專利名稱：：干法光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及免疫檢測(cè)試劑盒，具體涉及干法光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒、其制備及其使用方法。
背景技術(shù)：
：光激化學(xué)發(fā)光技術(shù)是一種以高分子微粒為基礎(chǔ)的化學(xué)發(fā)光技術(shù)，它可以通過(guò)感光微粒和發(fā)光微粒在一定距離范圍內(nèi)結(jié)合，產(chǎn)生離子氧能量傳遞，發(fā)出光信號(hào)，從而對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)。感光微粒是填充有感光化合物的高分子微粒，發(fā)光微粒是填充有發(fā)光化合物和鑭系元素的高分子微粒。光激化學(xué)發(fā)光技術(shù)的核心原理是能量的近距離轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移的介質(zhì)是高能態(tài)的離子氧。當(dāng)紅色激光照射感光微粒后，釋放單線態(tài)氧離子(4ys)，其傳播距離為200nm左右，只有當(dāng)感光微粒和發(fā)光微粒的距離足夠接近的情況下，感光微粒釋放的單線態(tài)氧離子才能到達(dá)發(fā)光微粒，從而產(chǎn)生一系列化學(xué)反應(yīng)，發(fā)射出520620nm高能級(jí)的光，由于反應(yīng)體系中，微粒的濃度很低，碰撞幾率非常小，因此本底信號(hào)微弱，只有感光微粒和發(fā)光微粒通過(guò)免疫反應(yīng)結(jié)合以后，才會(huì)發(fā)射出明顯的光，因此系統(tǒng)靈敏度很高。相對(duì)于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析方法，它具有均相(免沖洗)、靈敏度高和操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，并且易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，因此其應(yīng)用前景十分廣闊，具體見(jiàn)《光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)方法》(申請(qǐng)?zhí)?00810036596.5)?，F(xiàn)有的公開(kāi)出版物中，關(guān)于上述技術(shù)的應(yīng)用，微粒及相關(guān)試劑均在液態(tài)條件下保存及運(yùn)輸，在檢測(cè)操作過(guò)程中，需要手動(dòng)或者采用自動(dòng)加樣平臺(tái)將相關(guān)試劑逐個(gè)加入反應(yīng)器皿，操作過(guò)程較為繁瑣，有多個(gè)加樣步驟，需要專業(yè)人員進(jìn)行相關(guān)操作。而本發(fā)明將發(fā)光微粒和試劑直接干燥在反應(yīng)容器中，易于保存運(yùn)輸，并能有效的延長(zhǎng)其有效期，檢驗(yàn)操作簡(jiǎn)便快捷。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種新型的干法光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒及其使用方法。本發(fā)明的原理基于光激化學(xué)發(fā)光技術(shù)原理，在發(fā)光微粒表面包被相應(yīng)檢測(cè)項(xiàng)目的抗原、抗體或者核酸等具有生物活性的物質(zhì)，用生物素標(biāo)記另一配對(duì)的抗原、抗體或者核酸等生物活性分子，利用這兩種試劑與待測(cè)樣品形成夾心或者競(jìng)爭(zhēng)，然后與包被了抗生物素的感光微粒反應(yīng)，通過(guò)光激化學(xué)發(fā)光機(jī)制，對(duì)產(chǎn)生光信號(hào)的強(qiáng)弱進(jìn)行評(píng)價(jià)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)樣品的定量檢測(cè)?！愕墓饧せ瘜W(xué)發(fā)光試劑均為液態(tài)，常規(guī)的反應(yīng)模式為在反應(yīng)杯中依次加入待測(cè)樣品、包被抗體(抗原)的發(fā)光微粒，生物素標(biāo)記的抗體(抗原)等(個(gè)別競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)要加入中和抗原或抗體)，進(jìn)行第一步溫育反應(yīng)，然后加入抗生物素包被的感光微粒，進(jìn)行第二步溫育，讀取光子信號(hào)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線等計(jì)算待測(cè)樣品濃度，直接得到樣品的定量檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明將免疫發(fā)光微粒、生物素標(biāo)記抗體等(個(gè)別競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)包括中和抗原或抗體)試劑干燥固定在反應(yīng)杯的底部，然后封裝，反應(yīng)杯或與其連接支架上可以印上項(xiàng)目名稱編號(hào)、條形碼或點(diǎn)碼等，便于識(shí)別和實(shí)現(xiàn)儀器的自動(dòng)化。樣品測(cè)試時(shí)去除封口，將待測(cè)樣品加入反應(yīng)杯，直接放入檢測(cè)儀器，進(jìn)行第一步溫育反應(yīng)，然后加入抗生物素包被的感光微粒，進(jìn)行第二步溫育，讀取光子信號(hào)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品濃度，直接得到樣品的定量檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明一方面提供了一種干法光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，包括固定有干燥的檢測(cè)微粒和干燥的生物素標(biāo)記的抗原或抗體的反應(yīng)容器，其中，檢測(cè)微粒為包被抗原或抗體的發(fā)光微粒。上述抗原及抗體可以是各種已知的抗原或抗體。由本發(fā)明的原理可知，如被檢測(cè)對(duì)象為抗原，則反應(yīng)容器上應(yīng)當(dāng)相應(yīng)固定有包被該抗原的抗體的發(fā)光微粒和生物素標(biāo)記的該抗原的抗體。如被檢測(cè)對(duì)象為抗體，則反應(yīng)容器上應(yīng)當(dāng)固定有包被該抗體的抗原的發(fā)光微粒和生物素標(biāo)記的該抗體的抗原。較佳的，上述反應(yīng)容器為反應(yīng)杯。較佳的，上述反應(yīng)杯的底部設(shè)有1個(gè)以上隔斷，較佳的隔斷為1-5個(gè)。較佳的，上述反應(yīng)杯還設(shè)有支架。支架可起到操作人員握持方便、儀器準(zhǔn)確定位、條碼掃描記錄樣品編號(hào)及相關(guān)信息等作用。較佳的，上述干法光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒中的反應(yīng)容器密封包裝。上述干法光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒中，固定有干燥檢測(cè)微粒的反應(yīng)容器為在反應(yīng)容器上點(diǎn)入包被抗原或抗體的發(fā)光微粒溶液和生物素標(biāo)記的抗原或抗體溶液后干燥獲得，包被抗原或抗體的發(fā)光微粒溶液或生物素標(biāo)記的抗體溶液的溶劑為緩沖液，緩沖液可以選自HEPES、MES或Tris等，pH為6.0_9.0，且緩沖液中含有多糖，如海藻糖、蔗糖、果糖等，多糖占溶液重量百分比為3%-7%。研究發(fā)現(xiàn)，多糖在緩沖液中有十分重要的作用，在試劑干燥過(guò)程中起到了支撐定型作用，避免試劑分子間由于干燥脫水形成不可逆的結(jié)合而無(wú)法迅速?gòu)?fù)溶。進(jìn)一步的緩沖液中還可包括表面活性劑(如TritonX-100、TritonX_405、Tween20等)、抗生素(如慶大霉素、鏈霉素等)、防腐劑及封閉劑等，還可包括其他促進(jìn)免疫反應(yīng)的物質(zhì)。上述發(fā)光微粒是指填充有發(fā)光化合物和鑭系元素化合物的高分子微粒。發(fā)光化合物可以是Dioxene(二氧雜環(huán)己烯)或thioxene(二甲基噻吩)的衍生物等，鑭系元素化合物可以是Eu(TTA)3/T0P0或Eu(TTA)3/Phen等，發(fā)光微粒表面通過(guò)共價(jià)連接有針對(duì)特定抗原或抗體的抗體或抗原等。本發(fā)明的干法光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒中，除了反應(yīng)容器外，當(dāng)然還可包括其他輔助檢測(cè)的小型工具或獨(dú)立包裝的親和素包被的感光微粒溶液等。本發(fā)明第二方面，公開(kāi)了一種制備上述干法光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的方法，包括下列步驟1.配制包被有抗原或抗體的發(fā)光微粒溶液用適當(dāng)緩沖液將包被有抗原或抗體的發(fā)光微粒稀釋到工作濃度。上述適當(dāng)?shù)木彌_液可以選自HEPES、MES或Tris等，pH為6.0_9.O，且緩沖液中含有多糖，如海藻糖、蔗糖、果糖等，較佳的，多糖占溶液重量百分比為3%-7%。多糖在緩沖液中有十分重要的作用，在試劑干燥過(guò)程中起到了支撐定型作用，避免試劑分子間由于干5燥脫水形成不可逆的結(jié)合而無(wú)法迅速?gòu)?fù)溶。進(jìn)一步的緩沖液中還可包括表面活性劑(如TritonX-100、TritonX-405、Tween20等)、抗生素(如慶大霉素、鏈霉素等)、防腐劑、多糖及封閉劑等，還可包括其他促進(jìn)免疫反應(yīng)的物質(zhì)。2.配制生物素標(biāo)記抗原或抗體溶液用適當(dāng)緩沖液將生物素標(biāo)記抗原或抗體稀釋到工作濃度。上述適當(dāng)?shù)木彌_液可以選自HEPES、MES或Tris等，pH為6.0-9.0，，且緩沖液中含有占溶液重量百分比3%-7%的多糖，如海藻糖、蔗糖、果糖。進(jìn)一步的緩沖液中還可包括表面活性劑(如TritonX-IOO、TritonX_405、Tween20等)、抗生素(如慶大霉素、鏈霉素等)、防腐劑、多糖及封閉劑等，還可包括其他促進(jìn)免疫反應(yīng)的物質(zhì)。3.反應(yīng)容器上試劑點(diǎn)樣；根據(jù)試驗(yàn)需要在樣品杯中采用自動(dòng)點(diǎn)樣儀器或手工點(diǎn)入一定量(點(diǎn)樣量根據(jù)儀器的精度以及操作方便性確定，以便于生產(chǎn)為準(zhǔn))的生物素標(biāo)記抗原或抗體以及包被有抗原或抗體的發(fā)光微粒溶液。4.干燥采用凍干或烘干的方式將上述點(diǎn)有試劑的樣品杯進(jìn)行干燥。為了更好的保持試劑的生物活性及更易于復(fù)溶，優(yōu)選采用凍干方式進(jìn)行干燥。本發(fā)明第三方面提供了上述干法光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的使用方法，包括將樣品加在反應(yīng)容器上。進(jìn)行第一步37攝氏度溫育反應(yīng)，然后加入親和素包被的感光微粒，進(jìn)行第二步37攝氏度溫育，激發(fā)光照射后檢測(cè)光子信號(hào)。上述感光微粒是填充有感光化合物的高分子微粒。在670690nm光激發(fā)下，可以產(chǎn)生單線態(tài)氧離子，當(dāng)其與發(fā)光微粒距離足夠近的情況下，單線氧離子傳遞到發(fā)光微粒，與發(fā)光微粒中的發(fā)光化合物反應(yīng)，產(chǎn)生紫外光，紫外光再進(jìn)一步激發(fā)鑭系元素化合物，產(chǎn)生520620nm波長(zhǎng)光子。感光化合物可以是酞菁染料等。感光微粒表面通過(guò)共價(jià)連接有親和素或者鏈霉親和素，可以與標(biāo)記有生物素的抗體結(jié)合。激發(fā)光的光源波長(zhǎng)范圍為600-700nm。本發(fā)明的方法將待測(cè)樣品中的抗原抗體信息轉(zhuǎn)化成了另一種更為直觀的中間信息即光子信號(hào)信息，利用該方法，經(jīng)過(guò)一系列的研究工作，可獲得光子信號(hào)與待測(cè)抗原或抗體濃度之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，進(jìn)而作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再通過(guò)對(duì)光子信號(hào)與標(biāo)準(zhǔn)曲線的比對(duì)或者與陰陽(yáng)性參考光子信號(hào)的比較檢測(cè)，最終獲得待測(cè)抗原或抗體的定量或定性檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明將針對(duì)不同項(xiàng)目的特異性試劑以干燥固體形式存放于反應(yīng)杯中，儀器只進(jìn)行緩沖液和通用試劑(抗生物素包被的感光微粒)的加入，一方面干式試劑可以有效的延長(zhǎng)試劑盒的有效期，另一方面有效的減少了操作人員的操作步驟，如果需要同時(shí)檢測(cè)多個(gè)項(xiàng)目，采用液態(tài)的模式，就需要針對(duì)不同的檢測(cè)項(xiàng)目加入不同的試劑，操作人員在操作過(guò)程中需要同時(shí)處理多種試劑，手工操作將比較繁瑣，也容易出錯(cuò)，如果采用儀器加樣，則需要配備自動(dòng)加樣工作站，而且需要較為復(fù)雜的加樣參數(shù)設(shè)置；而采用本發(fā)明，操作人員只需要將樣品加入相應(yīng)項(xiàng)目的試劑杯中即可，儀器可以通過(guò)掃描條碼等信息自動(dòng)設(shè)定試驗(yàn)參數(shù)，得到試驗(yàn)結(jié)果，因此說(shuō)，本發(fā)明的試劑盒不僅便于保藏和運(yùn)輸，且靈敏度高，適合待測(cè)抗原或抗體的定量或定性檢測(cè)，也便于多個(gè)項(xiàng)目的同時(shí)檢測(cè)。圖1:雙抗體夾心法檢測(cè)模式A:包被有親和素的感光微粒B:生物素標(biāo)記抗體C:待測(cè)抗原D:包被有抗體的發(fā)光微粒F:發(fā)光免疫復(fù)合體圖2:干式試劑樣品杯A:樣品杯容器部分剖面圖，在樣品杯的底部有一個(gè)小的隔斷，這樣就可以將不同試劑分別固定在樣品杯底部而不會(huì)產(chǎn)生反應(yīng)和非特異性吸附等，如果部分檢測(cè)項(xiàng)目有三個(gè)或三個(gè)以上試劑需要提前固定在試劑杯底部，那么樣品杯底部的隔斷也可以相應(yīng)增加，起到分隔試劑的效果。B:樣品杯全圖(包括外部支架)，樣品杯與支架可以分別為兩個(gè)獨(dú)立的組件，也可以是一個(gè)整體，B圖中為整體設(shè)計(jì)，支架起到操作人員握持方便、儀器準(zhǔn)確定位、條碼掃描記錄樣品編號(hào)及相關(guān)信息等作用。具體實(shí)施例方式以下通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述，但實(shí)施例并非限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1:質(zhì)控微粒的信號(hào)檢測(cè)(1)質(zhì)控微粒的制備a.生物素標(biāo)記的Y-球蛋白(BGG)的制備用0.1MNaHC03將BGG(購(gòu)自Pel-FreezBiological)配制成lmg/ml溶液，采用DMSO(二甲基甲酰胺)配置Biotin-X-X-NHS(N-羥基琥珀酰亞胺修飾生物素，生產(chǎn)商SIGMA，產(chǎn)品號(hào)B3295)溶液至16.172mg/ml，取5.4ulBiotin-X-X-NHS至lmgBGG溶液中，混合均勻并在4t:下放置過(guò)夜。采用lOOmM磷酸緩沖液(pH7.0)透析純化蛋白。b.采用上述標(biāo)記蛋白包被醛基修飾的發(fā)光微粒在lmg醛基修飾的發(fā)光微粒(美國(guó)PentaTek公司)中加入12.51%Tween-20，0.05mg上述步驟1獲得的透析純化的蛋白以及10的NaCNBH3(25mg/ml)，加0.1Mp朋.0MES至總體積為200ii1，37。C避光孵育48h。加入10y1的0.3MCM0溶液，37。C避光孵育lh。加190illpH8.0的Tris溶液。4°C13000g離心30分鐘。棄上清，用1mlpH8.0的Tris溶液再洗一次。用200illpH8.0的Tris溶液懸浮(其終濃度為5mg/ml)。c.質(zhì)控微粒工作液配制采用pH8.0的Tris溶液將b中懸液稀釋到5mg/ml。(2)質(zhì)控微粒溶液的配置采用pH8.0的Tris溶液(含5%的海藻糖)將上述終濃度為5mg/ml的懸液稀釋到20ng/ml，200ng/ml，2ug/ml，20ug/ml，40ug/ml五個(gè)濃度。(3)點(diǎn)樣用10ul移液器，將稀釋后的20ng/ml，200ng/ml，2ug/ml，20ug/ml，40ug/ml五個(gè)濃度的質(zhì)控微粒10ul分別加入到樣品杯中，每個(gè)濃度點(diǎn)10孔。(4)干燥將點(diǎn)有試劑的反應(yīng)杯放入凍干機(jī)中進(jìn)行預(yù)凍，待試劑完全凍結(jié)后進(jìn)行冷凍真空干燥。真空干燥結(jié)束后取出反應(yīng)杯，并用袋中裝有干燥劑的密封袋密封。(5)感光微粒的配制感光微粒采用粒徑為220士40nm的感光微粒(美國(guó)PentaTek公司)制備方法a、感光微?；鞈乙禾幚砦∫欢康母泄馕⒘Ｓ诟咚倮鋬鲭x心機(jī)中離心，棄去上清，加入一定量MES緩沖液，超聲細(xì)胞破碎儀上超聲至微粒重新懸浮，加入MES緩沖液調(diào)節(jié)感光微粒濃度至100mg/ml。b、親和素溶液配制稱量一定量Avidin，加MES緩沖液溶解至8mg/ml。c、混合將處理好的感光微?；鞈乙?、8mg/ml的Avidin以及MES緩沖液，以2:5:1的體積比進(jìn)行混合，迅速混勻，得到反應(yīng)液。d、反應(yīng)MES緩沖液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應(yīng)液1:25的體積比加入，迅速混勻。37t:旋轉(zhuǎn)反應(yīng)48小時(shí)。e、封閉MES緩沖液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應(yīng)液2:1:10的體積比加入上述溶液中，混勻，37t:旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2小時(shí)。再加入200mg/ml的BSA溶液(MES緩沖液)，其與反應(yīng)液體積比為5:8，迅速混勻，37。C旋轉(zhuǎn)反應(yīng)16小時(shí)。清洗向反應(yīng)好的溶液中加入MES緩沖液，高速冷凍離心機(jī)離心，棄上清，加入新鮮MES緩沖液超聲法重新懸浮，再次離心，如此清洗3次，最后用少量的感光試劑緩沖液進(jìn)行懸浮，測(cè)定固含量，用感光試劑緩沖液調(diào)節(jié)濃度至10mg/ml。(5)將干燥后的質(zhì)控微粒進(jìn)行試驗(yàn)，在反應(yīng)杯中加入60ul的感光微粒，溫浴10分鐘后，采用光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀讀數(shù)，結(jié)果如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>結(jié)果顯示干燥后的質(zhì)控微粒的性能靈敏，濃度值與信號(hào)值之間有明顯的相關(guān)性，可用于定量檢測(cè)。實(shí)施例2:HBsAg(乙型肝炎表面抗原)的檢測(cè)(1)生物素標(biāo)記表面抗體溶液的制備與配制制備a、將HBsAb透析于0.1MNaHC03溶液，測(cè)定抗體濃度并調(diào)節(jié)至lmg/ml。b、用DMSO配制16.17mg/ml的Biotin溶液。c、標(biāo)記取處理好的lmg/mlHBsAb標(biāo)記抗體與配制好的Biotin溶液，二者按照72:10000的體積比進(jìn)行混合，迅速混勻。4t:靜置反應(yīng)1216小時(shí)。d、透析將反應(yīng)好的生物素標(biāo)記抗體透析于生物素標(biāo)記透析緩沖液(pH8.00)。e、將透析好的生物素化抗體吸出轉(zhuǎn)移至干凈離心管中，取樣測(cè)定抗體濃度。將質(zhì)檢合格的生物素標(biāo)記抗體濃度調(diào)節(jié)至0.5mg/ml。配制將生物素標(biāo)記表面抗體采用生物素緩沖液(0.02MMES，1%BSA，1%dextran，O.01%慶大霉素、0.1%tween20、0.05%procline、5%的海藻糖)稀釋到3.75ug/ml。(2)表面抗體包被的發(fā)光微粒溶液的制備與配制制備a、發(fā)光微?；鞈乙禾幚砦∫欢康陌l(fā)光微粒于高速冷凍離心機(jī)中離心，棄去上清，加入一定量MES緩沖液，超聲破碎至微粒重新懸浮，加入MES緩沖液調(diào)節(jié)發(fā)光微粒濃度至100mg/ml。b、抗體處理HBsAb于0.05Mp朋.0的MES緩沖液(以下簡(jiǎn)稱MES緩沖液)透析，透析完成后測(cè)定濃度，并調(diào)節(jié)濃度至8mg/ml。c、MES緩沖液、100mg/ml的發(fā)光微?；鞈乙?MES緩沖液)和8mg/ml的抗_HBe(MES緩沖液)以及，以1:2:5的體積比進(jìn)行混合，迅速混勻，得到反應(yīng)液。d、用MES緩沖液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應(yīng)液l:25的體積比加入，迅速混勻，37t:旋轉(zhuǎn)反應(yīng)48小時(shí)。e、MES緩沖液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應(yīng)液2:1:10的體積比加入上述溶液中，混勻，37。C旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2小時(shí)。再加入200mg/ml的BSA溶液(MES緩沖液)，其與反應(yīng)液體積比為5:8，迅速混勻，37t:旋轉(zhuǎn)反應(yīng)16小時(shí)。f、用MES緩沖液離心清洗四次，最后用發(fā)光試劑緩沖液進(jìn)行懸浮，測(cè)定粒徑和固含量，調(diào)節(jié)濃度至10mg/ml。配制將表面抗體包被的發(fā)光微粒采用發(fā)光緩沖液(0.05MHEPES，1%BSA，1%dextran，O.01%慶大霉素、0.1%tween20、0.05%procline、5%的海藻糖)稀釋到375ug/ml。(3)樣品杯中試劑點(diǎn)樣用10ul移液器在反應(yīng)杯中分別點(diǎn)入10ul生物素標(biāo)記表面抗體和表面抗體包被的發(fā)光微粒。(4)干燥將點(diǎn)有試劑的反應(yīng)杯放入凍干機(jī)中進(jìn)行預(yù)凍，待試劑完全凍結(jié)后進(jìn)行冷凍真空干燥。真空干燥結(jié)束后取出樣品杯封口，并用袋中裝有干燥劑的密封袋密封。(5)檢測(cè)結(jié)果將已知濃度的乙肝表面抗原定標(biāo)品6個(gè)分別取10ul加入反應(yīng)杯中，每個(gè)樣品10孔。隨后將反應(yīng)杯在37度條件下溫浴5分鐘，然后加入60ul的感光微粒，溫浴10分鐘后，采用光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀讀數(shù)。性能^\00.2ng/ml5ng/ml50ng/ml250ng/ml500ng/ml信號(hào)均值32012251678581251225432385543cv5.20%4.85%4.23%2.96%2.58%2.03%結(jié)果顯示干式試劑的信號(hào)值與濃度具有明顯的相關(guān)性，隨著濃度值的升高，信號(hào)值逐步升高，同時(shí)精密度CV逐漸降低，批內(nèi)精密度小于10%，可應(yīng)用于乙肝表面抗原的檢實(shí)施例3:cTnl(心肌f丐蛋白I)干式診斷試劑的制備(1)生物素標(biāo)記抗心肌鈣蛋白I抗體溶液制備與配制制備a、將抗心肌蛋白I抗體透析于0.1MNaHC03溶液，測(cè)定抗體濃度并調(diào)節(jié)至9lmg/ml。b、用DMS0配制16.17mg/ml的Biotin溶液。c、標(biāo)記取處理好的lmg/mlHBsAb標(biāo)記抗體與配制好的Biotin溶液，二者按照72:10000的體積比進(jìn)行混合，迅速混勻。4"C靜置反應(yīng)1216小時(shí)。d、透析將反應(yīng)好的生物素標(biāo)記抗體透析于生物素標(biāo)記透析緩沖液(pH8.00)。e、將透析好的生物素化抗體吸出轉(zhuǎn)移至干凈離心管中，取樣測(cè)定抗體濃度。將質(zhì)檢合格的生物素標(biāo)記抗體濃度調(diào)節(jié)至0.5mg/ml。配制將生物素標(biāo)記抗心肌鈣蛋白I抗體采用實(shí)施例2中的生物素緩沖液稀釋到2.5ug/ml。(2)抗心肌鈣蛋白I抗體包被的發(fā)光微粒溶液配制制備a、發(fā)光微?；鞈乙禾幚砦∫欢康陌l(fā)光微粒于高速冷凍離心機(jī)中離心，棄去上清，加入一定量MES緩沖液，超聲破碎至微粒重新懸浮，加入MES緩沖液調(diào)節(jié)發(fā)光微粒濃度至100mg/ml。b、抗體處理抗心肌蛋白I抗體于0.05Mp朋.0的MES緩沖液(以下簡(jiǎn)稱MES緩沖液)透析，透析完成后測(cè)定濃度，并調(diào)節(jié)濃度至8mg/ml。c、MES緩沖液、100mg/ml的發(fā)光微粒混懸液(MES緩沖液)和8mg/ml的抗心肌蛋白I抗體(MES緩沖液)以及，以l:2:5的體積比進(jìn)行混合，迅速混勻，得到反應(yīng)液。d、用MES緩沖液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應(yīng)液l:25的體積比加入，迅速混勻，37。C旋轉(zhuǎn)反應(yīng)48小時(shí)。e、MES緩沖液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應(yīng)液2:1:10的體積比加入上述溶液中，混勻，37t:旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2小時(shí)。再加入200mg/ml的BSA溶液(MES緩沖液)，其與反應(yīng)液體積比為5:8，迅速混勻，37t:旋轉(zhuǎn)反應(yīng)16小時(shí)。f、用MES緩沖液離心清洗四次，最后用發(fā)光試劑緩沖液進(jìn)行懸浮，測(cè)定粒徑和固含量，調(diào)節(jié)濃度至10mg/ml。配制將抗心肌鈣蛋白I抗體包被的發(fā)光微粒采用實(shí)施例2中的發(fā)光緩沖液稀釋到150ug/ml。(3)樣品杯中試劑點(diǎn)樣用10ul移液器在反應(yīng)杯中分別點(diǎn)入10ul生物素標(biāo)記抗心肌鈣蛋白I抗體和抗心肌鈣蛋白I抗體包被的發(fā)光微粒。(4)干燥將點(diǎn)有試劑的反應(yīng)杯放入凍干機(jī)中進(jìn)行預(yù)凍，待試劑完全凍結(jié)后進(jìn)行冷凍真空干燥。真空干燥結(jié)束后取出反應(yīng)杯封口，并用袋中裝有干燥劑的密封袋密封。[OOSS](5)檢測(cè)結(jié)果將已知濃度的心肌蛋白I定標(biāo)品6個(gè)分別取10ul加入反應(yīng)杯中，每個(gè)樣品10孑L。隨后將反應(yīng)杯在37度條件下溫浴5分鐘，然后加入60ul的感光微粒，溫浴10分鐘后，采用光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀讀數(shù)。性能00.1ng/ml1.0ng/ml5.0ng/ml25ng/ml50ng/ml信號(hào)均值1020312025630108752459873821354cv5.85%4.98%4.12%2.75%2.34%1.95%10結(jié)果顯示干式試劑復(fù)溶良好，信號(hào)值與濃度具有明顯的相關(guān)性，隨著濃度值的升高，信號(hào)值逐步升高，同時(shí)精密度CV逐漸降低，批內(nèi)精密度小于10%，可應(yīng)用于心肌蛋白I的檢測(cè)。實(shí)施例4:hs-CRP(人超敏C反應(yīng)蛋白)干式診斷試劑的制備(1)生物素標(biāo)記抗CRP抗體溶液制備及配制制備a、將CRP抗體透析于0.1MNaHC03溶液，測(cè)定抗體濃度并調(diào)節(jié)至lmg/ml。b、用DMSO配制16.17mg/ml的Biotin溶液。c、標(biāo)記取處理好的lmg/mlCRP標(biāo)記抗體與配制好的Biotin溶液，二者按照72:10000的體積比進(jìn)行混合，迅速混勻。4t:靜置反應(yīng)1216小時(shí)。d、透析將反應(yīng)好的生物素標(biāo)記抗體透析于生物素標(biāo)記透析緩沖液(pH8.00)。e、將透析好的生物素化抗體吸出轉(zhuǎn)移至干凈離心管中，取樣測(cè)定抗體濃度。將質(zhì)檢合格的生物素標(biāo)記抗體濃度調(diào)節(jié)至0.5mg/ml。配制將生物素標(biāo)記抗CRP抗體采用實(shí)施例2中的生物素緩沖液稀釋到lOOug/ml。(2)抗CRP抗體包被的發(fā)光微粒溶液配制制備a、發(fā)光微?；鞈乙禾幚砦∫欢康陌l(fā)光微粒于高速冷凍離心機(jī)中離心，棄去上清，加入一定量MES緩沖液，超聲破碎至微粒重新懸浮，加入MES緩沖液調(diào)節(jié)發(fā)光微粒濃度至100mg/ml。b、抗體處理CRP抗體于0.05Mp朋.0的MES緩沖液(以下簡(jiǎn)稱MES緩沖液)透析，透析完成后測(cè)定濃度，并調(diào)節(jié)濃度至8mg/ml。c、MES緩沖液、100mg/ml的發(fā)光微?；鞈乙?MES緩沖液)和8mg/ml的抗-HBe(MES緩沖液)以及，以1:2:5的體積比進(jìn)行混合，迅速混勻，得到反應(yīng)液。d、用MES緩沖液配制25mg/ml的NaBH^N溶液，按照與反應(yīng)液l:25的體積比加入，迅速混勻，37t:旋轉(zhuǎn)反應(yīng)48小時(shí)。e、MES緩沖液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應(yīng)液2:1:10的體積比加入上述溶液中，混勻，37t:旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2小時(shí)。再加入200mg/ml的BSA溶液(MES緩沖液)，其與反應(yīng)液體積比為5:8，迅速混勻，37t:旋轉(zhuǎn)反應(yīng)16小時(shí)。f、用MES緩沖液離心清洗四次，最后用發(fā)光試劑緩沖液進(jìn)行懸浮，測(cè)定粒徑和固含量，調(diào)節(jié)濃度至10mg/ml。配制將抗CRP抗體包被的發(fā)光微粒采用實(shí)施例2中的發(fā)光緩沖液稀釋到600ug/ml。(3)反應(yīng)膜上試劑點(diǎn)樣用10ul移液器在反應(yīng)杯中分別點(diǎn)入10ul生物素標(biāo)記抗CRP抗體和抗CRP抗體包被的發(fā)光微粒。(4)干燥將點(diǎn)有試劑的反應(yīng)杯放入凍干機(jī)中進(jìn)行預(yù)凍，待試劑完全凍結(jié)后進(jìn)行冷凍真空干燥。真空干燥結(jié)束后取出反應(yīng)杯，用袋中裝有干燥劑的密封袋密封。(5)檢測(cè)結(jié)果將已知濃度的hsCRP定標(biāo)品6個(gè)分別取10ul加入反應(yīng)杯中，每個(gè)樣品10孔。隨后將反應(yīng)杯在37度條件下溫浴5分鐘，然后加入60ul的感光微粒，溫浴10分鐘后，采用光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀讀數(shù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>結(jié)果顯示干式試劑復(fù)溶良好，信號(hào)值與濃度具有明顯的相關(guān)性，隨著濃度值的升高，信號(hào)值逐步升高，同時(shí)精密度CV逐漸降低，批內(nèi)精密度小于10%，可應(yīng)用于hsCRP的檢實(shí)施例4:HBcAb(乙肝病毒核心抗體)檢測(cè)(1)生物素標(biāo)記重組乙肝病毒核心抗原溶液配制制備a、將重組乙肝病毒核心抗原透析于0.1MNaHC03溶液，測(cè)定抗原濃度并調(diào)節(jié)至lmg/ml。b、用DMSO配制16.17mg/ml的Biotin溶液。c、標(biāo)記取處理好的lmg/ml標(biāo)記抗原與配制好的Biotin溶液，二者按照72:10000的體積比進(jìn)行混合，迅速混勻。4"C靜置反應(yīng)1216小時(shí)。d、透析將反應(yīng)好的生物素標(biāo)記重組乙肝病毒核心抗原透析于生物素標(biāo)記透析緩沖液(pH8.00)。e、將透析好的生物素化核心抗原吸出轉(zhuǎn)移至干凈離心管中，取樣測(cè)定核心抗原濃度。將質(zhì)檢合格的生物素標(biāo)記核心抗原濃度調(diào)節(jié)至0.5mg/ml。配制采用實(shí)施例2中的稀釋液將乙肝病毒核心抗原液稀釋到10ug/ml。(2)乙肝病毒核心抗體包被的發(fā)光微粒溶液配制制備a、發(fā)光微?；鞈乙禾幚砦∫欢康陌l(fā)光微粒于高速冷凍離心機(jī)中離心，棄去上清，加入一定量MES緩沖液，超聲破碎至微粒重新懸浮，加入MES緩沖液調(diào)節(jié)發(fā)光微粒濃度至100mg/ml。b、抗體處理乙肝病毒核心抗體于O.05Mp朋.0的MES緩沖液(以下簡(jiǎn)稱MES緩沖液)透析，透析完成后測(cè)定濃度，并調(diào)節(jié)濃度至8mg/ml。c、MES緩沖液、100mg/ml的發(fā)光微粒混懸液(MES緩沖液)和8mg/ml的抗-HBe(MES緩沖液)以及，以1:2:5的體積比進(jìn)行混合，迅速混勻，得到反應(yīng)液。d、用MES緩沖液配制25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應(yīng)液l:25的體積比加入，迅速混勻，37t:旋轉(zhuǎn)反應(yīng)48小時(shí)。e、MES緩沖液配制75mg/ml的Gly溶液以及25mg/ml的NaBH3CN溶液，按照與反應(yīng)液2:1:10的體積比加入上述溶液中，混勻，37t:旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2小時(shí)。再加入200mg/ml的BSA溶液(MES緩沖液)，其與反應(yīng)液體積比為5:8，迅速混勻，37t:旋轉(zhuǎn)反應(yīng)16小時(shí)。f、用MES緩沖液離心清洗四次，最后用發(fā)光試劑緩沖液進(jìn)行懸浮，測(cè)定粒徑和固含量，調(diào)節(jié)濃度至10mg/ml。將乙肝病毒核心抗體包被的發(fā)光微粒采用發(fā)光緩沖液稀釋到300ug/ml。(3)樣品杯中試劑點(diǎn)樣用10ul移液器在樣品杯底部不同液槽中分別點(diǎn)入10ul生物素標(biāo)記乙肝核心抗原和乙肝核心抗體包被的發(fā)光微粒。(4)干燥將點(diǎn)有試劑的樣品杯放入凍干機(jī)中進(jìn)行預(yù)凍，待試劑完全凍結(jié)后進(jìn)行冷凍真空干燥。真空干燥結(jié)束后取出樣品杯封口，并用袋中裝有干燥劑的密封袋密封。[Cms](5)檢測(cè)結(jié)果將干式試劑與液態(tài)試劑同時(shí)試驗(yàn)對(duì)比檢測(cè)，顯示干式試劑與液態(tài)試劑各項(xiàng)性能指標(biāo)均與液態(tài)試劑無(wú)明顯差異，檢測(cè)范圍5800ng/ml，且標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，r值大于0.99，批內(nèi)及批間精密度均小于10%。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>結(jié)果顯示干式試劑復(fù)溶良好，信號(hào)值與濃度具有明顯的相關(guān)性，隨著濃度值的升高，信號(hào)值逐步升高，同時(shí)精密度CV逐漸降低，批內(nèi)精密度小于10%，可應(yīng)用于乙肝核心抗體的檢測(cè)。綜上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所述，干式光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法可用于多種物質(zhì)的檢測(cè)及多種形式的檢測(cè)，并且反應(yīng)簡(jiǎn)單、迅速、結(jié)果可靠。以上按照特定模式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了說(shuō)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員自明的變形和改良也都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。權(quán)利要求一種干法光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，包括固定有干燥的檢測(cè)微粒和干燥的生物素標(biāo)記的抗原或抗體的反應(yīng)容器，其中，檢測(cè)微粒為包被抗原或抗體的發(fā)光微粒。2.如權(quán)利要求1所述干法光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)容器為反應(yīng)杯。3.如權(quán)利要求2所述干法光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)杯的底部設(shè)有隔斷。4.如權(quán)利要求2所述干法光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)杯設(shè)有支架。5.如權(quán)利要求1所述干法光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述固定有干燥檢測(cè)微粒的反應(yīng)容器為在反應(yīng)容器上點(diǎn)入包被抗原或抗體的發(fā)光微粒溶液和生物素標(biāo)記的抗原或抗體溶液后干燥獲得。6.如權(quán)利要求5所述干法光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述包被抗原或抗體的發(fā)光微粒溶液或生物素標(biāo)記的抗體溶液的溶劑為緩沖液，緩沖液選自HEPES、MES或Tris，且緩沖液中含有多糖。7.如權(quán)利要求6所述干法光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述多糖占溶液重量百分比為3%-7%。8.如權(quán)利要求6所述干法光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述多糖選自海藻糖、蔗糖或果糖。9.如權(quán)利要求6所述干法光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述緩沖液中還包括表面活性劑、抗生素、防腐劑或封閉劑。10.如權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述干法光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述發(fā)光微粒是指填充有發(fā)光化合物和鑭系元素化合物的高分子微粒。11.如權(quán)利要求i-io中任一權(quán)利要求所述干法光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括下列步驟a.配制包被有抗原或抗體的發(fā)光微粒溶液用緩沖液將包被有抗原或抗體的發(fā)光微粒稀釋到工作濃度；b.配制生物素標(biāo)記抗原或抗體溶液用緩沖液將生物素標(biāo)記抗原或抗體稀釋到工作濃度；c.反應(yīng)容器上試劑點(diǎn)樣采用自動(dòng)點(diǎn)樣儀器或手工點(diǎn)入生物素標(biāo)記抗原或抗體溶液以及包被有抗原或抗體的發(fā)光微粒溶液；d.干燥采用凍干或烘干的方式將上述點(diǎn)有試劑的反應(yīng)容器進(jìn)行干燥。12.如權(quán)利要求11所述干法光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟a和b中的緩沖液選自HEPES、MES或Tris，且緩沖液中含有多糖。13.如權(quán)利要求12所述干法光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于，所述多糖占溶液重量百分比為3%-7%。14.如權(quán)利要求12所述干法光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于，所述多糖選自海藻糖、蔗糖或果糖。15.如權(quán)利要求11所述干法光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于，所述緩沖液中還包括表面活性劑、抗生素、防腐劑或封閉劑。16.如權(quán)利要求1-10中任一權(quán)利要求所述干法光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的使用方法，包括將樣品加至反應(yīng)容器上，進(jìn)行第一步37攝氏度溫育反應(yīng)，然后加入親和素包被的感光微粒，進(jìn)行第二步37攝氏度溫育，激發(fā)光照射后檢測(cè)光子信號(hào)。17.如權(quán)利要求16所述干法光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，所述感光微粒為填充有感光化合物的高分子微粒。18.如權(quán)利要求16所述干法光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，所述激發(fā)光的光源波長(zhǎng)范圍為600-700nm。全文摘要本發(fā)明涉及免疫檢測(cè)試劑盒，公開(kāi)了一種干法光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒及其制備和應(yīng)用。本發(fā)明的干法光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，包括固定有干燥的檢測(cè)微粒和干燥的生物素標(biāo)記的抗原或抗體的反應(yīng)容器，其中，檢測(cè)微粒為包被抗原或抗體的發(fā)光微粒。本發(fā)明的試劑盒可用于待測(cè)抗原或抗體的定量或定性檢測(cè)。文檔編號(hào)G01N21/76GK101750487SQ20081020388公開(kāi)日2010年6月23日申請(qǐng)日期2008年12月2日優(yōu)先權(quán)日2008年12月2日發(fā)明者王海蛟,石曉強(qiáng),趙衛(wèi)國(guó)申請(qǐng)人:博陽(yáng)生物科技(上海)有限公司