重組免疫毒素Gigantoxin-4-4D5 scFv及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)，特別涉及一種重組免疫毒素 Gigantoxin-4-4D5 scFv 及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤已成為威脅人類健康的最重要疾病之一，特別是在我國，腫瘤已經(jīng)超過 心血管疾病成為造成最多死亡人數(shù)的頭號(hào)殺手。
[0003] 目前治療腫瘤的方法主要為化療和放療，但是常規(guī)放化療基本不具備針對(duì)腫瘤的 特異性，放化療在破壞癌細(xì)胞的同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞也產(chǎn)生殺傷作用，從而對(duì)人體產(chǎn)生很大的 毒副作用，同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致宿主免疫系統(tǒng)的破壞，放化療后易引起多種并發(fā)癥而且腫瘤易復(fù) 發(fā)，常規(guī)放化療的特點(diǎn)造成腫瘤治療的療效和預(yù)后都不理想。腫瘤分子靶向治療是根據(jù)腫 瘤上的分子靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的藥物來抑制腫瘤細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移、清除腫瘤細(xì)胞的方法，與其它治療 手段相比，腫瘤分子靶向治療具有作用特異性高、范圍廣泛、毒副作用小等特點(diǎn)。
[0004] 人類表皮生長因子受體2 (HER-2)屬于跨膜酪氨酸激酶受體家族的成員，HER-2蛋 白通常只在胎兒時(shí)期表達(dá)，成年以后只在極少數(shù)組織內(nèi)低水平表達(dá)。然而HER-2卻在多種 人類腫瘤中過度表達(dá)，如乳腺癌（25-30% )、轉(zhuǎn)移性導(dǎo)管癌（60-70% )、膀胱癌（27-63% )、 胰腺癌（31-80% )、非小細(xì)胞肺癌（13-55% )、卵巢癌（18-43% )等。
[0005] 抗冊1?2單鏈抗體（4058〇?￥)由重鏈可變區(qū)（￥!1)和輕鏈可變區(qū)（￥1^)2個(gè)抗原特 異性結(jié)合片段經(jīng)過一個(gè)柔性鉸鏈連接而成，具有較好的血清及熱穩(wěn)定性，并與有HER2較高 的選擇性結(jié)合能力。
[0006] Gigantoxin-4是從?？鸖tichodactyla gigantea提取的一種溶細(xì)胞素，能夠通 過裂解細(xì)胞膜而發(fā)揮細(xì)胞毒作用。避免了其他一些毒素需通過細(xì)胞內(nèi)化而帶來的抗腫瘤效 率低及后續(xù)的耐藥性。
[0007] 目前，還沒有利用抗人表皮生長因子受體2單鏈抗體4D5 SCFv融合海葵溶細(xì)胞素 Gigantoxin-4治療腫瘤的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的，就是為了提供一種重組免疫毒素 Gigantoxin-4_4D5 scFv及其制 備方法和用途。
[0009] 本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：一種重組免疫毒素 Gigantoxin-4_4D5 scFv，由抗 HER-2 單鏈抗體 4D5 scFv 和?？芗?xì)胞素 Gigantoxin-4 融 合表達(dá)形成。
[0010] 上述的 Gigantoxin-4_4D5 scFv 運(yùn)用（G4S) 3 柔性 linker 連接。
[0011] 編碼重組免疫毒素 Gigantoxin-4-4D5 scFv的基因，采用PCR擴(kuò)增方法得到改造 后的4D5 scFv及Gigantoxin-4基因，并采用融合PCR將（G4S) 3柔性linker連接兩段基 因，最后得到完整的編碼Gigantoxin-4-(G4S) 3-4D5 scFv基因。
[0012] 一種載體，含有Gigantoxin-4_(G4S) 3-4D5 scFv基因，該載體是在 Gigantoxin-4-(G4S)3-4D5 scFv基因前面加上了小分子泛素類修飾蛋白SUM0,促進(jìn)蛋白的 可溶表達(dá)及正確折疊，并構(gòu)建到含有T7啟動(dòng)子的PET28a(+)表達(dá)載體上。
[0013] 一種含有權(quán)利要求4所述載體的宿主細(xì)胞E. coli BL21 (DE3)pLysS。
[0014] 上述重組免疫毒素 Gigantoxin-4_4D5 scFv的制備方法，包括以下步驟：
[0015] (1)將含有SUM0-Gigantoxin-4-4D5 scFv基因的重組大腸桿菌在37°C培養(yǎng)，當(dāng) OD6。。達(dá)到0. 2-1. 5時(shí)，加入終濃度為0. 05-0. 4mM的異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷， 16_37°C誘導(dǎo) 10_25h，異源表達(dá) SUM〇-Gigantoxin-4_4D5 scFv，離心，破碎，取上清；
[0016] (2)將步驟（1)的上清利用His標(biāo)簽的親和層析分離純化SUM0-Gigantoxin-4-4D5 scFv ；
[0017] (3)將步驟（2)中的融合蛋白利用SUMO蛋白酶20-37°C酶切2-8h，再一次利用鎳 柱分離純化，收集穿出液；
[0018] (4)將步驟（3)中的穿出液利用20mM磷酸二氫鈉緩沖液4°C透析3次，每次至少 4h，利用羧甲基瓊脂糖凝膠柱層析，并用相同pH下含有10-30mM的磷酸二氫鈉的梯度氯化 鈉濃度緩沖液洗脫。
[0019] 重組免疫毒素 Gigantoxin-4-4D5 scFv在治療卵巢癌SK-0V-3中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明具有以下的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)：
[0021] (1)傳統(tǒng)毒素存在細(xì)胞內(nèi)化問題導(dǎo)致抗腫瘤效率低，本發(fā)明所用毒素作用于細(xì)胞 膜，不存在內(nèi)化問題，抗腫瘤效率高；
[0022] (2)本發(fā)明所采用的制備方法簡單可行，生產(chǎn)成本低；
[0023] (3)本發(fā)明的免疫毒素主要是通過作用于細(xì)胞膜而發(fā)揮抗腫瘤作用，很難產(chǎn)生耐 藥性。
[0024] (4)本發(fā)明將抗HER-2單鏈抗體4D5 scFv創(chuàng)造性地與?？芗?xì)胞素 Gigantoxin-4 融合，組成了一種新型的免疫毒素，能與腫瘤細(xì)胞表面的抗原結(jié)合并起到殺傷腫瘤的作用， 具有很強(qiáng)的特異性，毒副作用小，抗腫瘤效果明顯，具有很好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】：
[0025] 圖1為重組免疫毒素的Gigantoxin-4_4D5 scFv質(zhì)粒構(gòu)建不意圖；
[0026] 圖 2 為 SDS-PAGE 驗(yàn)證 SUM0-Gigantoxin-4-4D5 scFv 表達(dá)情況；
[0027] 圖 3 為 SUM〇-Gigantoxin-4_4D5 scFv 銀柱純化結(jié)果；
[0028] 圖4為SUM〇-Gigantoxin-4_4D5 scFv酶切后銀柱純化結(jié)果；
[0029] 圖5為Gigantoxin-4_4D5 scFv經(jīng)離子交換層析純化結(jié)果；
[0030] 圖6為純化的蛋白卵巢癌SK-0V-3細(xì)胞的增殖抑制作用，其中，圖6A為 Gigantoxin-4,圖 6B 為 Gigantoxin-4_4D5 scFv ；
[0031] 圖7為純化的蛋白對(duì)人胚腎293細(xì)胞（HEK-293)的增殖抑制作用，其中，圖7A為 Gigantoxin-4,圖 7B 為 Gigantoxin-4_4D5 scFv ；
[0032] 圖8為純化的蛋白對(duì)正常人的紅細(xì)胞溶血作用；
[0033] 圖9為檢測Gigantoxin-4-4D5 scFv對(duì)HER-2表達(dá)陽性的腫瘤細(xì)胞SK-0V-3的 靶向性；其中，圖9A為Gigantoxin-4作用于SK-0V-3細(xì)胞；圖9B為Gigantoxin-4-4D5 scFv作用于SK-0V-3細(xì)胞；圖9C為Gigantoxin-4作用于HEK-293細(xì)胞；圖9D為 Gigantoxin-4_4D5 scFv 作用于 HEK-293 細(xì)胞。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 圖1為重組免疫毒素的Gigantoxin-4-4D5 scFv質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。
[0035] 實(shí)施例1重組免疫毒素 Gigantoxin-4_4D5scFv的制備
[0036] 本實(shí)施例1是在以下實(shí)施條件和技術(shù)要求條件下實(shí)施的：
[0037] (1)構(gòu)建 pET28a (+)/SUM〇-Gigantoxin-4_4D5 scFv 重組質(zhì)粒
[0038] A、SUM0-Gigantoxin-4-4D5 scFv基因片段的克隆。根據(jù)各片段模版及要加入的 linker(G4S)3所設(shè)計(jì)的引物如表1所示：
[0039] 表 1
[0041] 用 Cl 和 C2、C3 和 B2、B3 和 M 分別以 SUM0、Gigantoxin-4、4D5scFv 為模板 PCR 出 相應(yīng)片段，linker(G4S)3的基因已設(shè)計(jì)到B2和B3引物中，PCR條件為：98°C預(yù)變性lmin， 98°C變性10s，58°C退火30s，72°C延伸30s，循環(huán)35次，最后72°C延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊 脂糖凝膠鑒定，用膠回收試劑盒（Omega)回收各自目的片段。
[0042] 以回收的Gigantoxin-4、4D5scFv片段為模板，以C3和M為引物進(jìn)行PCR，PCR條 件為：98°(：預(yù)變性11^11，98°(：變性1〇8,58°(：退火3〇8,72°(：延伸458，循環(huán)35次，最后72 1€ 延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠鑒定，用膠回收試劑盒回收目的片段。
[0043] 以第一次PCR得到的SUMO片段和第二次融合PCR得到的Gigantoxin-4-4D5scFv 片段為模版，以Cl和M為引物，PCR條件為：98°C預(yù)變性lmin，98°C變性10s，58°C退火30s， 72°C延伸lmin，循環(huán)35次，最后72°C延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠鑒定，用膠回收試 劑盒回收目的片段，此片段即為SUM0-Gigantoxin-4-4D5 scFv。
[0044] B、利用限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I對(duì)基因片段SUM〇-Gigantoxin-4_4d5 scFv 和質(zhì)粒pET28a(+)進(jìn)行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠鑒定及膠回收試劑盒回收后，再用DNA T4連 接酶在22°C下反應(yīng)3h將基因片段及質(zhì)粒連接。最后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)E. coli BL21(DE3) PLysS感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)。涂布含有卡那霉素的平板，16h長出單菌落，挑取陽性克隆，PCR驗(yàn)證 并送公司進(jìn)行測序。
[0045] (2)重組免疫毒素的表達(dá)與純化
[0046] A、重組免疫毒素的表達(dá)
[0047] 將重組菌在37°C培養(yǎng)，當(dāng)OD6。。達(dá)到0. 6時(shí)，加入0.1 mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，18°C誘 導(dǎo)16h后離心收集菌體，超聲破粹后，分別取上清及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE驗(yàn)證重組免疫毒素 表達(dá)形式。如圖2所示，重組免疫毒素以可溶的形式表達(dá)。
[0048] B、重組免疫毒素的純化
[0049] 用10倍柱體積含有20mM咪唑的PB平衡緩沖液（pH 7. 4)平衡HisTrap? HP親 和柱，將破粹的上清液離心，用0. 22 μ m微孔濾膜過濾后，以流速為lmL/min進(jìn)行上樣，重組 免疫毒素因