本發(fā)明屬于理化分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種同時測定煙草及煙草制品中12種生物堿的方法。

背景技術(shù)：

生物堿是指一類存在于生物體內(nèi)的含有氮雜環(huán)的有機(jī)化合物（蛋白質(zhì)、鈦類、氨基酸、氨、氨基糖、核苷酸、核酸除外），一般具有堿性并表現(xiàn)出生理活性。生物堿在煙草及其制品中具有特殊的地位，它不僅是煙草重要的品質(zhì)因素，而且規(guī)定了煙草作為一種商品的特質(zhì)。煙堿占煙草總生物堿的比例一般在92%以上，人們吸食煙草很大程度上是為了獲取煙堿，所以是煙草中最重要的生物堿，它的存在賦予煙草及其制品以獨(dú)特的魅力。除煙堿外，煙草中還含有其他次要生物堿，在煙草中含量較多、人們研究較多的生物堿主要有降煙堿、新煙草堿、假木賊堿、麥斯明等，這些次要生物堿也具有一定的生物活性，且是煙草及煙草制品中重要致癌物——煙草特有亞硝胺（tsnas）的直接前體物質(zhì)。此外，煙草中煙堿之外的次要生物堿研究還是判定電子煙等新型煙草制品中煙堿來源的重要特征性指標(biāo)，這對電子煙等產(chǎn)品的管制有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

目前，測定煙草及煙草制品中生物堿的方法主要有氣相色譜法（gc-fid/npd/ncd）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（gc-ms）、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（gc-ms/ms）高效液相色譜法（hplc-uvd）、毛細(xì)管電泳法（cze-uvd）等。但是，這些研究的次要生物堿主要集中在降煙堿、新煙草堿、假木賊堿、麥斯明等，而對其他次要生物堿的研究較少。例如，當(dāng)前文獻(xiàn)報道測定煙草中生物堿數(shù)量最多為8種，使用的是gc-ncd方法（anal.methods.2012;4(7):2095-2100.）和lc-ms/ms方法（j.chromatogr.sci.2015;53(10):1730-1736.），但是gc-ncd方法選擇性不是很好，容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，而lc-ms/ms對部分目標(biāo)物的檢出限偏高，且分離效果不理想。lisko等使用gc-ms/ms分析煙草中的生物堿（降煙堿、新煙堿、麥斯明、假木賊堿、2,3’-聯(lián)吡啶），但目標(biāo)物僅有5個（anal.chem.2013;85(6):3380-3384.）?，F(xiàn)行國內(nèi)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)為5種生物堿（煙堿、降煙堿、新煙堿、麥斯明、假木賊堿），cpresta推薦方法為2種生物堿（降煙堿、假木賊堿），并都使用gc-ms作為儀器分析方法，所以，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法由于其強(qiáng)大的分離能力及定性定量能力，是生物堿分析最常用的儀器分析方法，所以綜合考慮到儀器普適性、選擇性及靈敏度，最終選擇naoh水溶液+有機(jī)溶劑萃取的前處理方法，選擇gc-ms作為分析儀器。

所以，為了實(shí)現(xiàn)更高通量的次要生物堿分析要求，我們根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研，對次要生物堿指標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)展，最終確定了12種生物堿作為研究對象，并首次建立了gc-ms同時測定煙草及煙草制品中12種煙草生物堿的方法，具體包括煙堿、n-甲基假木賊堿、降煙堿、麥斯明、假木賊堿、β-二烯煙堿、新煙草堿、2,3’-聯(lián)吡啶、β-二烯降煙堿、可替寧、哈爾堿、煙臺林等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的正是基于上述技術(shù)不足，建立了一種同時測定煙草及煙草制品中12種生物堿的gc-ms高通量檢測方法。本方法經(jīng)過一次樣品前處理過程即可同時測定煙草及煙草制品中的12種生物堿，具有操作簡便、通量高、靈敏度高、回收率及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

一種同時測定煙草及煙草制品中12種生物堿的方法，所述12種生物堿分別為：煙堿、n-甲基假木賊堿、降煙堿、麥斯明、假木賊堿、β-二烯煙堿、新煙草堿、2,3’-聯(lián)吡啶、β-二烯降煙堿、可替寧、哈爾堿、煙臺林，使用5%的氫氧化鈉溶液先將目標(biāo)樣品中的生物堿游離出來，再用二氯甲烷/甲醇混合溶液(v二氯甲烷/v甲醇=4:1)進(jìn)行液液萃取，以氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行測定，內(nèi)標(biāo)法定量，具體包括以下步驟：

1）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備

分別制備具有5級濃度梯度的煙堿標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，具有6級濃度梯度的降煙堿標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及具有12級濃度梯度的其他10種次要生物堿標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中，煙堿的定量采用喹啉作為內(nèi)標(biāo)，降煙堿的定量采用降煙堿-2,4,5,6-d4作為內(nèi)標(biāo)，其它次要生物堿的定量采用2,2’-聯(lián)吡啶-d8作為內(nèi)標(biāo)；

2）樣品前處理

準(zhǔn)確稱取0.1-0.5g煙草樣品于15ml塑料離心管中，再分別加入內(nèi)標(biāo)溶液和5%氫氧化鈉溶液，震蕩混勻后，靜置約20min。然后加入5-10ml二氯甲烷/甲醇混合溶液(v二氯甲烷/v甲醇=4:1)，加蓋密封后置于渦旋振蕩器中，以500-2500rpm的速度渦旋振蕩提取40-60min。以10000rpm的速度離心5min后，取下層有機(jī)相轉(zhuǎn)移到色譜分析瓶中進(jìn)行g(shù)c-ms分析，

3）氣相色譜-質(zhì)譜分析

利用氣相色譜儀配備質(zhì)譜檢測器對所制待測樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行分析，得到相關(guān)色譜圖，其中，煙堿和11種次要生物堿分析分別采用兩種不同的分析步驟；

4）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及結(jié)果計算。

本發(fā)明更具體地說包括以下內(nèi)容：

1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.1內(nèi)標(biāo)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取約5.0g喹啉、100.0mg降煙堿-2,4,5,6-d4、100.0mg2,2’-聯(lián)吡啶-d8于50ml棕色容量瓶中，以甲醇定容，即得內(nèi)標(biāo)儲備液。喹啉作為煙堿內(nèi)標(biāo)，降煙堿-2,4,5,6-d4作為降煙堿內(nèi)標(biāo)，而2,2’-聯(lián)吡啶-d8作為其他10種次要生物堿內(nèi)標(biāo)。將內(nèi)標(biāo)儲備液以甲醇稀釋5倍，即得到內(nèi)標(biāo)溶液。

1.2一級標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

1.2.1一級煙堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

準(zhǔn)確稱取約1000.0mg煙堿，置于10ml的棕色容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度。該溶液應(yīng)在4℃～8℃條件下避光保存。

1.2.2一級11種次要生物堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

分別準(zhǔn)確稱取約20.0mg次要生物堿，置于10ml的棕色容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度。該溶液應(yīng)在4℃～8℃條件下避光保存。

1.3二級標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

1.3.1二級煙堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

準(zhǔn)確移取約1.0ml一級煙堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于10ml的棕色容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度。該溶液應(yīng)在4℃～8℃條件下避光保存。

1.3.2二級11種次要生物堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

準(zhǔn)確移取約0.1ml一級11種次要生物堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于10ml的棕色容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度。該溶液應(yīng)在4℃～8℃條件下避光保存。

1.4標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

1.4.1煙堿標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

分別準(zhǔn)確移取100μl、200μl、500μl、1000μl、2000μl的二級煙堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液于不同的10ml棕色容量瓶中，再分別準(zhǔn)確加入50μl內(nèi)標(biāo)溶液，用二氯甲烷稀釋定容至刻度，即得到5個不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4.211種次要生物堿標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

分別準(zhǔn)確移取10μl、20μl、50μl、100μl、200μl、500μl的二級11種次要生物堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液及10μl、20μl、50μl、100μl、200μl、500μl的一級11種次要生物堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液于不同的10ml棕色容量瓶中，再分別準(zhǔn)確加入50μl內(nèi)標(biāo)溶液，用二氯甲烷稀釋定容至刻度，即得到12個不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2儀器分析條件

所述方法的儀器分析條件為：

色譜柱：db-35ms毛細(xì)管色譜柱，固定相：（35%-苯基）-甲基聚硅氧烷，規(guī)格：30m×0.25mm×0.25μm。

進(jìn)樣口溫度：250℃；進(jìn)樣量：1μl；載氣：氦氣（純度≥99.999%），恒流模式，流速：1.0ml/min。

采用兩針進(jìn)樣，分別按照兩組升溫程序運(yùn)行：

煙堿柱升溫程序：分流進(jìn)樣（分流比：100:1）；溶劑延遲：5min；升溫程序：初始溫度80℃，保持1min，以20℃/min的速率至200℃，再以40℃/min的速率至250℃，保持5min。運(yùn)行總時間為13.25min。

次要生物堿堿柱升溫程序：分流進(jìn)樣（分流比：10:1）；溶劑延遲：12min；升溫程序：初始溫度80℃，保持1min，以8℃/min的速率至250℃，保持1min，再以40℃/min的速率至280℃，保持5min。運(yùn)行總時間為29min。

電離方式：電子轟擊源（ei）；電離能量：70ev；傳輸線溫度：280℃；離子源溫度：250℃；掃描離子范圍：80～250amu；質(zhì)譜掃描方式：選擇離子監(jiān)視方式（sim）掃描，目標(biāo)物及內(nèi)標(biāo)的保留時間、定量及定性選擇離子參數(shù)如表1所示。

3樣品前處理

3.1萃取溶劑的選擇

選擇正己烷、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷五種溶劑進(jìn)行萃取效率的比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正己烷對大部分次要生物堿的萃取效率都較差，甲基叔丁基醚對β-二烯煙堿及可替寧的萃取效果很差，乙酸乙酯對可替寧的萃取效果較差，而三氯甲烷作萃取劑時，降煙堿、假木賊堿及新煙草堿的萃取效率極差，可能是目標(biāo)化合物發(fā)生了分解，二氯甲烷對所有目標(biāo)化合物的綜合萃取效率最高（圖4）。根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研，在二氯甲烷中加入甲醇會提高二氯甲烷對生物堿的萃取效率，所以，研究比較了二氯甲烷與甲醇不同比例時萃取溶劑對生物堿的萃取效率（v二氯甲烷/v甲醇=1:0、5:1、4:1、3:1、2:1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)二氯甲烷與甲醇體積比為4:1時，對生物堿的綜合萃取效率最高（圖5），故選擇v二氯甲烷/v甲醇=4:1為最終的萃取溶劑。

3.2naoh水溶液濃度的選擇

煙草中的生物堿需要加入一定量的堿性溶劑，才能夠?qū)⑵渲薪Y(jié)合態(tài)的生物堿游離出來。實(shí)驗(yàn)中分別加入2ml0.5%、1%、2%、5%、10%四種濃度的naoh水溶液進(jìn)行比較，結(jié)果表明5%naoh水溶液的綜合萃取效率最高，避免了較低naoh濃度的相對低萃取效率，又避免了高naoh濃度可能帶來的乳化現(xiàn)象（圖6）。

3.3不同提取方式及提取時間的選擇

對超聲提取、機(jī)械振蕩、渦旋振蕩三種提取方式進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲振蕩的效果略差，而機(jī)械振蕩提取和渦旋振蕩提取的差異不是很明顯，考慮到前處理過程中的便捷性，最終選擇渦旋振蕩方式（圖7）。并對渦旋振蕩時間進(jìn)行了考察，對10min、20min、30min、40min、50min、60min進(jìn)行比較，最終選擇的振蕩時間為40min（圖8）。

3.4萃取溶液放置時間對測定結(jié)果的影響

將萃取溶液裝入色譜瓶中，并在室溫放置（約20^oc），考察放置時間對測定結(jié)果的影響（圖9）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著放置時間的延長，萃取溶液中的目標(biāo)化合物含量沒有發(fā)生明顯變化，這說明目標(biāo)化合物在萃取溶液中穩(wěn)定性較好。

因此，經(jīng)過前處理方法的優(yōu)化，前處理?xiàng)l件最終確定為：

準(zhǔn)確稱取約300mg煙草樣品于15ml塑料離心管中，再分別加入50μl內(nèi)標(biāo)溶液和2.0ml5%的naoh水溶液，震蕩混勻后，靜置約20min。然后加入10.0ml二氯甲烷/甲醇混合溶液（v二氯甲烷/v甲醇=4:1），加蓋密封后置于渦旋振蕩器中，以2000rpm的速度渦旋振蕩提取40min。以10000rpm的速度離心5min后，取下層有機(jī)相轉(zhuǎn)移到色譜分析瓶中進(jìn)行g(shù)c-ms分析。

4加標(biāo)回收率和精密度

在優(yōu)化條件下，分別按照低、中、高3種水平加入12種煙草生物堿標(biāo)準(zhǔn)品，每個添加水平重復(fù)測定5次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。由表可知，12種煙草生物堿的加標(biāo)回收率在83.36%~111.88%之間，精密度不高于7.93%。

5線性范圍和檢出限

本研究采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，以各目標(biāo)化合物的濃度(mg/ml或μg/ml)為橫坐標(biāo)，分析物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。在優(yōu)化條件下，考慮到煙草及煙草制品中目標(biāo)化合物的濃度范圍，確定了方法的線性范圍，并按照目標(biāo)物信噪比為3時對應(yīng)的濃度作為檢出限，如表3所示。由表可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)不低于0.997，方法檢出限在0.025~0.620μg/g。

總之，建立了一種同時測定煙草及煙草制品中12種生物堿的gc-ms高通量檢測方法，本方法對萃取溶劑、堿液、萃取方式、萃取時間等前處理?xiàng)l件進(jìn)行了優(yōu)化，并對儀器參數(shù)也進(jìn)行了優(yōu)化和確定，如色譜分離條件、質(zhì)譜條件（定量及定性離子等），本方法優(yōu)化后，經(jīng)過一次樣品前處理過程即可同時測定煙草及煙草制品中的12種生物堿，具有前處理過程操作簡便、分析方法通量高、回收率及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1為煙堿標(biāo)準(zhǔn)工作溶液選擇離子流圖。

圖2為11種次要生物堿標(biāo)準(zhǔn)工作溶液選擇離子流圖，

圖2中：1：n-甲基假木賊堿；2：降煙堿及降煙堿-2,4,5,6-d4；3：麥斯明；4：2,2’-聯(lián)吡啶-d8；5：假木賊堿；6：β-二烯煙堿；7：新煙草堿；8：2,3’-聯(lián)吡啶；9：β-二烯降煙堿；10：可替寧；11：哈爾堿；12：煙臺林。

圖3為12種生物堿及其結(jié)構(gòu)式。

圖4為不同萃取溶劑對目標(biāo)化合物的萃取效率示意圖（經(jīng)歸一化）。

圖5為二氯甲烷中加入不同比例甲醇后對目標(biāo)化合物的萃取效率示意圖（經(jīng)歸一化）。

圖6為不同濃度naoh溶液對目標(biāo)化合物的萃取效率示意圖（經(jīng)歸一化）。

圖7為不同提取方式對目標(biāo)化合物的萃取效率示意圖（經(jīng)歸一化）。

圖8為渦旋振蕩提取時間對目標(biāo)化合物的萃取效率示意圖（經(jīng)歸一化）。

圖9為萃取溶液放置時間對目標(biāo)化合物的影響示意圖（經(jīng)歸一化）。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明通過以下具體實(shí)施例作進(jìn)一步描述，但不限制本發(fā)明。

實(shí)施例1：

1、儀器及試劑

儀器：氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國agilent7890b-5977a型）；sm450直線型吸煙機(jī)(英國斯茹林公司)；ae163電子天平（感量：0.0001g，瑞士mettler公司）；talboys數(shù)顯型多管式旋渦混合器；離心機(jī)（3-30k，sigma）。

試劑耗材：降煙堿由alfa購得，其他11種煙草生物堿均由trc購得，喹啉（alfa），降煙堿-2,4,5,6-d4（cdnisotopes），2,2’-聯(lián)吡啶-d8（cdnisotopes），甲醇（duksan，色譜純），二氯甲烷（duksan，色譜純），氫氧化鈉（國藥，分析純），所用水由milli-q系統(tǒng)（milford，ma，usa）制得。

2、樣品前處理

準(zhǔn)確稱取約300mg煙草樣品于15ml塑料離心管中，再分別加入50μl內(nèi)標(biāo)儲備液和2.0ml5%的氫氧化鈉溶液，震蕩混勻后，靜置約20min。然后加入10.0ml二氯甲烷/甲醇混合溶液（v二氯甲烷/v甲醇=4:1），加蓋密封后置于渦旋振蕩器中，以2000rpm的速度渦旋振蕩提取40min。以10000rpm的速度離心5min后，取下層有機(jī)相轉(zhuǎn)移到色譜分析瓶中進(jìn)行g(shù)c-ms分析。

3、儀器分析條件

所述方法的儀器分析條件為：

色譜柱：db-35ms毛細(xì)管色譜柱，固定相：（35%-苯基）-甲基聚硅氧烷，規(guī)格：30m×0.25mm×0.25μm。

進(jìn)樣口溫度：250℃；進(jìn)樣量：1μl；載氣：氦氣（純度≥99.999%），恒流模式，流速：1.0ml/min。

煙堿柱升溫程序：分流進(jìn)樣（分流比：100:1）；溶劑延遲：5min；升溫程序：初始溫度80℃，保持1min，以20℃/min的速率至200℃，再以40℃/min的速率至250℃，保持5min。運(yùn)行總時間為13.25min。

次要生物堿堿柱升溫程序：分流進(jìn)樣（分流比：10:1）；溶劑延遲：12min；升溫程序：初始溫度80℃，保持1min，以8℃/min的速率至250℃，保持1min，再以40℃/min的速率至280℃，保持5min。運(yùn)行總時間為29min。

電離方式：電子轟擊源（ei）；電離能量：70ev；傳輸線溫度：280℃；離子源溫度：250℃；掃描離子范圍：80～250amu；質(zhì)譜掃描方式：選擇離子監(jiān)視方式（sim）掃描，目標(biāo)物及內(nèi)標(biāo)的保留時間、定量及定性選擇離子參數(shù)如表1所示。

根據(jù)上述測定方法，選擇5種煙草及煙草制品樣品，測得12種生物堿含量如下表所示（單位：μg/g）：