割至17至11和最后至5kDa的片段(實(shí)施例1)。
粘膜肝素和更高度硫酸化的肺肝素各自從12.5kDa分別切割至4和6kDa的片段。與一次切割的肺肝素相比，粘膜肝素似乎呈逐步方式被切割了兩次。然而，與Hoogewerf等(1995)報(bào)道的不同，沒有跡象表明在持久溫育純化的酶或者步驟1的勻漿乙酰肝素酶之后從HS或者肝素(或修飾的肝素)的切割產(chǎn)生主要為二糖的產(chǎn)物，甚至如那些作者所述用還原劑和氧化劑預(yù)處理該酶之后也一樣。表3．從人血小板純化乙酰肝素酶。
參考文獻(xiàn)Bar-Ner,M.,Kramer,M.D.,Schirrmacher,V.,Ishai-Michaeli,R.,Fuks,Z.，和Vlodavsky,I.(1985).國際癌雜志35,483-491。Bar-Ner,M.,Mayer,M.,Schirrmacher,V.，和Vlodavsky,I.(1986).細(xì)胞生理學(xué)雜志128,299-306。Bartlett,M.R.,CoWden,W.C.和Parish,C.R.(1995a).白細(xì)胞生物學(xué)雜志57,207-213。Bartlett,M.R.,Underwood,P.A.，和Parish,C.R.(1995b).免疫細(xì)胞生物學(xué)73,113-124。Benezra,M.,Vlodavsky,I.和Bar-Shavit,R.(1992).實(shí)驗(yàn)細(xì)胞研究201,208-215。Bielicki,J.,Freeman,C.,Clements,P.R.和Hopwood,J.J.(1990).生物化學(xué)雜志[英]271,75-86。Brenan,M.和Parish,C.R.(1986).歐洲免疫學(xué)雜志16,423-430。Brown,K.J.和Parish,C.R.(1994).生物化學(xué)33,13918-13927。Castellot Jr.,J.J.,Favreau,L.V.Karnovsky,M.J.和Rosenberg,R.D.(1982)生物化學(xué)雜志[美]257,11256-11260。Clements,P.R.,Brooks,D.A.,Saccone,G.T.P.和Hopwood,J.J.(1985).歐洲生物化學(xué)雜志152,21-28。Coombe,D.R.,Parish,C.R.,Ramshaw,I.A.和Snowden,J.M.(1987).國際癌雜志，39,82-88。Crissman,J.D.,Hatfield,J.,Shaldenbrand,M.,Sloane,B.F.和Honn,K.V.(1985).實(shí)驗(yàn)室研究53,470-478。Dawes J.，和Pepper,D.S.(1992).血栓形成和止血67,468-472。Eldor,A.,Bar-Ner,M.,Yahalom,J.,Fuks,Z.和Vlodavsky,I.(1987).血栓形成和止血研究13,475-488。Freeman,C.，和Hopwood,J.J.(1986).生物化學(xué)雜志[英]，234,83-92。Freeman,C.，和Hopwood,J.J.(1987).生物化學(xué)雜志[英]246,355-365。Freeman,C.，和Hopwood,J.J.(1989a).分析生物化學(xué)176,244-248。Freeman,C.，和Hopwood,J.J.(1989b).生物化學(xué)雜志[英]259,209-216。Freeman,C.，和Hopwood,J.J.(1991).生物化學(xué)雜志[英]279,399-405。Freeman,C.，和Hopwood,J.J.(1992).生物化學(xué)雜志[英]282,605-614。Gallagher,J.T.,Walker,A.,Lyon,M.，和Evans,W.H.(1988).生物化學(xué)雜志[英]250,719-726。Gamse,G.,Fromme,H.G.和Kresse,H.(1978).生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報(bào)544,514-528。Gilat,D.,Hershoviz,R.,Goldkorn,I.,Cahalon,L.,Vlodavsky,I.和Lider,O.J.(1995).實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志181,1929-1934。Godder,K.,Vlodavsky,I.,Eldor,A.,Weksler,B.B.,Haimovitz-Freidman,A.，和Fuks,Z.(1991).細(xì)胞生理學(xué)雜志148,274-280。Graham,L.D.,Hayward,I.P.和Underwood,P.A.(1995a).國際生物化學(xué)與分子生物學(xué)37,231-237。Graham,L.D.,Mitchell,S.M.和Underwood,P.A.(1995b).國際生物化學(xué)與分子生物學(xué)37,239-246。Graham,L.D.和Underwood,P.A.(1996).國際生物化學(xué)與分子生物學(xué)39,563-571。Hahnenberger,R.,Jakobsen,A.M.,Ansari,A.,Wehler,T.,Svahn,C.M.和Lindahl,U.(1993).糖生物學(xué)3,567-573。Hennes,R.,Frantzen,F.,Keller,R.,Schirrmacher,V.和Schwartz-Albiez,R.(1988).英國癌雜志58,186-188。Hoogewerf,A.J.,Leone,J.W.,Reardon,I.M.,Howe,W.J.,Asa,D.,Heinrikson,R.L.，和Ledbetter,S.R.(1995)生物化學(xué)雜志[美]270,3268-3277Hopwood,J.J.，和Elliott,H.(1982).臨床化學(xué)學(xué)報(bào)120,77-86。Hk,M.,Wasteson,.，和Oldberg,.(1975).生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊67,1422-1428。Irimura,T.,Nakajima,M.，和Nicolson,G.L.(1986).生物化學(xué)25,5322-5328。Ishai-Michaeli,R.,Eldor,A.，和Vlodavsky,I.(1990).細(xì)胞調(diào)節(jié)1,833-842。Jackson,R.L.,Busch,S.J.和Cardin,A.D.(1991).生理學(xué)評論71,481-539。Jin,L.,Nakajima,M.和Nicolson,G.L.(1990).國際癌雜志45,1088-1095。Karamanos,N.K.,Hjerpe,A.,Tsegenidis,T.,Engfeldt,B.，和Antonopoulos,C.A.(1988).分析生物化學(xué)172,410-419。Klein,U.，和von Figura,K(1976).生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊73.569-576。Klein,U.，和von Figura,K.(1979).Hoppe-Seyler′s Z.生理化學(xué)360,1465-1471。Kristensen,H.I.,Tromborg,E.M.,Nielsen,J.R.,Nielsen,J.I.,Johansen,K.B.和Ostergaard,P.B.(1991).血栓形成研究(Thromb.Res.)64,131-141。Laemmli,U.K.(1970).自然(倫敦)227,680-685。Lane,D.A.,Pejler,G.,Flynn,A.M.,Thompson,E.A.，和Lindahi,U.(1986).生物化學(xué)雜志[美]261,3980-3986。Laskov,R.,Ishai-Michaeli,R.,Sharir,H.,Yefenof,E.，和Vlodavsky,I.(1991).國際癌雜志47,92-98。Lider,O.,Baharav,E.,Mekori,Y.A.,Miller,T.,Naparstek,Y.,Vlodavsky,I.，和Cohen,I.R.(1989).臨床研究雜志83,752-756。Matzner,Y.,Bar-Ner,M.,Yahalom,J.,Ishai-Michaeli,R.,Fuks,Z.,和Vlodavsky,I.(1985).臨床研究雜志76,1306-1313。Matzner,Y.,Vlodavsky,I.,Bar-Ner,M.,Ishai-Michaeli,R.，和Tauber,A.I.(1992).白細(xì)胞生物學(xué)雜志51,519-524。Morikawa,K.,Walker,S.M.,Nakajima,M.,Pathak,S.,Jessup,J.M.和Fidler,I.J.(1988).癌研究48,6863-6871。Nakajima,M.,Irimura,T.,Di Ferrante,D.,Di Ferrante,N.，和Nicolson,G.L.(1983).科學(xué)220,611-613。Nakajima,M.,Irimura,T.，和Nicolson,G.L.(1986a).分析生物化學(xué)157,162-171。Nakajima,M.,Irimura,T.，和Nicolson,G.L.(1986b).癌通訊31,277-283。Nakajima,M.,Welch,D.R.,Irimura,T.，和Nicolson,G.L.(1986c).臨床生物學(xué)研究進(jìn)展212,113-122。Nakajima,M.,Irimura,T.，和Nicolson,G.L.(1988).細(xì)胞生物化學(xué)雜志36.157-167。Naparstek,Y.,Cohen,I.R.,Fuks,Z.，和Vlodavsky,I.(1984).自然310,241-243。Oldberg,A,Heldin,C-H.,Wasteson,A.,Busch,C.，和Hk,M.(1980).生物化學(xué)19,5755-5762。Oosta,G.M.,Favreau,L.V.,Beeler,D.L.，和Rosenberg,R.D.(1982).生物化學(xué)雜志[美]257,11249-11255。Parish,C.R.,Jakobsen,K.B.，和Coombe,D.R.(1992).國際癌雜志52,378-383。Parish,C.,Willenborg,D.，和Cowden,W.(1990).今日生命科學(xué)2.20-27。Peters,C.,Braun,M.,Weber,B.,Wendland,M.,Schmidt,B.,Pohlmann,R.,Waheed,A.和von Figura,K.(1990).栓塞雜志(EMBO J)9,3497-3506。Ricoveri,W.，和Cappelletti,R.(1986).癌研究46,3855-3861。Rylatt,D.B.,Sia,D.Y.,Mundy,J.P.，和Parish,C.R.(1981).歐洲生物化學(xué)雜志119,641-646。Schlechte,W.,Murano,G.，和Boyd,D.(1989).癌研究49,6064-6069。Schmitt,M.,Janicke,F.，和Graeff,J.(1992).血纖維蛋白溶解作用6,(增刊4),3-26。Sewell,R.F.,Brenchley,P.E.G.，和Mallick,N.P.(1989).生物化學(xué)雜志[英]264,777-783。Thunberg,L.,Bckstrm,G.,Wasteson,A.,Robinson,H.C.,Ogren,S.,和Lindahl,U.(1982).生物化學(xué)雜志[美]257,10278-10282。Turnbull,J.E.，和Gallagher,J.T.(1990).生物化學(xué)雜志[英]265,715-724。Turnbull,J.E.，和Gallagher,J.T.(1991).生物化學(xué)雜志[英]273,553-559。Turnbull,J.E.,Fernig,D.G.,Ke,Y.,Wilkinson,M.C.，和Gallagher,J.T.(1992).生物化學(xué)雜志[美]267,10337-10341。Vlodavsky,I.,Eldor,A.,Haimovitz-Friedman,A.,Matzner,Y.,Ishai-Michaeli,R.,Lider,O.,Naparstek,Y.,Cohen,I.R.，和Fuks,Z.(1992).侵入性轉(zhuǎn)移(Invasion Metastasis)12,112-127。Vlodavsky,I.,Ishai-Michaeli,R.,Bar-Ner,M.,Fridman,R.,Horowitz,A.T.,Fuks,Z.，和Biran,S.(1988).以色列醫(yī)療科學(xué)雜志(Isr.J.Med.Sci.)24,464-470。Walker,A.,Turnbull,J.E.，和Gallagher,J.T.(1994).生物化學(xué)雜志[美]269.931-935。Wasteson,A.,Glimelius,B.,Busch,C.,Westermark,B.,Heldin,C-H.和Norling,B.(1977).血栓形成研究11,309-321。Wasteson,A.,Hook,M.，和Westermark,B.(1976).歐洲生物化學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)通訊(FEBS Letters),64,218-221。Wells,X.E.，和Dawes,J.(1995).血栓形成和止血74,667-672。Willenborg,D.O.，和Parish,C.R.(1988).免疫學(xué)雜志140,3401-3405。Yahalom,J.,Eldor,A.,Biran,S.,Fuks,Z.和Vlodavsky,I.(1985).放射治療腫瘤學(xué)(Radiother.Oncol.)3,211-225。Yahalom,J.,Eldor,A.,Fuks,Z.和Vlodavsky,I.(1984).臨床研究雜志74,1842-1849。Yurchenco,P.D.，和Schittny,J.C.(1990).美國實(shí)驗(yàn)生物學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)雜志(FASEB J.)4,1577-1590。
權(quán)利要求
1．檢測樣品中哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶活性的方法，該方法包括如下步驟ⅰ．將待測樣品與乙酰肝素酶底物在樣品中的乙酰肝素酶足以降解該乙酰肝素酶底物的條件下接觸一段時(shí)間；ⅱ．通過把未降解的或部分降解的乙酰肝素酶底物與硫酸乙酰肝素結(jié)合蛋白結(jié)合將降解產(chǎn)物與未降解的或部分降解的乙酰肝素酶底物分離；以及ⅲ．檢測分離的降解產(chǎn)物以指示樣品中的乙酰肝素酶活性。
2．權(quán)利要求1的方法，其中所述樣品選自人的和非人的血清、細(xì)胞和組織勻漿或提取物。
3．權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中所述乙酰肝素酶底物是標(biāo)記的底物。
4．權(quán)利要求3的方法，其中所述乙酰肝素酶底物是放射性標(biāo)記底物。
5．權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)的方法，其中所述乙酰肝素酶底物是硫酸乙酰肝素。
6．權(quán)利要求5的方法，其中所述硫酸乙酰肝素是豬粘膜硫酸乙酰肝素或牛腎硫酸乙酰肝素。
7．權(quán)利要求6的方法，其中所述硫酸乙酰肝素是3H豬粘膜硫酸乙酰肝素或3H牛腎硫酸乙酰肝素。
8．權(quán)利要求1～7任一項(xiàng)的方法，其中所述硫酸乙酰肝素結(jié)合蛋白是雞的富含組氨酸的糖蛋白。
9．權(quán)利要求8的方法，其中所述富含組氨酸的糖蛋白是雞富含組氨酸的糖蛋白。
10．權(quán)利要求1～9任一項(xiàng)的方法，其中所述硫酸乙酰肝素結(jié)合蛋白被固定化。
11．權(quán)利要求10的方法，其中所述硫酸乙酰肝素結(jié)合蛋白是通過結(jié)合到瓊脂糖珠上而被固定化的。
12．權(quán)利要求1～11任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品與所述乙酰肝素酶底物在35℃～40℃范圍內(nèi)的溫度下，優(yōu)選在約37℃下，以及在4.2～7.5范圍內(nèi)的pH下，優(yōu)選在約pH5.1下接觸2～48小時(shí)，優(yōu)選約16小時(shí)。
13．用于檢測樣品中哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶活性的試劑盒，它包括呈區(qū)室化形式的?。阴８嗡孛傅孜铮虎ⅲ蛩嵋阴８嗡亟Y(jié)合蛋白；以及ⅲ．任選地，進(jìn)行權(quán)利要求1～12任一項(xiàng)的本發(fā)明方法的說明。
14．權(quán)利要求13的試劑盒，其中所述乙酰肝素酶底物是標(biāo)記的底物。
15．權(quán)利要求14的試劑盒，其中所述乙酰肝素酶底物是放射性標(biāo)記底物。
16．權(quán)利要求13～15任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述乙酰肝素酶底物是硫酸乙酰肝素。
17．權(quán)利要求16的試劑盒，其中所述硫酸乙酰肝素是豬粘膜硫酸乙酰肝素或牛腎硫酸乙酰肝素。
18．權(quán)利要求17的試劑盒，其中所述硫酸乙酰肝素是3H豬粘膜硫酸乙酰肝素或3H牛腎硫酸乙酰肝素。
19．權(quán)利要求13～18任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述硫酸乙酰肝素結(jié)合蛋白是富含組氨酸的糖蛋白。
20．權(quán)利要求19的試劑盒，其中所述富含組氨酸的糖蛋白是雞富含組氨酸的糖蛋白。
21．權(quán)利要求13～20任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述硫酸乙酰肝素結(jié)合蛋白被固定化。
22．權(quán)利要求21的試劑盒，其中所述硫酸乙酰肝素結(jié)合蛋白是通過結(jié)合到瓊脂糖珠上而被固定化的。
23．從含乙酰肝素酶的物質(zhì)純化哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶的方法，該方法包括如下步驟ⅰ．在去污劑存在下將含乙酰肝素酶的物質(zhì)與固定化凝集素親和層析基質(zhì)接觸，使乙酰肝素酶活性結(jié)合到所述基質(zhì)上；ⅱ．從所述基質(zhì)洗脫第一個(gè)含純化的乙酰肝素酶的級分；ⅲ．任選將所述第一個(gè)含純化的乙酰肝素酶的級分與固定化金屬離子親和層析基質(zhì)接觸；ⅳ．將所述第一個(gè)含純化的乙酰肝素酶的級分與染料-樹脂基質(zhì)接觸，使乙酰肝素酶活性結(jié)合到所述染料-樹脂基質(zhì)上；以及ⅴ．從所述染料-樹脂基質(zhì)洗脫第二個(gè)含純化的乙酰肝素酶的級分。
24．權(quán)利要求23的方法，其中所述含乙酰肝素酶的物質(zhì)包括人血小板。
25．權(quán)利要求23或24的方法，其中所述固定化凝集素親和層析基質(zhì)包括伴刀豆球蛋白A-Sepharose基質(zhì)。
26．權(quán)利要求23～25任一項(xiàng)的方法，其中所述去污劑包括Triton X-100。
27．權(quán)利要求22～26任一項(xiàng)的方法，其中所述固定化金屬離子親和層析基質(zhì)包括Zn2+-螯合Sepha-rose基質(zhì)。
28．權(quán)利要求22～27任一項(xiàng)的方法，其中所述染料樹脂基質(zhì)包括Blue A-樹脂或Reactive Red-樹脂基質(zhì)。
29．權(quán)利要求28的方法，其中所述染料-樹脂基質(zhì)中的樹脂包括瓊脂糖、Sepharose或丙烯酰胺。
30．權(quán)利要求22～29任一項(xiàng)的方法，它包括進(jìn)一步的步驟，即將第二個(gè)含純化的乙酰肝素酶的級分與辛基瓊脂糖基質(zhì)接觸以除去污染蛋白。
31．權(quán)利要求23～30任一項(xiàng)的方法，它包括進(jìn)一步的步驟，即純化所述第二個(gè)含純化的乙酰肝素酶的級分或者凝膠過濾層析。
32．權(quán)利要求31的方法，其中所述凝膠過濾層析包括Superose 12層析。
33．通過權(quán)利要求23～32任一項(xiàng)的方法制備的充分純化的哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶。
34．充分純化的人血小板乙酰肝素酶，其特征在于?。ㄟ^凝膠過濾層析和通過SDS-PAGE進(jìn)行分析時(shí)它的本征分子質(zhì)量(Mr)約為50kDa；以及ⅱ．它既降解肝素也降解硫酸乙酰肝素。
35．權(quán)利要求34的充分純化的人血小板乙酰肝素酶，其特征在于，通過凝膠過濾分析得知，它將牛肺和豬粘膜肝素從12kDa分別降解至6和4kDa片段，并以逐步方式將豬粘膜硫酸乙酰肝素從22kDa降解至5kDa片段。
全文摘要
檢測樣品(如哺乳動(dòng)物組織、細(xì)胞或體液)中的哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶活性的方法;以及從含乙酰肝素酶的物質(zhì)(如人血小板)純化哺乳動(dòng)物乙酰肝素酶的方法。
文檔編號G01N33/566GK1230219SQ97197897
公開日1999年9月29日 申請日期1997年7月18日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月18日
發(fā)明者C·G·福里曼, C·R·帕里什 申請人:澳大利亞國立大學(xué)