本申請要求2014年5月8日提交的題目為快速免疫組織化學測定(RAPIDIMMUNOHISTOCHEMISTRYASSAY)的美國臨時序列號61/990,111的優(yōu)先權，其在此出于所有目的通過引用以其全部并入。
技術領域：
本發(fā)明涉及用于組織的直接免疫組織化學染色的組合物、方法和試劑盒以及其用途。
背景技術：
：在外科手術期間經常地可以將組織活檢樣本從患者移出并且從手術室送至病理實驗室進行分析——例如，通過冷凍組織切片診斷。用于冷凍組織切片診斷的方法學可以由以下步驟組成：在病理實驗室中冷凍組織，對冷凍組織進行切片和進行標準蘇木精和伊紅(H/E)染色。H/E染色是用于幫助醫(yī)學病理學家診斷組織病理的通用技術。但是，H/E染色具有許多限制，其包括，例如，其非特異性地對組織染色并且也不能識別組織中的特異性蛋白。識別組織中的特異性蛋白——例如，通過使用有時被稱為免疫組織化學(IHC)的過程——可以幫助病理學家在術中(intraoperatively)診斷多種組織病理。實例可以包括警戒淋巴結(sentinellymphnode)活檢(用于潛在的轉移癌和黑素瘤)、未分化的腫瘤(潛在的癌、淋巴瘤和黑素瘤)、和邊緣的活檢(觀察切除組織的邊界以確定是否整個腫瘤已被移除)。組織切片的免疫組織化學染色是評估異形組織中蛋白質的存在、或其缺乏和改變的可靠方法。通常地，IHC技術利用抗體來原位探測和顯現(xiàn)細胞抗原。由于蛋白質在組織中通常彌散分布，需要信號放大以顯現(xiàn)細胞抗原。用于信號放大的技術包括，例如，使用與對細胞抗原特異性的一次抗體結合的二次抗體和生物素-抗生物素蛋白系統(tǒng)。二次抗體或生物素-抗生物素蛋白信號放大系統(tǒng)上的顯色或熒光部分用于檢測細胞抗原的存在。IHC技術是有優(yōu)勢的，因為它避免了不需要的解聚作用并且使得在形態(tài)學的背景下評估單個細胞。而且，目標蛋白不由冷凍過程改變，并且因而IHC具有作為用于對切除組織進行術中病理學分析的工具的潛能。但是，當前的IHC技術可能需要60到120分鐘來獲得結果。術中指導方針——比如由美國病理學家學會(CollegeofAmericanPathologists)提供的那些——通常推薦在大約20分鐘內向外科醫(yī)生報告病理數(shù)據(jù)。因此，當前的IHC技術太耗時了而不能用作術中工具。而且，當前的IHC技術可能隱匿(harbor)由使用的信號放大技術引起的假象，例如，二次抗體的非特異性結合或者存在內源性生物素。因此，存在對于改進的IHC技術的需要。IHC技術還用于組織的回顧性分析。大多數(shù)病理學樣本不被制備為冷凍組織，而是被福爾馬林固定和石蠟包埋(FFPE)以允許歸檔存儲并在后來的時間進行組織學分析。由于石蠟包埋的樣本廣泛地可用于回顧性研究，因此對于來自這樣的樣本的蛋白質的定量檢測而言，需要快速和可靠的方法。用于對來自冷凍和石蠟包埋的組織的蛋白質進行定量的組合物和方法對于研究腫瘤組織中的蛋白質表達是尤其需要的。例如，某些受體或酶的表達水平可以指示具體處理的成功可能性。因此，在本領域中還存在對能夠快速地檢測抗原比如腫瘤抗原的靈敏的和定量的IHC方法的需要。技術實現(xiàn)要素：本文提供了用于檢測組織樣本中目標分析物存在或不存在的方法、組合物和試劑盒。本文提供了用于檢測組織中的目標分析物的方法，其包括：使包含目標分析物的組織與包含含有多個酶分子和識別目標分析物的抗體的聚合的-酶/抗體綴合物的聚合的-酶/抗體綴合物接觸，以形成包含目標分析物和聚合的-酶/抗體綴合物的復合體；基本上移除不形成復合體的聚合的-酶/抗體綴合物；和使組織與多個酶分子的底物接觸，從而檢測目標分析物。在一些實施方式中，組織是冷凍組織。在根據(jù)(或如應用于)上述任何實施方式的一些實施方式中，方法進一步包括封閉步驟，然后進行如下步驟：使包含目標分析物的組織與包含含有多個酶分子和識別目標分析物的抗體的聚合的-酶/抗體綴合物的聚合的-酶/抗體綴合物接觸，以形成包含目標分析物和聚合的-酶/抗體綴合物的復合體；其中封閉步驟包括使組織與封閉劑接觸。在一些實施方式中，組織是冷凍組織。在一些實施方式中，封閉劑包括脫脂乳、BSA、冷的魚皮明膠、酪蛋白或動物血清。在根據(jù)(或如應用于)上述任何實施方式的一些實施方式中，組織在包含醛的固定液中固定。在根據(jù)(或如應用于)上述任何實施方式的一些實施方式中，固定液包括福爾馬林。在根據(jù)(或如應用于)上述任何實施方式的一些實施方式中，組織是石蠟包埋的。在根據(jù)(或如應用于)上述任何實施方式的一些實施方式中，組織是組織切片、臨床涂片、或培養(yǎng)的細胞或組織。在一些實施方式中，組織切片選自哺乳動物的如下器官的組織切片：腦、腎上腺、結腸、小腸、胃、心臟、肝臟、皮膚、腎臟、肺、胰腺、睪丸、卵巢、前列腺、子宮、甲狀腺和脾臟。在根據(jù)(或如應用于)上述任何實施方式的一些實施方式中，酶分子選自：β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-內酰胺酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、脲酶、尿酸酶、超氧化物歧化酶、熒光素酶、丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶、半乳糖氧化酶、乙酰膽堿酯酶、腸激酶、酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶。在根據(jù)(或如應用于)上述任何實施方式的一些實施方式中，聚合的-酶/抗體綴合物包括每個聚合的-酶/抗體綴合物至少6個酶分子。在一些實施方式中，聚合的-酶/抗體綴合物包括每個聚合的-酶/抗體綴合物大約6個和大約80個之間的酶分子。在根據(jù)(或如應用于)上述任何實施方式的一些實施方式中，使包含目標分析物的組織與包含含有多個酶分子和識別目標分析物的抗體的聚合的-酶/抗體綴合物的聚合的-酶/抗體綴合物接觸以形成包含目標分析物和聚合的-酶/抗體綴合物的復合體的步驟在大約15℃和大約37℃之間的孵育溫度下進行。在根據(jù)(或如應用于)上述任何實施方式的一些實施方式中，使包含目標分析物的組織與包含含有多個酶分子和識別目標分析物的抗體的聚合的-酶/抗體綴合物的聚合的-酶/抗體綴合物接觸以形成包含目標分析物和聚合的-酶/抗體綴合物的復合體的步驟進行大約3分鐘和大約30分鐘之間的孵育周期。在一些實施方式中，孵育周期在大約5分鐘和大約15分鐘之間。本文提供了制造聚合的-酶/抗體綴合物的方法，其包括：將包含多個酶分子的聚合的-酶綴合至抗體。在一些實施方式中，抗體是治療性抗體。本文提供了利用試劑治療患有疾病的個體的方法，其包括使用根據(jù)(或如應用于)上述任何實施方式的包含綴合至識別目標分析物的抗體的多個酶分子的聚合的-酶/抗體綴合物檢測目標分析物的存在。在一些實施方式中，試劑是治療性抗體。在一些實施方式中，特異性地結合目標分析物的抗體和治療性抗體是相同的。本文提供了包含多個酶分子和治療性抗體的聚合的-酶/抗體綴合物。還提供了包含根據(jù)上述任何實施方式的聚合的-酶/抗體綴合物的試劑盒。在一些實施方式中，試劑盒進一步包括多個酶分子的底物。在一些實施方式中，試劑盒進一步包括根據(jù)上述任何實施方式的使用說明書。通過引用的并入本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請以與每個單個出版物、專利或專利申請被具體地或單獨地指示為通過引用并入的相同程度通過引用并入本文。附圖說明本發(fā)明的新的特征在所附權利要求書中具體地提出。通過參考提出說明性實施方式——在其中利用了本發(fā)明的原理——的下述具體實施方式和附圖獲得將更好地理解本發(fā)明的特征和優(yōu)勢，所述附圖如下：圖1示出了使用聚HRP抗Ck8/18抗體綴合物對冷凍的人淋巴結組織直接IHC染色的代表性圖像。圖1A描繪了冷凍的人淋巴結組織的直接免疫組織化學染色的結果(100X)。淋巴結包含轉移性乳腺導管癌。轉移性癌細胞直接地被HRP聚合物標記的小鼠抗人低分子量角蛋白單克隆抗體(CK8/18，克隆C94)染色；并且直接免疫組織化學染色的孵育時間為在室溫下3分鐘。圖1B示出了組織的200X放大倍數(shù)。示例性染色的區(qū)域由箭頭指示。圖2示出了使用聚HRP抗Ck8/18抗體綴合物對冷凍的人淋巴結組織直接IHC染色的代表性圖像。圖2A描繪了冷凍的人淋巴結組織的直接免疫組織化學染色的結果(100X)。淋巴結包含轉移性乳腺導管癌。轉移性癌細胞直接地被NovodiaxHRP聚合物標記的小鼠抗人低分子量角蛋白單克隆抗體(CK8/18，克隆C94)染色；并且直接免疫組織化學染色的孵育時間為在室溫下5分鐘。圖2B示出了組織的200X放大倍數(shù)。示例性染色的區(qū)域由箭頭指示。圖3示出了使用聚HRP抗Ck8/18抗體綴合物對冷凍的人淋巴結組織直接IHC染色的代表性圖像。圖3A描繪了冷凍的人淋巴結組織的直接免疫組織化學染色的結果(100X)。淋巴結包含轉移性乳腺導管癌。轉移性癌細胞直接地被HRP聚合物標記的小鼠抗人低分子量角蛋白單克隆抗體(CK8/18，克隆C94)染色；并且直接免疫組織化學染色的孵育時間為在室溫下8分鐘。圖3B示出了組織的200X放大倍數(shù)。示例性染色的區(qū)域由箭頭指示。圖4示出了H/E染色的代表性圖像。圖4A描繪了冷凍的切片組織的H/E染色載玻片，10X放大倍數(shù)。組織是包含轉移性乳腺導管癌的腋淋巴結。大多數(shù)淋巴組織被腫瘤替代。圖4B描繪了冷凍的切片組織的H/E染色載玻片，10X放大倍數(shù)。組織是包含轉移性乳腺導管癌的腋淋巴結。大多數(shù)淋巴組織被腫瘤替代。圖5描繪了使用綴合至小鼠抗人細胞角蛋白8/18抗體的Novodiax聚HRP聚合物對福爾馬林固定的組織載玻片直接IHC染色的代表性圖像，用100X顯微鏡放大倍數(shù)數(shù)碼拍攝。檢查的組織是正常前列腺。示例性染色的區(qū)域由箭頭指示。圖6描繪了在正常前列腺組織上使用綴合至小鼠抗人前列腺特異性抗體(PSA)的Novodiax聚HRP聚合物的直接IHC染色的代表性數(shù)字顯微照片(100X放大倍數(shù))。示例性染色的區(qū)域由箭頭指示。圖7描繪了在人淋巴組織上使用綴合至小鼠抗人IgG抗體的聚HRP聚合物的直接IHC染色的代表性結果。顯微鏡放大倍數(shù)是400X。示例性染色的區(qū)域由箭頭指示。圖8示出了使用聚HRP抗Ck8/18抗體綴合物對冷凍的人淋巴結組織直接IHC染色的代表性圖像。圖8A描繪了福爾馬林固定的人前列腺組織的直接免疫組織化學染色的結果(20X)。前列腺上皮細胞直接地被NovodiaxHRP聚合物標記的小鼠抗人低分子量角蛋白單克隆抗體(CK8/18，克隆C94)染色；并且直接免疫組織化學染色的孵育時間為在37℃下3分鐘。圖8B描繪了福爾馬林固定的人前列腺組織的直接免疫組織化學染色的結果(40X)。前列腺上皮細胞直接地被NovodiaxHRP聚合物標記的小鼠抗人低分子量角蛋白單克隆抗體(CK8/18，克隆C94)染色；并且直接免疫組織化學染色的孵育時間為在37℃下3分鐘。圖9示出了使用聚合的-HRP抗Ck8/18抗體綴合物對組織切片直接IHC染色的代表性圖像。圖解了FFPE前列腺組織切片(圖9A)和冷凍的人淋巴結組織切片(圖9B)。示例性染色的區(qū)域由箭頭指示。圖10示出了使用聚合的-HRP抗Ki-67抗體綴合物對人扁桃體組織切片直接IHC染色的代表性圖像。示例性染色的區(qū)域由箭頭指示。圖11示出了使用聚合的-HRP抗Ck5抗體綴合物對人冷凍的扁桃體組織切片直接IHC染色的代表性圖像。示例性染色的區(qū)域由箭頭指示。圖12示出了使用聚合的-HRP抗Mart-1抗體克隆A103綴合物對黑素瘤組織切片直接IHC染色的代表性圖像。示例性染色的區(qū)域由箭頭指示。圖13示出了使用聚合的-HRP抗CD45抗體克隆3A4綴合物對扁桃體組織切片直接IHC染色的代表性圖像。示例性染色的區(qū)域由箭頭指示。圖14示出了使用綴合有聚合的-HRP的治療性抗體對組織切片直接IHC染色的代表性圖像。圖解了扁桃體(圖14A)、前列腺(圖14B)、胃(圖14C)和腎臟(圖14D)組織樣本。示例性染色的區(qū)域由箭頭指示。圖15示出了使用聚合的-HRP抗ROR2抗體綴合物對組織樣本直接IHC染色的代表性圖像。圖解了黑素瘤(圖15A和15B)、肝細胞癌(圖15C和15D)、神經內分泌腫瘤(圖15E和15F)、肺癌(圖15G)和腎透明細胞癌(圖15H)組織切片。示例性染色的區(qū)域由箭頭指示。具體實施方式本發(fā)明的數(shù)個方面參考用于說明的實例應用在下面描述。應當理解，許多具體細節(jié)、關系和方法被提出以提供對本發(fā)明的完整理解。但是具有相關領域的普通技能的技術人員將容易地意識到本發(fā)明可以在沒有一個或多個具體細節(jié)的情況下或者利用其它方法實踐。本發(fā)明不被行動或事件的闡明的順序所限制，因為一些行動可以以不同的順序發(fā)生和/或與其它行動或事件同時發(fā)生。而且，并不需要所有闡明的行動或事件來執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的方法。本文使用的術語僅僅出于描述特定實施方式的目的并且不意欲限制本發(fā)明。如本文所使用，單數(shù)形式“一個(a、an)”和“該”意欲也包括復數(shù)形式，除非上下文另外清楚地指示。而且，就在具體實施方式和/或權利要求書中使用的術語“包含(including、include)”、“含有(having、has)”、“具有(with)”或其變體來說，這樣的術語意欲是以與術語“包括(comprising)”類似的方式為包含性的。術語“大約”或“近似地”意思是在由本領域普通技術人員測定的具體值的可接受誤差范圍內，其將部分取決于值如何被測量或測定，即，測量系統(tǒng)的限制。例如，“大約”可以意思是本領域的每次實踐在1或多于1標準偏差內?？蛇x地，“大約”可以意思是給定值的多達20％、優(yōu)選地多達10％、更優(yōu)選地多達5％、并且甚至更優(yōu)選地仍多達1％的范圍?？蛇x地，具體地關于生物學體系或過程，術語“大約”可以意思是在值的數(shù)量級內，優(yōu)選地在5倍內，并且更優(yōu)選地在2倍內。在具體的值在本申請和權利要求書中描述的地方，除非另有指定，應當假定術語“大約”意思是在具體值的可接受誤差范圍內。I.免疫組織化學測定一般而言，本發(fā)明提供了用于檢測組織樣本中目標分析物存在或不存在的組合物、方法和試劑盒。通常地，方法包括：(a)使包含目標分析物的組織樣本與聚合的-酶/抗體綴合物接觸以形成包含目標分析物和至少一種聚合的-酶/抗體綴合物的復合體，在大約15℃和大約45℃之間的孵育溫度下，持續(xù)大約3分鐘至大約1小時之間的孵育周期，其中抗體能夠特異性地結合至目標分析物；(b)移除不形成復合體的聚合的-酶/抗體綴合物；(c)使組織樣本與酶的底物接觸，從而檢測目標分析物。在一方面，提供的組合物、方法和試劑盒用于快速地檢測組織樣本——比如FFPE組織切片或冷凍的組織切片——中的目標分析物，比如抗原。在一方面，提供的組合物、方法和試劑盒用于靈敏地檢測組織樣本——比如FFPE組織切片或冷凍的組織切片——中的目標分析物，比如抗原。在一些實施方式中，患有疾病的個體被選擇進行治療，其中通過本文公開的方法檢測目標分析物被用作選擇進行治療的個體的基礎。A.組織樣本一般而言，本文提供的組合物和方法用于檢測源自對象的組織樣本中的目標分析物。在一些實施方式中，本文提供的組合物和方法用于檢測源自對象的組織中的目標分析物，其中目標分析物是腫瘤抗原。本文中的“對象”或“患者”意思是治療期望用于的任何單個對象，包括人、牛、狗、小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、雞、昆蟲等。還意欲包含的對象是參與臨床研究試驗的不顯示疾病的任何臨床征兆的任何對象，或者參與流行病學研究的對象，或者用作對照的對象。本文中的“組織樣本”意思是從對象或患者的組織獲得的類似細胞的集合(collection)，優(yōu)選地含有具有染色體材料的有核細胞。四種主要的人組織是(1)上皮組織；(2)結締組織，包括血管、骨骼和軟骨；(3)肌肉組織；和(4)神經組織。組織樣本的來源可以是實體組織，如來自新鮮的、冷凍的和/或保藏的器官或組織樣本，或活檢組織，或抽吸物(aspirate)，或血液或任何血液成分，或體液，比如腦脊液、羊水、腹膜液或間質液，或來自對象的懷孕或發(fā)育中的任何時間的細胞。組織樣本還可以是原代或培養(yǎng)的細胞或細胞系，或培養(yǎng)組織。組織樣本可以包含實際上不與組織天然混雜的復合物，比如防腐劑、抗凝劑、緩沖劑、固定劑、營養(yǎng)物、抗生素等。在本發(fā)明的一些實施方式中，組織樣本是“非血液學組織”(即，不是血液或骨髓組織)。本發(fā)明的方法可以應用于任何類型的組織，包括，例如，癌組織。雖然冷凍的腫瘤組織不是廣泛地可利用的，但是石蠟塊常規(guī)地在外科手術之后由腫瘤制備，使得，例如，胸苷酸合成酶表達和化療應答的大規(guī)?；仡櫺哉{查被執(zhí)行。而且，該技術可以應用于任何寬范圍的腫瘤類型和應用于無限范圍的基因產物。本發(fā)明的方法可以用于制備個體腫瘤“基因表達模式(profile)”，由此對于一種或多種基因產物——比如已知為影響臨床結果和對多種化學治療劑的響應的一系列基因產物，表達水平可以在個體患者樣本中測定。在一些實施方式中，組織包括癌細胞。在一些實施方式中，組織包括在空間上接近癌細胞的細胞。在一些實施方式中，組織包括癌細胞和在空間上接近癌細胞的細胞。在一些實施方式中，組織包括在空間上緊密接近癌細胞的細胞。在一些實施方式中，組織包括在空間上緊密接近癌細胞的正常細胞。在一些實施方式中，組織包括癌細胞和在空間上接近癌細胞的正常細胞的混合物。在一些實施方式中，混合物包括低百分比的癌細胞。在一些實施方式中，混合物包括少于30％、20％、15％、10％或5％的癌細胞。在一些實施方式中，混合物包括在大約5％和大約30％之間的癌細胞。在一些實施方式中，組織樣本包括組織切片。本文中的組織樣本的“切片”意思是單一部分或塊的組織樣本，例如，從組織樣本切下的組織或細胞的薄切片。應當理解，組織樣本的多個切片可以被采用并且經歷根據(jù)本發(fā)明的分析。在一些實施方式中，組織的選定部分或切片包括同質細胞群。在一些實施方式中，組織的選定部分或切片包括異質細胞群。在一些實施方式中，選定部分包括組織的區(qū)域例如內腔作為非限制性實例。例如，選定部分可以小至一個細胞或兩個細胞，或者可以代表數(shù)千細胞。在大多數(shù)情況下，細胞的收集是重要的，并且雖然本發(fā)明已經被描述用于檢測細胞成分，但是本方法還可以用于檢測生物體的非細胞成分(例如，作為非限制性實例，血液中的可溶成分)?？梢允褂脕碜詫ο蟮娜魏谓M織樣本?？梢允褂玫慕M織樣本的實例包括但不限于乳房、前列腺、卵巢、結腸、肺、子宮內膜、胃、唾腺或胰腺。組織樣本可以通過多種過程獲得，包括但不限于外科手術切除、吸引術或活檢。組織可以是新鮮的或冷凍的。在一些實施方式中，組織是老化的。本文中的“老化”意思是已經儲存組織一段時間，例如，冷凍儲存或FFPE儲存一段時間。在一些實施方式中，組織樣本是冷凍的組織樣本。在一些實施方式中，組織是冷凍的組織。在一些實施方式中，組織是石蠟包埋的組織。在一些實施方式中，組織是福爾馬林固定的石蠟包埋的組織。在一些實施方式中，組織樣本是組織切片、臨床涂片、或培養(yǎng)的細胞或組織。在一些實施方式中，組織是大于大約5μm厚度的組織切片。在一些實施方式中，組織是大約5μm厚度的組織切片。在一些實施方式中，組織是小于大約5μm厚度的組織切片。在一些實施方式中，組織是大約1.5μm厚度至大約5.5μm厚度的組織切片。在一些實施方式中，組織是大約4.5μm厚度至大約7.5μm厚度的組織切片。在一些實施方式中，組織切片選自哺乳動物的如下器官的組織切片：腦、腎上腺、結腸、小腸、胃、心臟、肝臟、皮膚、腎臟、肺、胰腺、睪丸、卵巢、前列腺、子宮、甲狀腺和脾臟。在一些實施方式中，組織切片來自實體瘤。組織樣本的制備從這些顆粒試樣制備組織塊的方法已經在多種預后因素的先前的IHC研究中成功地使用，和/或其對于本領域技術人員而言是熟知的。簡單地說，任何完整的器官或組織可以被切成相當小的塊并且在多種固定劑(例如，福爾馬林、醇等)中孵育不同的時間段直到組織被“固定”。樣本可以是從身體外科手術移除的幾乎任何完整組織。樣本可以被切成符合在組織病理學實驗室中常規(guī)使用的儀器的合理小塊(一個或多個)。切塊的大小通常在幾毫米至幾厘米的范圍內。在一些實施方式中，冷凍的切片可以通過如下步驟制備：在室溫下、在小塑料容器(capsule)中的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中使50mg冷凍的“粉碎的”組織再水化；通過離心使顆粒沉淀；將顆粒重新懸浮在粘性的包埋介質(OCT)中；倒置容器和/或通過離心再次沉淀；在-70℃異戊烷中速凍；切割塑料容器和/或移除冷凍的組織圓柱體；在恒冷箱切片機夾頭(chuck)上固定組織圓柱體；和/或切割25-50個連續(xù)切片。永久切片可以通過包含以下步驟的類似方法制備：在塑料微量離心管中使50mg樣本再水化；沉淀；重新懸浮在10％福爾馬林中進行4小時固定；洗滌/沉淀；重新懸浮在溫的2.5％瓊脂中；沉淀；在冰水中冷卻以使瓊脂硬化；從管中移出組織/瓊脂塊；在石蠟中浸潤和/或包埋塊；和/或切割多達50個連續(xù)的永久切片。在一些實施方式中，本發(fā)明可以利用標準的冷凍樣本，比如被包埋在OCT中并且未被粉碎的那些，例如，包括在標準的冷凍切片醫(yī)院實驗室中使用的那些。組織樣本通常利用固定劑來固定。通常使用醛固定劑例如福爾馬林(甲醛)和戊二醛。使用其它固定技術比如醇浸沒固定的組織樣本也是適合的。參見Battifora和Kopinski，J.，Histochem.Cytochem.，34：1095(1986)。使用的樣本也可以被包埋在石蠟中。在一些實施方式中，組織樣本在包含醛的溶液中被固定。在一些實施方式中，組織樣本在包含福爾馬林的溶液中被固定。在一些實施方式中，組織樣本被石蠟包埋。在一些實施方式中，組織樣本被固定和包埋在石蠟等中。在一些實施方式中，樣本既被福爾馬林固定又被石蠟包埋。在一些實施方式中，福爾馬林固定的石蠟包埋的組織(FFPET)塊被蘇木精和伊紅染色，然后選擇一個或多個部分進行分析，以便為FFPET核心樣本選擇特定的區(qū)域(一個或多個)。組織樣本可以通過常規(guī)的方法固定(即，保藏)。參見，例如，“ManualofHistologicalStainingMethodoftheArmedForcesInstituteofPathology″，第三版(1960)LeeG.Luna，HT(ASCP)編輯，TheBlakstonDivisionMcGraw-HillBookCompany，紐約；TheArmedForcesInstituteofPathologyAdvancedLaboratoryMethodsinHistologyandPathology(1994)，UlrekaV.Mikel編輯，ArmedForcesInstituteofPathology，AmericanRegistryofPathology，Washington，D.C.。本領域技術人員將理解，固定劑的選擇由組織將被組織學染色或者以其他方式分析的目的而確定。本領域技術人員還將理解，固定的長度取決于組織樣本的大小和使用的固定劑。舉例而言，中性緩沖液福爾馬林、布安固定液或低聚甲醛(paraformaldehyde)可以被用于固定組織樣本。通常地，組織樣本首先被固定，然后通過遞增系列的醇脫水，用石蠟或其它切片介質浸潤和包埋，使得組織樣本可以被切片。可選地，實驗者可以對組織切片并且固定獲得的切片。舉例而言，組織樣本可以通過常規(guī)的方法在石蠟中包埋和處理。參見，例如，“ManualofHistologicalStainingMethodoftheArmedForcesInstituteofPathology”，上文。可以使用的石蠟的實例包括但不限于Paraplast、Broloid和Tissuemay。一旦組織樣本被包埋，樣本可以通過切片機等進行切片。參見，例如，“ManualofHistologicalStainingMethodoftheArmedForcesInstituteofPathology”，上文。通過該過程的實例的方式，切片厚度的范圍可以在大約3微米至大約5微米。一旦被切片，切片可以通過數(shù)個標準方法附著至載玻片。載玻片粘合劑的實例包括但不限于硅烷、明膠、多聚-L-賴氨酸等。舉例而言，石蠟包埋的切片可以附著至帶正電荷的載玻片和/或包被有多聚-L-賴氨酸的載玻片。樣本的脫蠟(deparaffinization)如果石蠟已經被用作包埋材料，則組織切片通常被脫蠟并利用水再水化。在一些實施方式中，組織在IHC之前被脫蠟。脫蠟從石蠟包埋的樣本移除大部分的石蠟。許多用于脫蠟的技術是已知的，并且任何適合的技術可以與本發(fā)明一起使用。本發(fā)明的優(yōu)選方法利用有機溶劑洗滌來溶解石蠟。這類溶劑能夠在沒有不利地影響組織中的配體的情況下有效地從組織樣本移除石蠟。適合的溶劑可以從示例性溶劑中選擇，比如苯、甲苯、乙苯、二甲苯和其混合物。二甲苯是用于本發(fā)明的方法的優(yōu)選溶劑。在本發(fā)明的方法中單獨的或組合的溶劑優(yōu)選地是高純度的，通常大于大約99％。石蠟通常通過在強力混合的情況下利用有機溶劑洗滌然后離心來移除。樣本在足以引起組織在管中沉淀的速度下離心，通常在大約10,000至大約20,000xg下離心。在離心之后，丟棄有機溶劑上清液。組織學領域的技術人員將認識到，使用的有機溶劑的體積和必要的洗滌次數(shù)將取決于樣本的大小和待被移除的石蠟的量。待被移除的石蠟的量越大，將需要越多次的洗滌。通常地，樣本將被洗滌1次和大約10次之間，并且優(yōu)選地，大約2和大約4次之間。對于10μm組織試樣，有機溶劑的典型體積為大約500μL。本領域技術人員已知的其它脫蠟方法也可以用于本發(fā)明的方法，例如，包括直接融化。在另外的實施方式中，可以采用柑橘類脂肪族烴(例如，D-檸檬烯類(D-Limolenebased))，包括，例如，用于脫蠟的其它示例性的專利制劑(例如，(PMPMedicalIndustries，Inc.，Irving，TX)；(MicromInternational；Walldorf，Germany)；EZ-DEWAXTM(BioGenex，SanRamon，CA))。EZ-DEWAXTM已知為去蠟和再水化劑。組織切片可以通過數(shù)個常規(guī)的標準方法脫蠟。例如，可以使用二甲苯或者逐步遞減系列的醇。參見，例如，“ManualofHistologicalStainingMethodoftheArmedForcesInstituteofPathology”，上文。可選地，可以使用商業(yè)可得的脫蠟非有機試劑，比如(CMS，Houston，Texas)。再水化在脫蠟之后可以再水化樣本。再水化的優(yōu)選方法是利用降低濃度的低級醇水溶液逐步洗滌。乙醇是優(yōu)選的用于再水化的低級醇。其它醇也可以適合用于本發(fā)明，包括甲醇、異丙醇和在C1-C5范圍內的其它類似的醇。樣本可選地與醇溶液強力地混合并被離心。在優(yōu)選的實施方式中，醇的濃度范圍在大約3到5個增量步驟內在水中從大約100％逐步降低至大約70％，其中在每個步驟中溶液濃度的改變通常低于大約10％(例如，示例性順序100％、95％、90％、80％、70％)。例如，在一些實施方式中，脫蠟和再水化使用試劑比如EZ-DEWAXTM(BioGenex，SanRamon，CA)同時進行。預處理在本發(fā)明的一些實施方式中，樣本可以被預處理，比如以直接地或間接地促進本發(fā)明的方法。在一些實施方式中，組織的預處理增加了用于抗體結合的目標分析物的可利用性?？梢圆捎檬沟媚繕丝衫玫念A處理(熱誘導的表位恢復或蛋白水解酶介導的)。檸檬酸鹽緩沖液、Tris和EDTA基底可以作為示例性的熱誘導試劑采用。在本發(fā)明的某些方面中，比如通過利用許多可利用的專利制劑，也可以采用胃蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、蛋白酶和所有的亞型。B.目標分析物提供的組合物和方法用于檢測組織樣本中的一種或多種目標分析物。本文中的“目標分析物”或“分析物”或“目標”或語法等價物意思是待被檢測的任何分子、復合物或顆粒。在一些實施方式中，目標分析物是未分化的贅生物/未知的初生體(primaries)的診斷中的生物標記，比如，上皮標記(細胞角蛋白和EMA)、肌上皮標記(p63、S100、鈣調理蛋白、SMA、SMMH-1、CK14、乳腺絲抑蛋白)、間充質標記(波形蛋白、SMA、MSA、結蛋白、MyoD1、成肌蛋白、NF、S100、P63、CD10、鈣調理蛋白、肌紅蛋白、MDM2、CDK4、FLI-1、CD117、DOG1、CD31、CD34、XIIIa因子、CD99)、黑素細胞標記(S100、HMB-45、MART-1、酪氨酸酶、MiTF)、間皮標記(鈣網(wǎng)膜蛋白、CK5/6、WT1、D2-40、HBME-1、間皮素、血栓調節(jié)蛋白)、神經內分泌標記(嗜鉻粒蛋白、突觸小泡蛋白、CD56、PGP9.5、NSE、胰島素、PTH、降鈣素、甲狀腺球蛋白、催乳素)、生殖細胞腫瘤標記(PLAP、OCT4、CD117或c-kit、SALL4、CD30、甲胎蛋白、β-hCG、磷脂酰肌醇聚糖-3、α-抑制素(inhibin-alpha)、鈣網(wǎng)膜蛋白、EMA、CAM5.2)、B細胞標記(CD79a和PAX5)和造血細胞標記(CD1a、CD2、CD3、CD5、CD10、CD38、CD21、CD35、CD15、CD30、CD79a、CD43、CD138、CD68、Bcl-2、Bcl-6、細胞周期蛋白D1、MUM1、S100、MPO)。在一些實施方式中，目標分析物是用于識別腫瘤起源的生物標記，比如，用于甲狀腺髓樣癌的降鈣素和CEA；用于胰腺內分泌腫瘤的胰島素、胰高血糖素和生長抑素；用于梅克爾細胞癌的CK20；用于血管肌脂肪瘤的HMB-45、MART-1和SMA；用于黑素瘤的S100、HMB-45、MART-1、SOX10和波形蛋白；用于GI和外GI間質瘤的CD117和DOG-1；用于胸腺癌的CD5和p63；用于結直腸癌的CK20、CDX-2、β-連環(huán)蛋白和絨毛蛋白；用于涎腺導管癌的雄性激素受體和GCDFP-15；用于乳腺癌的GCDFP-15、ER、PR、乳腺珠蛋白(mammaglobin)；用于肺腺癌的TTF1、天冬氨酸蛋白酶A(napsinA)和表面活性劑A；用于甲狀腺乳頭狀和濾泡性癌的TTF1、甲狀腺球蛋白、PAX8；用于郎格罕細胞組織細胞增生癥的CD1a和S100；用于前列腺癌的PSA、PSAP和P504S；用于脊索瘤的CK、EMA、S100；用于乳頭狀RCC的P504S/KIM-1/RCCMa；用于透明細胞RCC的RCCMa、KIM-1、PAX8、pVHL；用于甲狀腺玻璃樣變性梁狀腺瘤(hyalinizingtrabecularadenomaofthethyroid)的MIB1(Ki-67)；用于精原細胞瘤的OCT4/CD117/PLAP/D2-40；用于促結締組織增生性小圓細胞腫瘤(DPSRCT)的CK、結蛋白；用于肝細胞癌的磷脂酰肌醇聚糖-3、HepPar1；用于卵黃囊癌的甲胎蛋白/磷脂酰肌醇聚糖-3/PLAP/SALL4；用于胚胎性癌的OCT4/CD30/SOX2/SALL4/PLAP；用于脂肪組織/脂肪肉瘤的DM2、CDK4；用于橫紋肌肉瘤的成肌蛋白、結蛋白、myoD1；用于平滑肌肉瘤/平滑肌腫瘤的SAM、MSA、結蛋白；用宮頸癌和宮頸內癌(endocervicalcarcinoma)的p16、原位HPV；用于卵巢漿液性癌的ER、WT1、PAX8；用于子宮內膜間質肉瘤的CD10、ER；用于胰腺導管腺癌(PDA)的乳腺絲抑蛋白、VHL；用于T細胞的CD2、CD3；用于B細胞的CD20、PAX5、CD69a；用于髓樣細胞的CD43、CD34、CD33、MPO；用于肥大細胞的CD117、類胰蛋白酶；和用于濾泡樹突細胞的CD21、CD35。在一些實施方式中，目標分析物是用于在疾病種類內詳細分類的生物標記，比如，用于淋巴瘤/白血病的CD3、CD20、CD79a、PAX5、CD45rb、CD15、CD30、ALK-1、CD138、CD56、免疫球蛋白、HHV8、EMA、TdT、CD34、CD117和MPO。在一些實施方式中，目標分析物是用于伴隨診斷的生物標記，比如ER、PR、HER2、EGFR和CD117(c-kit)。在一些實施方式中，目標包括蛋白質、碳水化合物、脂質和/或核酸。在一些實施方式中，目標包括蛋白質和/或其特性部分，比如，腫瘤標記、整聯(lián)蛋白、細胞表面受體、跨膜蛋白、胞間蛋白、離子通道、膜轉運蛋白、酶、抗體、嵌合蛋白、糖蛋白等。在一些實施方式中，目標包括碳水化合物或其特性部分，比如，糖蛋白、糖(例如，單糖、二糖、多糖)、糖萼(即，大多數(shù)真核細胞的外表面上的富含碳水化合物的外周區(qū))等。在一些實施方式中，目標包括脂質和/或其特性部分，比如，油、脂肪酸、甘油酯、激素、類固醇(例如，膽固醇、膽汁酸)、維生素(例如，維生素E)、磷脂、鞘脂、脂蛋白等。眾多標記在本領域中是已知的。通常的標記包括細胞表面蛋白，例如，受體。示例性的受體包括但不限于轉鐵蛋白受體；LDL受體；生長因子受體，比如表皮生長因子受體家族成員(例如，EGFR、Her2、Her3、Her4)或血管內皮生長因子受體、細胞因子受體、細胞粘附分子、整聯(lián)蛋白、選擇蛋白和CD分子。標記可以是唯一地或者以較高的量在惡性細胞上存在的分子，例如，腫瘤抗原。在一些實施方式中，標記或目標分析物以比對照中的標記或目標分析物高的量存在。在一些實施方式中，目標分析物選自：用于診斷未分化的贅生物和/或未知的原發(fā)性腫瘤的生物標記，其選自上皮標記(細胞角蛋白(cytokertin)和EMA)、肌上皮標記(p63、S100、鈣調理蛋白、SMA、SMMH-1、CK14、乳腺絲抑蛋白)、間充質標記(波形蛋白、SMA、MSA、結蛋白、MyoD1、成肌蛋白、NF、S100、P63、CD10、鈣調理蛋白、肌紅蛋白、MDM2、CDK4、FLI-1、CD117、DOG1、CD31、CD34、XIIIa因子、CD99)、黑素細胞標記(S100、HMB-45、MART-1、酪氨酸酶、MiTF)、間皮標記(鈣網(wǎng)膜蛋白、CK5/6、WT1、D2-40、HEME-1、間皮素、血栓調節(jié)蛋白)、神經內分泌標記(嗜鉻粒蛋白、突觸小泡蛋白、CD56、PGP9.5、NSE、胰島素、PTH、降鈣素、甲狀腺球蛋白、催乳素)、生殖細胞腫瘤標記(PLAP、OCT4、CD117或c-kit、SALL4、CD30、甲胎蛋白、β-hCG、磷脂酰肌醇聚糖-3、α-抑制素、鈣網(wǎng)膜蛋白、EMA、CAM5.2)和造血細胞標記(CD1a、CD2、CD3、CD5、CD10、CD38、CD21、CD35、CD15、CD30、CD79a、CD43、CD138、CD68、Bcl-2、Bcl-6、細胞周期蛋白D1、MUMI、S100、MPO)；用于識別腫瘤起源的生物標記，其選自：用于甲狀腺髓樣癌的降鈣素和CEA；用于胰腺內分泌腫瘤的胰島素、胰高血糖素和生長抑素；用于梅克爾細胞癌的CK20；用于血管肌脂肪瘤的HMB-4S、MART-1和SMA；用于黑素瘤的S100、HMB-45、MART-1、SOX10和波形蛋白；用于GI和外GI間質瘤的CD117和DOG-1；用于胸腺癌的CD5和p63；用于結直腸癌的CK20、CDX-2、β-連環(huán)蛋白和絨毛蛋白；用于涎腺導管癌的雄性激素受體和GCDFP-15；用于乳腺癌的GCDFP-15、ER、PR、乳腺珠蛋白；用于肺腺癌的TTF1、天冬氨酸蛋白酶A和表面活性劑A；用于甲狀腺乳頭狀和濾泡性癌的TTF1、甲狀腺球蛋白、PAX8；用于郎格罕細胞組織細胞增生癥的CD1a和S100；用于前列腺癌的PSA、PSAP和P504S；用于脊索瘤的CK、EMA、S100；用于乳頭狀RCC的P504S/KIM-1/RCCMa；用于透明細胞RCC的RCCMa、KIM-1、PAX8、pVHL；用于甲狀腺玻璃樣變性梁狀腺瘤的MIB1(Ki-67)；用于精原細胞癌的OCT4/CD117/PLAP/D2-40；用于促結締組織增生性小圓細胞腫瘤(DPSRCT)的CK、結蛋白；用于肝細胞癌的磷脂酰肌醇聚糖-3、HepPar1；用于卵黃囊癌的甲胎蛋白/磷脂酰肌醇聚糖-3/PLAP/SALL4；用于胚胎性癌的OCT4/CD30/SOX2/SALL4/PLAP；用于脂肪組織/脂肪肉瘤的DM2、CDK4；用于橫紋肌肉瘤的成肌蛋白、結蛋白、myoD1；用于平滑肌肉瘤/平滑肌腫瘤的SAM、MSA、結蛋白；用宮頸癌和宮頸內癌的p16、原位HPV；用于卵巢漿液性癌的ER、WT1、PAX8；用于子宮內膜間質肉瘤的CD10、ER；用于胰腺導管腺癌(PDA)的乳腺絲抑蛋白、VHL；用于T細胞的CD2、CD3；用于B細胞的CD20、PAX5、CD69a；用于髓樣細胞的CD43、CD34、CD33、MPO；用于肥大細胞的CD117、類胰蛋白酶；或用于濾泡樹突細胞的CD21、CD35；用于在疾病種類內詳細分類的生物標記，其選自CD3、CD20、CD79a、PAX5、CD45rb、CD15、CD30、ALK-1、CD138、CD56、免疫球蛋白、HHV8、EMA、TdT、CD34、CD117和MPO；或用于伴隨診斷的其它生物標記，選自ER、PR、HER2、EGFR和CD117(c-kit)。腫瘤抗原在某些特定實施方式中，目標是腫瘤標記。在一些實施方式中，腫瘤標記是存在于腫瘤中、不存在于正常器官、組織和/或細胞中的抗原。在一些實施方式中，腫瘤標記是與腫瘤相關聯(lián)并且與正常器官、組織和/或細胞不相關聯(lián)的抗原。在一些實施方式中，腫瘤標記是位于腫瘤的細胞表面上并且不位于正常器官、組織和/或細胞的細胞表面上的抗原。在一些實施方式中，腫瘤標記是在腫瘤中比在正常器官、組織和/或細胞中更為普遍的抗原。在一些實施方式中，腫瘤標記是與正常器官、組織和/或細胞相比與腫瘤更普遍相關聯(lián)的抗原。在一些實施方式中，腫瘤標記是在惡性腫瘤細胞中比在正常細胞中更為普遍的抗原。在一些實施方式中，腫瘤標記是與正常細胞相比與惡性腫瘤細胞更普遍相關聯(lián)的抗原。在一些實施方式中，腫瘤標記以比在對照中發(fā)現(xiàn)的腫瘤標記更高的水平存在。在一些實施方式中，腫瘤標記比在非腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)的腫瘤標記更高的水平存在。在一些實施方式中，目標分析物包括腫瘤抗原。本文中的“腫瘤抗原”意思是在腫瘤細胞中產生的抗原性物質，即，其在宿主中引發(fā)免疫應答。身體中的正常蛋白由于自身耐受性是非抗原性的，其為如此過程：其中在中樞淋巴組織(BM)中“中心地”和在次級淋巴組織中“外周地”，剔除自身反應的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)和產生自身抗體的B淋巴細胞(大部分情況是，對于T細胞，胸腺，和對于B細胞，脾臟/淋巴結)。因此，不暴露于免疫系統(tǒng)的任何蛋白質引發(fā)免疫應答。這可以包括很好地與免疫系統(tǒng)隔絕的正常蛋白質、以極少的量正常產生的蛋白質、僅在發(fā)育的某些階段正常產生的蛋白質、或由于突變其結構被修飾的蛋白質。在一些實施方式中，與正常組織和/或細胞相比，目標優(yōu)先地在腫瘤組織和/或細胞中表達。在一些實施方式中，目標以在腫瘤組織中比在正常組織中高的水平表達。在一些實施方式中，目標以比對照更高的水平表達。在本發(fā)明的一些實施方式中，標記是腫瘤標記。標記可以是以在分裂細胞上比在非分裂細胞上高的水平表達的多肽。例如，Her-2/neu(也稱為ErbB-2)是EGF受體家族的成員并且在與乳腺癌相關聯(lián)的腫瘤的細胞表面上表達。另一個實例是稱為F3——其是用于引導納米顆粒至核仁蛋白的適合的靶向劑——的肽。參見Porkka等，ProcNatlAcadSci，99：7444(2002)；和Christian等，JCellBiol，163：871(2003)。已經顯示了包含納米顆粒和A10適配體(其特異性地結合至PSMA)的靶向顆粒能夠特異性地并有效地遞送多西紫杉醇至前列腺癌腫瘤。特異性地靶向這些腫瘤目標的抗體或其它藥物特異性地直接干涉和調控腫瘤細胞調控的生物學行為的信號傳導通路，或者阻斷信號傳導通路以抑制腫瘤細胞生長或者誘導細胞凋亡。迄今為止，存在幾十種已經被批準用于實體瘤或血液惡性腫瘤臨床研究和治療的目標藥物，并且存在用于血液惡性腫瘤的許多靶向藥物。在一些實施方式中，腫瘤抗原(或腫瘤目標)選自：CD2、CD19、CD20、CD22、CD27、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD47、CD52、CD56、CD70、CD79和CD137。在一些實施方式中，腫瘤抗原(或腫瘤目標)選自：4-1BB、5T4、AGS-5、AGS-16、血管生成素2、B7.1、B7.2、B7DC、B7H1、B7H2、B7H3、BT-062、BTLA、CAIX、癌胚抗原、CTLA4、Cripto、ED-B、ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、EGFL7、EpCAM、EphA2、EphA3、EphB2、FAP、纖連蛋白、葉酸鹽受體、神經節(jié)苷脂GM3、GD2、糖皮質激素-誘導的腫瘤壞死因子受體(GITR)、gp100、gpA33、GPNMB、ICOS、IGF1R、整聯(lián)蛋白αν、整聯(lián)蛋白ανβ、KIR、LAG-3、路易斯Y抗原、間皮素、c-MET、MN碳酸酐酶IX、MUC1、MUC16、柄蛋白-4(Nectin-4)、NKGD2、NOTCH、OX40、OX40L、PD-1、PDL1、PSCA、PSMA、RANKL、ROR1、ROR2、SLC44A4、黏結蛋白聚糖-1、TACI、TAG-72、生腱蛋白、TIM3、TRAILR1、TRAILR2、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3和其變體。腫瘤抗原的變體包含本領域中已知的和/或天然存在的多種突變體或多態(tài)型(polymorphism)。在一些實施方式中，目標分析物以低水平表達。在一些實施方式中，目標分析物的拷貝數(shù)為每個細胞大約1x103至1x104，比如ROR1和ROR2。參見S.Baskar等，UniquecellsurfaceexpressionofreceptortyrosinekinaseROR1inhumanB-cellchroniclymphocyticleukemia，ClinCancerRes2008：14(2)396，V.Walkamm等，LiveImagingofXwnt5A-ROR2complexes，PLOSONE2014Vol9(10)1-9。C.聚合的-酶/抗體綴合物在另一方面，本發(fā)明提供了聚合的-酶/抗體綴合物，其中抗體能夠特異性地結合至目標分析物?？贵w一般而言，綴合物包括抗體或其功能性片段。本文中的“免疫球蛋白”或“抗體”意思是全長(即，天然存在的或通過正常免疫球蛋白基因片段重組過程形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗體)或者免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特異性地結合)部分，例如抗體片段。在要求保護的主題的范圍內，抗體或抗體片段可以綴合或以其它方式衍生。這類抗體包括IgG1、lgG2a、IgG3、IgG4(和IgG4亞型)以及IgA同種型。本文中的術語“抗體”以最寬泛的意義使用并且包含各種抗體結構，其包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和抗體片段，只要其展示期望的抗原結合活性并且包括免疫球蛋白的Fc區(qū)或者與Fc區(qū)等價的區(qū)。術語“全長抗體”、“完整抗體”和“整個抗體”在本文中可互換地使用，指的是具有與天然抗體結構基本上類似的結構的抗體或者具有包含如本文限定的Fc區(qū)的重鏈的抗體。本文中的“天然抗體”意思是天然存在的具有不同結構的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體是大約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，其由二硫鍵連接的兩個相同的輕鏈和兩個相同的重鏈組成。從N末端到C末端，每個重鏈具有可變區(qū)(VH)——其也被稱為可變的重結構域或重鏈可變結構域，然后是三個恒定結構域(CH1、CH2和CH3)——其也被稱為重鏈恒定區(qū)。類似地，從N末端到C末端，每個輕鏈具有可變區(qū)(VL)——其也被稱為可變的輕結構域或輕鏈可變結構域，然后是三個恒定輕(CL)結構域——其也被稱為輕鏈恒定區(qū)?？贵w的輕鏈可以基于其恒定結構域的氨基酸序列被指定為稱為κ和λ的兩種類型中的一種。本文中的“抗體片段”意思是除了完整抗體之外的包括一部分完整抗體的分子，其結合完整抗體結合的抗原?？贵w片段的實例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體分子(例如scFv)、單結構域抗體和由抗體片段形成的多特異性抗體。對于某些抗體片段的綜述，參見Hudson等，NatMed9，129-134(2003)。對于scFv片段的綜述，參見，例如，Pliickthun，inThePharmacologyofMonoclonalAntibodies，vol.113，RosenburgandMooreeds.，Springer-Verlag，NewYork，pp.269-315(1994)；還參見WO93/16185；和美國專利號5,571,894和5,587,458。對于包括補救受體結合表位殘基和具有增加的體內半衰期的Fab和F(ab′)2片段的討論，參見美國專利號5,869,046。雙抗體是具有兩個抗原結合位點——其可以為二價的或雙特異性的——的抗體片段。參加，例如，EP404,097；WO1993/01161；Hudson等，NatMed，9，129-134(2003)；和Hollinger等，ProcNatlAcadSci，90，6444-6448(1993)。三鏈抗體和四鏈抗體(tetrabody)也在Hudson等，NatMed，9，129-134(2003)中描述。單結構域抗體是包含抗體的重鏈可變結構域的所有或一部分或者輕鏈可變結構域的所有或一部分的抗體片段。在某些實施方式中，單結構域抗體是人單結構域抗體(Domantis，Inc.，Waltham，MA；參見，例如，美國專利號6,248,516B1)?？贵w片段可以通過多種技術制造，其包括但不限于，完整抗體的蛋白水解消化以及通過重組宿主細胞(例如，大腸桿菌或噬菌體)生產，如本文所描述的。本文的“抗原結合結構域”意思是包括特異性地結合至部分或全部抗原的和與部分或全部抗原互補的區(qū)域的抗體的部分。抗原結合結構域可以由例如一個或多個抗體可變結構域(也被稱為抗體可變區(qū))提供。具體而言，抗原結合結構域包括抗體輕鏈可變區(qū)(VL)和抗體重鏈可變區(qū)(VH)。本文中的“可變區(qū)”或“可變結構域”意思是在參與將抗體結合至抗原的抗體重鏈或輕鏈的結構域。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變結構域(分別為VH和VL)通常具有相似的結構，其中每個結構域包括四個保守框架區(qū)(FR)和三個高變區(qū)(HVR)。參見，例如，Kindt等，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman和Co.，第91頁(2007)。單個VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。本文中的“高變區(qū)”或“HVR”意思是抗體可變結構域的如此區(qū)的每個：其是序列高變的和/或形成結構上限定的環(huán)——“高變環(huán)”。一般而言，天然的四鏈抗體包括六個HVR，VH中的三個(H1、H2、H3)，和VL中的三個(L1、L2、L3)。HVR通常包括來自高變環(huán)和/或來自互補決定區(qū)(CDR)的氨基酸殘基，后者具有最高的序列可變性和/或參與抗原識別。除了VH中的CDR1之外，CDR通常包括形成高變環(huán)的氨基酸殘基。高變區(qū)(HVR)也被稱為“互補決定區(qū)”(CDR)，并且這些術語在本文中在關于形成抗原結合區(qū)的可變區(qū)的部分可互換地使用。該特定的區(qū)已經由Kabat等，U.S.Dept.ofHealthandHumanServices，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(1983)和由Chothia等，JMolBiol196：901-917(1987)描述，其中定義包括當互相比較時，氨基酸殘基的重疊或子集。然而，指抗體的CDR或其變體的任一定義的應用意欲在如本文限定的和使用的術語的范圍內。包含特定CDR的精確的殘基數(shù)目將根據(jù)CDR的序列和大小而改變。本領域技術人員可以常規(guī)地確定哪些殘基包括給出抗體的可變區(qū)氨基酸序列的特定CDR。本發(fā)明的抗體可以是嵌合抗體、人源化抗體、人抗體或抗體融合蛋白。本文中的“嵌合抗體”意思是包含重和輕抗體鏈二者的可變結構域的重組蛋白，其包括源自一個物種的抗體——優(yōu)選地嚙齒動物抗體、更優(yōu)選地鼠科動物抗體——的互補決定區(qū)(CDR)，同時抗體分子的恒定結構域源自人抗體的恒定結構域。對于獸醫(yī)應用，嵌合抗體的恒定結構域可以源自其它物種的嵌合抗體的恒定結構域，其它物種比如類人靈長類動物、貓或狗。本文中的“人源化抗體”意思是重組蛋白：在該重組蛋白中來自一個物種的抗體例如嚙齒動物抗體的CDR從嚙齒動物抗體的重和輕可變鏈轉移至人重和輕可變結構域?？贵w分子的恒定結構域源自人抗體的恒定結構域。在一些實施方式中，人源化抗體的框架區(qū)的特定殘基，特別是正接觸或接近CDR序列的那些，可以被修飾，例如利用來自原始嚙齒動物、類人靈長類動物或其它抗體的相應殘基替換。本文中的“人抗體”意思是例如，從轉基因小鼠獲得的抗體，該轉基因小鼠已經被“工程化”以響應抗原挑戰(zhàn)產生特異性人抗體。在該技術中，人重和輕鏈基因座的元件被引入源自胚胎干細胞系的小鼠品系，其包含內源重鏈和輕鏈基因座的靶向破壞。轉基因小鼠可以合成對人抗原特異性的人抗體，并且小鼠可以用于產生分泌人抗體的雜交瘤。用于從轉基因小鼠獲得人抗體的方法由Green等，NatureGenet7：13(1994)、Lonberg等，Nature368：856(1994)和Taylor等，IntImmun.6：579(1994)描述。完全人抗體還可以通過基因或染色體轉染方法，以及噬菌體展示技術構建，其全部是本領域中已知的。參見，例如，McCafferty等，Nature348：552-553(1990)，其用于從來自未免疫供體的免疫球蛋白可變結構域基因所有組成成分(repertoire)在體外生產人抗體和其片段。在該技術中，抗體可變結構域基因被框內克隆成為絲狀噬菌體的主要的或次要的外殼蛋白基因，并在噬菌體顆粒的表面上展示為功能性抗體片段。由于絲狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，因此基于抗體的功能性質的選擇還導致選擇編碼展示那些性質的抗體的基因。以這種方式，噬菌體模仿B細胞的一些性質。噬菌體展示技術可以以多種形式執(zhí)行，對于其綜述，參見，例如，Johnson和Chiswell，CurrentOpinioninStructuralBiology3：5564-571(1993)。人抗體還可以由體外激活的B細胞生成。參見，美國專利號5,567,610和5,229,275，其通過引用以其全部并入本文。本文中的“抗體融合蛋白”意思是重組產生的抗原結合分子，在該分子中具有相同或不同特異性的兩種或多種相同的或不同的天然抗體、單鏈抗體或抗體片段區(qū)段被連接。融合蛋白包括至少一個特異性結合位點。融合蛋白的價指示融合蛋白具有的對抗原(一種或多種)或表位(一種或多種)的結合臂或位點的總數(shù)，即，單價的、二價的、三價的或多價的。抗體融合蛋白的多價意思是其在結合至抗原中可以利用多個相互作用，因而增加結合至抗原或至不同抗原的親合力。特異性指的是抗體融合蛋白能夠結合多少種不同類型的抗原或表位，即，單特異性的、雙特異性的、三特異性的、多特異性的。使用這些定義，天然抗體，例如，IgG，是二價的，因為其具有兩個結合臂，但是為單特異性的，因為其結合至一種類型的抗原或表位。單特異性的、多價的融合蛋白對于相同的抗原或表位具有多于一個結合位點。例如，單特異性的雙抗體是具有與相同抗原反應的兩個結合位點的融合蛋白。融合蛋白可以包括不同抗體成分或相同抗體成分的多個拷貝的多價或多特異性組合。融合蛋白可以另外地包括治療劑。在一些實施方式中，抗體基于其對在組織樣本中感興趣的目標細胞上或目標位點處表達的抗原的特異性進行選擇。多種腫瘤特異性的或其它疾病特異性的抗原已經被識別并且針對這些抗原的抗體已經被使用或者被提議使用治療這樣的腫瘤或其它疾病。在本領域中已知的抗體可以在本發(fā)明的復合物中使用，具體地用于治療與目標抗原相關聯(lián)的疾病?？梢园邢虮景l(fā)明的抗體-連接體-藥物綴合物的目標抗原(和其相關的疾病)的實例包括：CD2、CD19、CD20、CD22、CD27、CD33、CD37、CD38、CD40、CD44、CD47、CD52，CD56，CD70、CD79、CD137、4-1BB、5T4、AGS-5、AGS-16、血管生成素2、B7.1、B7.2、B7DC、B7H1、B7H2、B7H3、BT-062、BTLA、CAIX、癌胚抗原、CTLA4、Cripto、ED-B、ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4、EGFL7、EpCAM、EphA2、EphA3、EphB2、FAP、纖連蛋白、葉酸鹽受體、神經節(jié)苷脂GM3、GD2、糖皮質激素-誘導的腫瘤壞死因子受體(GITR)、gp100、gpA33、GPNMB、ICOS、IGF1R、整聯(lián)蛋白αν、整聯(lián)蛋白ανβ、KIR、LAG-3、路易斯Y、間皮素、c-MET、MN碳酸酐酶IX、MUC1、MUC16、柄蛋白-4、NKGD2、NOTCH、OX40、OX40L、PD-1、PDL1、PSCA、PSMA、RANKL、ROR1、ROR2、SLC44A4、黏結蛋白聚糖-1、TACI、TAG-72、生腱蛋白、TIM3、TRAILR1、TRAILR2、VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3。在一些實施方式中，抗體是抗ROR2、抗Ck8/18、抗Ki-67、抗Ck5、抗Mart-1、抗S100或抗CD45抗體。在一些實施方式中，綴合物包括Fab、Fab’、F(ab’)2、單結構域抗體、T和Ab二聚體、Fv、scFv、dsFv、ds-scFv、Fd、線性抗體、微型抗體(minibody)、雙抗體、雙特異性抗體片段、二抗體(bibody)、三抗體(tribody)、sc-雙抗體、κ(λ)抗體、BiTE、DVD-Ig、SIP、SMIP、DART或包含一個或多個CDS的抗體類似物。在一些實施方式中，綴合物包括一次抗體。本文中的“一次抗體”意思是特異性地結合至組織樣本中的目標蛋白抗原的抗體。一次抗體通常是免疫組織化學(IHC)過程中使用的第一抗體。在一些實施方式中，一次抗體是在IHC過程中唯一使用的抗體。在一些實施方式中，綴合物包括二次抗體。本文中的“二次抗體”意思是如此抗體：其特異性地結合至一次抗體，從而在一次抗體和后續(xù)的試劑——如果有的話——之間形成橋接。二次抗體通常是免疫組織化學過程中使用的第二抗體。在一些實施方式中，抗體識別目標分析物經由直接結合。在一些實施方式中，抗體識別目標分析物經由間接結合。在一些實施方式中，抗體特異性地結合至目標分析物經由直接結合。在一些實施方式中，抗體特異性地結合至目標分析物經由間接結合。在一些實施方式中，抗體的結合親和力為大約10-7至10-13(Kd)。酶一般而言，抗體綴合物包括多個酶分子。在一些實施方式中，抗體綴合物包括多個酶分子，其中所述多個酶分子包括相同的酶類型(例如，抗體綴合物的所有酶分子是辣根過氧化物酶)。酶通常催化可以使用多種技術測量的顯色底物的化學改變。例如，酶可以催化可以分光光度法測量的底物的顏色改變?？蛇x地，酶可以改變底物的熒光或化學發(fā)光?；瘜W發(fā)光的底物通過化學反應被電子地激發(fā)，然后可以發(fā)射可以被測量的(例如，使用化學光度計)光或者將能量給出至熒光受體。酶標簽的實例包括熒光素酶(例如，螢火蟲熒光素酶和細菌熒光素酶；美國專利號4,737,456)、熒光素、2，3-二氫酞嗪二酮、蘋果酸脫氫酶、脲酶、過氧化物酶例如辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖類氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環(huán)氧化酶(比如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化物酶、微過氧化物酶等。用于將酶綴合至抗體的技術在O′Sullivan等，MethodsforthePreparationofEnzyme-AntibodyConjugatesforuseinEnzymeImmunoassay，inMethodsinEnzym(ed.J.Langone&H.VanVunakis)，Academicpress，NewYork，73：147-166(1981)中描述。酶-底物組合的實例包括，例如：(i)辣根過氧化物酶(HRP)與作為底物的過氧化氫酶，其中過氧化氫酶氧化染料前體[例如，鄰苯二胺(OPD)或鹽酸3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)]；(ii)堿性磷酸酶(AP)與作為顯色底物的對硝基苯磷酸酯；和(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)與顯色底物(例如，對硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或熒光底物(例如，4-甲基傘形酮-β-D-半乳糖苷酶)。在一些實施方式中，酶選自β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-內酰胺酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、脲酶、尿酸酶、超氧化物歧化酶、熒光素酶、丙酮酸激酶、乳酸脫氫酶、半乳糖氧化酶、乙酰膽堿酯酶、腸激酶、酪氨酸酶和黃嘌呤氧化酶。聚合的-酶一般而言，抗體綴合物包括包含多個酶分子的聚合的-酶。在一些實施方式中，聚合的-酶的多個酶分子共價地連接。在一些實施方式中，聚合的-酶的多個酶分子經由交聯(lián)試劑共價地連接。在一些實施方式中，酶包括蛋白成分。在一些實施方式中，聚合的-酶的多個酶分子經由蛋白成分共價地連接。在一些實施方式中，酶分子包括多糖成分。在一些實施方式中，聚合的-酶的多個酶分子經由多糖成分共價地連接。在一些實施方式中，聚合的-酶的多個酶分子經由多糖和蛋白成分共價地連接。在一些實施方式中，聚合的-酶的多個酶分子非共價地連接。在一些實施方式中，多個酶分子包括多聚體酶(multimericenzyme)。在一些實施方式中，多個酶分子包括酶團聚體。一般而言，聚合過程在使得預選大小的聚合的-酶的受控的和可重現(xiàn)的形成的條件下進行。酶的濃度、緩沖液的pH、自由官能團相對于交聯(lián)試劑的化學計量、溫度和反應時間在實現(xiàn)該可控制的過程中都是重要的因素。在一些實施方式中，聚合的-酶包括大約5至大約500個酶分子。在一些實施方式中，聚合的-酶包括至少大約5、10、15、20、25、50、75、100、150、200或250個酶分子。在一些實施方式中，聚合的-酶包括少于大約250、200、150、100、75、50、25、20、15、10或5個酶分子。在一些實施方式中，聚合的-酶的酶分子經由交聯(lián)試劑共價地連接。在一些實施方式中，聚合的-酶的酶分子經由零長度交聯(lián)試劑共價地連接。在一些實施方式中，聚合的-酶的酶分子以線性方式共價地連接。在一些實施方式中，聚合的-酶的酶分子以分支方式共價地連接。在一些實施方式中，聚合的-酶的酶分子以混合的線性和分支方式共價地連接。在一些實施方式中，聚合的-酶的酶分子共價地連接以形成線性結構。在一些實施方式中，聚合的-酶的酶分子共價地連接以形成球狀結構。在一些實施方式中，包含多個聚合的-酶的聚合的-酶的群體包括以每個聚合的-酶的酶分子數(shù)目為特征的聚合的-酶的大小分布。在一些實施方式中，包含多個聚合的-酶的聚合的-酶的群體包括以聚合的-酶的結構為特征的聚合的-酶的形狀分布。在一些實施方式中，聚合的-酶具有大約500kDa至大約5兆道爾頓(MDa)的分子量。在一些實施方式中，聚合的-酶具有至少大約500kDa的分子量。在一些實施方式中，聚合的-酶具有小于或大約5MDa的分子量。在一些實施方式中，聚合物-酶具有至少大約750kDa的分子量。在一些實施方式中，聚合物-酶具有至少大約1、2、3或4MDa的分子量。在一些實施方式中，聚合的-酶在被綴合至抗體之前首先形成。酶/抗體綴合物一般而言，酶綴合至抗體。在一些實施方式中，多于一個酶分子綴合至抗體。在一些實施方式中，酶分子綴合至多于一個抗體。在一些實施方式中，多于一個抗體綴合至酶分子。在一些實施方式中，多于一個酶分子綴合至多于一個抗體。在一些實施方式中，多于一個抗體綴合至多于一個酶。本文中的“綴合”或“附接”或“連接”意思是結合劑(比如抗體)和聚合物(比如酶聚合物)或酶分子共價的或非共價的、以及直接的或間接的締合。本發(fā)明中考慮的抗體綴合物包括在體外使用的那些，其中抗體連接至二級結合配體和/或連接至酶(酶標志)——其在與顯色底物接觸之后將生成有色產物。適合的酶的實例包括脲酶、堿性磷酸酶、(辣根)過氧化氫酶和/或葡萄糖氧化酶。優(yōu)選的二級結合配體是生物素和/或抗生物素蛋白和鏈霉抗生物素復合物。這些標簽的使用對于本領域技術人員而言是熟知的并且例如在美國專利號3,817,837、3,850,752、3,939,350、3,996,345、4,277,437、4,275,149和4,366,241中描述；每篇通過引用并入本文。包含疊氮基團的分子也可用于通過反應性氮烯中間體與蛋白質形成共價鍵，該反應性氮烯中間體通過低強度紫外光生成(Potter&Haley，1983)。具體而言，嘌呤核苷酸的2-和8-疊氮基類似物已經被用作位點定向的光探針來在粗細胞提取物中識別核苷酸結合蛋白(Owens&Haley，1987；Atherton等，1985)。2-和8-疊氮基核苷酸也已經被用于映射(map)純化蛋白的核苷酸結合結構域(Khatoon等，1989；King等，1989；和Dholakia等，1989)并且可以被用作抗體結合劑。用于附接或綴合抗體至其綴合部分的數(shù)種方法是已知的。一些附接方法包括使用金屬螯合物復合體，例如，采用附接至抗體的有機螯合劑，比如二亞乙基三胺五乙酸酸酐(DTPA)；亞乙基三胺四乙酸；N-氯-對甲苯磺酰胺；和/或四氯-3α-6α-二苯基甘脲-3(tetrachloro-3α-6α-diphenylglycouril-3)(美國專利號4,472,509和4,938,948，每篇通過引用并入本文)。單克隆抗體還可以在偶聯(lián)劑比如戊二醛或高碘酸鹽的存在下與酶反應。具有熒光素標記的綴合物在這些偶聯(lián)劑的存在下或者通過與異硫氰酸酯反應來制備。在美國專利號4,938,948中，例如，乳腺癌的成像使用單克隆抗體實現(xiàn)，并且可檢測的成像部分使用連接體結合至抗體，連接體比如對羥苯甲亞胺酸甲酯或N-琥珀酰亞胺基-3-(4-羥苯基)丙酸酯。在其它實施方式中，考慮了通過使用不改變抗體結合位點的反應條件選擇性地將巰基引入免疫球蛋白的Fc區(qū)來衍生免疫球蛋白。根據(jù)該方法生產的抗體綴合物被公開，以展示提高的存活力、特異性和靈敏性(美國專利號5,196,066，通過引用并入本文)。位點特異性附接效應物或報道分子——其中報道或效應物分子綴合至Fc區(qū)中的碳水化合物殘基——也已經在文獻(O′Shannessy等，1987)中被公開。聚合的-酶/抗體綴合物一般而言，包含多個酶分子的聚合的-酶綴合至抗體。在一些實施方式中，聚合的-酶/抗體綴合物根據(jù)比如由美國專利號4,657,853公開的方法生成，該專利通過引用以其全部并入。在一些實施方式中，方法包括如下連續(xù)步驟：(a)共價地連接至少兩個酶分子以產生聚合的-酶；和(b)共價地連接聚合的-酶至抗體或其片段。在一些實施方式中，聚合的-酶綴合至抗體或其片段上的特異性位點。在一些實施方式中，聚合的-酶綴合至抗體或其片段上的一個或多個特異性位點。在一些實施方式中，聚合的-酶綴合至抗體或其片段上的隨機位點。在一些實施方式中，聚合的-酶綴合至抗體或其片段上的一個或多個隨機位點。在一些實施方式中，聚合的-酶經由氨基酸的固有的或外源的化學特性綴合至抗體或其片段。在一些實施方式中，聚合的-酶經由氨基酸殘基的固有的或外源的化學特性綴合至抗體或其片段。在一些實施方式中，抗體綴合物包括一個或多個聚合的-酶。在一些實施方式中，抗體綴合物包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20個聚合的-酶。在一些實施方式中，抗體綴合物包括1和20個之間的聚合的-酶。在一些實施方式中，抗體綴合物包括每個綴合物大約6至大約16、18、20、22、24、26、28、30、40、50、60、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200或更多個之間的酶分子。在一些實施方式中，抗體綴合物包括每個綴合物至少6-24個之間、6-26個之間、6-28之間、6-30個之間、6-40個之間、6-50個之間、6-60個之間、6-70個之間、6-80個之間、6-90個之間或6-100個之間的酶分子。在一些實施方式中，抗體綴合物包括每個綴合物至少6、8、10、12、14、16、18、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200，但是不多于250、300、350、400或500個酶分子。在一些實施方式中，抗體綴合物具有在大約400kDa至大約500kDa、600kDa、700kDa、800kDa、900kDa、1000kDa、2000kDa、3000kDa、4000kDa、5000kDa、6000kDa、7000kDa、8000kDa、9000kDa或10000kDa之間的分子量。在一些實施方式中，抗體綴合物具有在大約470kDa至大約4.7兆Da之間的分子量。在一些實施方式中，聚合的-酶/抗體綴合物包括多于一個抗體。在一些實施方式中，聚合的-酶/抗體綴合物包括多個聚合的-酶。在一些實施方式中，聚合的-酶/抗體綴合物包括多個聚合的-酶，其中每個聚合的-酶包括大約相同數(shù)目的酶分子。在一些實施方式中，聚合的-酶/抗體綴合物包括多個聚合的-酶，其中多個聚合的-酶展示每個聚合的-酶的酶分子數(shù)目的分布。在一些實施方式中，聚合的-酶/抗體綴合物包括多個聚合的-酶，其中多個聚合的-酶展示聚合的-酶的形狀的差異。在一些實施方式中，聚合的-酶/抗體綴合物具有大于1∶8的比率(抗體與酶)。在一些實施方式中，聚合的-酶/抗體綴合物具有大于1∶6的比率(抗體與酶)。在一些實施方式中，聚合的-酶/抗體綴合物具有大約1∶6、1∶8、1∶15、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶75、1∶100、1∶125、1∶150、1∶200的比率(抗體與酶)。在一些實施方式中，調節(jié)綴合至聚合的-酶/抗體綴合物的聚合的-酶的數(shù)目以使得增加的組織穿透力和目標分析物檢測。在一些實施方式中，調節(jié)聚合的-酶/抗體綴合物的重量比以使得增加的組織穿透力和目標分析物檢測。在一些實施方式中，綴合至聚合的-酶/抗體綴合物的每個聚合的-酶的酶數(shù)目使得增加的組織穿透力和目標分析物檢測。在一些實施方式中，綴合至聚合的-酶/抗體綴合物的聚合的-酶的大小使得增加的組織穿透力和目標分析物檢測。在一些實施方式中，聚合的-酶/抗體綴合物是自Novodiax，Inc.(Hayward，CA)可獲得的綴合物，目錄號K29301-1/8、Q31001、Q31002、Q31003、Q31004、Q31005、D28001、D28002、D28003、D28004、D28005或D28006。酶底物一般而言，包含酶特異性底物的溶液與聚合的-酶/抗體綴合物一起孵育以使得檢測。在一些實施方式中，包含酶特異性底物的溶液由所述酶特異性底物的母液制備。在一些實施方式中，包含酶特異性底物的溶液和/或母液酶特異性底物不含雜質。在一些實施方式中，用于制備包含酶特異性底物的溶液和/或酶特異性底物母液的溶液(例如，緩沖液)不含雜質。在一些實施方式中，雜質將抑制酶的催化反應。在一些實施方式中，酶特異性底物是基本上純的。在一些實施方式中，酶特異性底物的純度為80％、85％、90％、95％、99％、99.5％或99.9％純的。在一些實施方式中，包含酶特異性底物的溶液被制備，然后立即與聚合的-酶/抗體綴合物一起孵育。在一些實施方式中，聚合物-酶的酶分子催化多于一種底物類型。在一些實施方式中，酶是辣根過氧化物酶并且底物是DAB(3，3′-二氨基聯(lián)苯胺色原)。在一些實施方式中，酶是辣根過氧化物酶并且底物是AEC(3-氨基-9-乙基咔唑)。在一些實施方式中，酶是辣根過氧化物酶并且底物是AMECRed。在一些實施方式中，酶是辣根過氧化物酶并且底物是TMB(3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺)。在一些實施方式中，酶是堿性磷酸酶并且底物是堅牢紅(FastRed)(Sigma-Aldrich，ST.Louis，MO)。在一些實施方式中，酶是堿性磷酸酶并且底物是BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/氮藍四唑)。E.免疫檢測方法IHC的兩種一般方法是可利用的：間接和直接測定。在典型的間接測定中，未綴合的一次抗體結合至抗原，然后標記的二次抗體結合至一次抗體。二次抗體綴合至酶標簽——顯色的或熒光的底物——以使得抗原可視化。信號放大發(fā)生，這是由于數(shù)個二次抗體可以與一次抗體上的不同表位反應。在典型的直接測定中，結合抗體至目標抗原被直接地確定。這種直接測定使用標記的試劑，比如熒光標志或酶標記的一次抗體，其可以在不進行進一步抗體相互作用的情況下可視化。直接測定在一方面，本發(fā)明提供了用于直接IHC測定的組合物和方法。在這種直接測定中，使用包含一次抗體的聚合的-酶/抗體綴合物。在一些實施方式中，直接測定用于檢測組織中的目標分析物。在一些實施方式中，聚合的-酶/抗體綴合物用于直接檢測組織中的目標分析物。在一些實施方式中，直接IHC方法用于檢測組織中的目標分析物，其中該方法包括使用聚合的-酶/抗體綴合物。在一些實施方式中，直接IHC方法用于測定組織中目標分析物的水平，其中該方法包括使用聚合的-酶/抗體綴合物。在一些實施方式中，直接IHC方法用于測定組織中目標分析物的存在，其中該方法包括使用聚合的-酶/抗體綴合物。在一些實施方式中，直接IHC方法用于測定組織中可檢測的存在的目標分析物的缺乏，其中該方法包括使用聚合的-酶/抗體綴合物。在一些實施方式中，直接測定用于檢測組織樣本(例如，組織切片)，優(yōu)選地FFPE切片或冷凍的組織切片中的目標分析物。除了上面討論的樣品制備過程之外，在IHC之前、期間或之后可以期望進一步處理組織切片。例如，可以進行表位恢復方法，比如在檸檬酸鹽緩沖液中加熱組織樣本。參見，例如，Leong等，ApplImmunohistochem4(3)：201(1996)。在任選的封閉步驟之后，在適合的條件下將組織切片暴露于一次抗體(例如，聚合的-酶/抗體綴合物)持續(xù)足夠的時間段(“孵育時間”)，使得一次抗體結合至組織樣本中的目標蛋白抗原。在一些實施方式中，在適合的條件下將組織與一次聚合的-酶/抗體綴合物一起孵育持續(xù)足夠的時間段，使得一次聚合的-酶/抗體綴合物結合至組織中的目標蛋白抗原。在一些實施方式中，在適合的條件下將組織與一組一次聚合的-酶/抗體綴合物(例如，多于一個)一起孵育持續(xù)足夠的時間段，使得一次聚合的-酶/抗體綴合物結合至組織中的目標蛋白抗原，其中該組聚合的-酶/抗體綴合物包括至少一種聚合的-酶/抗體綴合物——其與該組中的另一種聚合的-酶/抗體綴合物相比具有不同的目標分析物結合特異性。用于實現(xiàn)這個目標的適合的條件可以通過常規(guī)實驗確定。結合抗體至樣本的程度通過使用上面討論的可檢測的標簽的任何一種來確定。優(yōu)選地，標簽是酶標簽(例如，HRP)，其催化顯色底物比如3，3′-二氨基聯(lián)苯胺色原的化學改變。更優(yōu)選地，標簽是聚合的-酶(例如，聚HRP或聚合的-HRP)，其催化顯色底物比如3，3′-二氨基聯(lián)苯胺色原的化學改變。在一些實施方式中，本文描述的IHC方法以高通量方式進行。在一些實施方式中，本文描述的使用聚合的-酶/抗體綴合物的IHC方法以高通量方式進行。在一些實施方式中，本文描述的直接IHC方法以高通量方式進行。在一些實施方式中，本文描述的使用聚合的-酶/抗體綴合物的直接IHC方法以高通量方式進行。目標分析物/抗體復合體的形成一般而言，包含目標分析物的組織樣本(例如，組織切片)與聚合的-酶/抗體綴合物在大約15℃和大約50℃之間的孵育溫度下接觸大約3分鐘至大約1小時之間的孵育周期以形成包含目標分析物和至少一種抗體綴合物的復合體，并且抗體綴合物是能夠特異性地結合至目標分析物的一次抗體。在一些實施方式中，包含一系列目標分析物(例如，分析物A和分析物B)的組織與一組聚合的-酶/抗體綴合物(例如，特異性地結合分析物A的聚合的-酶/抗體復合體和特異性地結合分析物B的聚合的-酶/抗體復合體)在大約15℃和大約50℃之間的孵育溫度下接觸大約3分鐘至大約1小時之間的孵育周期以形成包含目標分析物和至少一種抗體綴合物的一系列復合體，并且抗體綴合物是能夠特異性地結合至它們各自的目標分析物的一次抗體。在一些實施方式中，IHC染色利用包含磷酸鹽、tris、MOPS、MES、HEPES或碳酸氫鹽的緩沖液進行，并且任選地緩沖液包含選自以下的一種或多種成分：乙基汞硫代水楊酸鈉、proclin300、錳、鈣、鐵、鎂、鋅、具有400到40,000Da的分子量的聚乙二醇、乙二醇、甘油、牛血清白蛋白、馬血清白蛋白、山羊血清白蛋白、兔血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、明膠、吐溫20、吐溫30、具有300-30,000Da的分子量的硫酸葡聚糖或具有500-25,000Da的分子量的DEAE葡聚糖。每種成分——如果包括的話——的量是本領域中通常使用的量。用于增加抗體結合至目標抗原的緩沖液的優(yōu)化和其使用方法是本領域中熟知的。在一些實施方式中，IHC染色利用緩沖液比如PBS或TBS緩沖液進行，所述緩沖液任選地具有牛血清白蛋白(BSA)和/或聚乙二醇(″PEG″)，比如具有200、300、400、600、1000、1500、2000、3000、4000、50000、6000、10000或20000分子量的PEG，優(yōu)選地PEG400、1500或6000。在一些實施方式中，緩沖液是來自Novodiax，Inc.(Hayward，CA)的商業(yè)化緩沖液，例如產品目錄號C30001。在一些實施方式中，孵育溫度在大約15℃和大約18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50℃之間，在大約20℃和大約21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50℃之間，在大約25℃和大約30℃之間，或在大約25℃和大約37℃之間。在一些實施方式中，孵育溫度是大約14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃。在一些實施方式中，孵育溫度為小于大約14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃。在一些實施方式中，孵育溫度為大于大約14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃。在一些實施方式中，孵育周期為在大約3分鐘至大約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘之間，在5分鐘至大約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘之間，在10分鐘至大約15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘之間，在大約15分鐘至大約20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘之間，在大約20分鐘至大約25、30、35、40、45、50、55或60分鐘之間，在大約25分鐘至大約30、35、40、45、50、55或60分鐘之間，在大約30分鐘至大約35、40、45、50、55或60分鐘之間。在一些實施方式中，孵育周期為大約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘。在一些實施方式中，孵育周期小于大約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘。在一些實施方式中，孵育周期大于大約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘。洗滌步驟在孵育之后，組織樣本通常利用洗滌緩沖液洗滌，所述洗滌緩沖液比如PBS、TBS、MOPS、MES、HEPES或碳酸氫鹽緩沖液，并且任選地包含洗滌劑，比如吐溫(例如，0.01-0.2％)。一種示例性的緩沖液是含有0.05％吐溫20的10mMPBS。洗滌步驟進行2到6次，優(yōu)選地3、4或5次，每個洗滌步驟持續(xù)1、2、3、4、5、6、7、8、9或10分鐘或更多的周期。在一些實施方式中，洗滌溫度在大約15℃和大約18、19、20、21、22、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50℃之間，在大約20℃和大約21、22、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50℃之間，在大約25℃和大約30℃之間，或在大約25℃和大約37℃之間。在一些實施方式中，洗滌溫度為大約14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃。在一些實施方式中，洗滌溫度低于大約14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃。在一些實施方式中，洗滌溫度大于大約14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃。在一些實施方式中，洗滌周期在大約3分鐘至大約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘之間，在5分鐘至大約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘之間，在10分鐘至大約15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘之間，在大約15分鐘至大約20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘，在大約20分鐘至大約25、30、35、40、45、50、55或60分鐘，在大約25分鐘至大約30、35、40、45、50、55或60分鐘之間，或在大約30分鐘至大約35、40、45、50、55或60分鐘之間。在一些實施方式中，洗滌周期為大約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘。在一些實施方式中，洗滌周期小于大約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘。在一些實施方式中，洗滌周期大于大約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘。在一些實施方式中，洗滌步驟進行2至6次，每個洗滌步驟持續(xù)1、2、3、4、5、6、7、8、9或10分鐘或更多的周期，其中洗滌溫度小于大約14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃。在一些實施方式中，洗滌步驟進行2至6次，每個洗滌步驟持續(xù)大約1、2、3、4、5、6、7、8、9或10分鐘或更多的周期，其中洗滌溫度大于大約14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃。在一些實施方式中，包括使用聚合的-酶/抗體綴合物的方法的洗滌步驟的數(shù)目與使用綴合有單個酶分子的抗體的方法相比被減少。在一些實施方式中，包括使用聚合的-酶/抗體綴合物的方法的洗滌步驟的長度與使用綴合有單個酶分子的抗體的方法相比被減少。在一些實施方式中，包括使用聚合的-酶/抗體綴合物的方法的洗滌步驟的數(shù)目和洗滌步驟的長度與使用綴合有單個酶分子的抗體的方法相比被減少。在一些實施方式中，包括使用聚合的-酶/抗體綴合物的方法的洗滌溶液的嚴格性大于在使用綴合有單個酶分子的抗體的方法中使用的洗滌溶液的嚴格性。在一些實施方式中，包括使用聚合的-酶/抗體綴合物的方法的洗滌溶液的嚴格性小于在使用綴合有單個酶分子的抗體的方法中使用的洗滌溶液的嚴格性。封閉步驟在一些實施方式中，IHC染色過程進一步包括在將抗體綴合物與組織一起孵育之前的封閉步驟，其中所述封閉步驟包括使所述組織與封閉劑接觸。在一些實施方式中，封閉劑包括脫脂乳、BSA、冷的魚皮明膠、酪蛋白或動物血清。在一些實施方式中，封閉劑包括緩沖液，比如含有BSA的TBS或PBS。在一些實施方式中，封閉劑包括緩沖液體系，其選自PBS、TBS、MOPS、MES、HEPES和碳酸氫鹽，任選地具有0.5-6％的牛血清白蛋白、馬血清白蛋白、山羊血清白蛋白、兔血清白蛋白或明膠，和0.001-0.05％的吐溫20。在一些實施方式中，封閉劑包括大約1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的脫脂乳。在一些實施方式中，封閉劑包括大約1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的BSA。在一些實施方式中，封閉溫度在大約15℃和大約18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50℃之間，在大約20℃和大約21、22、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50℃之間，在大約25℃和大約30℃之間，或在大約25℃和大約37℃之間。在一些實施方式中，封閉溫度為大約14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃。在一些實施方式中，封閉溫度小于大約14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃。在一些實施方式中，封閉溫度大于大約14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃。在一些實施方式中，封閉周期在大約3分鐘至大約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘之間，在5分鐘至大約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘之間，在10分鐘至大約15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘之間，在大約15分鐘至大約20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘之間，在大約20分鐘至大約25、30、35、40、45、50、55或60分鐘之間，在大約25分鐘至大約30、35、40、45、50、55或60分鐘之間，或在大約30分鐘至大約35、40、45、50、55或60分鐘之間。在一些實施方式中，封閉周期為大約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘。在一些實施方式中，封閉周期小于大約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘。在一些實施方式中，封閉周期大于大約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘。在一些實施方式中，封閉步驟執(zhí)行1、2、3、4或5次。在一些實施方式中，封閉步驟執(zhí)行1、2或3次，其中封閉劑包括大約1％、2％、3％、4％、5％、6％或7％的脫脂乳，并且其中封閉周期小于大約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘。在一些實施方式中，封閉步驟執(zhí)行1、2或3次，其中封閉劑包括大約1％、2％、3％、4％、5％、6％或7％的脫脂乳，并且其中封閉周期大于大約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘。在一些實施方式中，封閉步驟執(zhí)行1、2或3次，其中封閉劑包括大約1％、2％、3％、4％、5％、6％或7％的BSA，并且其中封閉周期小于大約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘。在一些實施方式中，封閉步驟執(zhí)行1、2或3次，其中封閉劑包括大約1％、2％、3％、4％、5％、6％或7％的BSA，并且其中封閉周期大于大約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘。在一些實施方式中，組織還可以被形態(tài)學染色。在一些實施方式中，組織可以被復染(counterstain)以使得識別細胞或細胞成分。在一些實施方式中，組織樣本可以使用本領域中已知的方法利用蘇木精復染，并脫水進行長期儲存。在一些實施方式中，組織樣本可以利用H/E染色。檢測步驟在洗滌步驟之后，將包含酶的底物——比如用于HRP的DAB或用于AP的堅牢紅——的檢測劑添加至組織樣本。在一些實施方式中，檢測試劑包括緩沖液，比如PBS或TBS緩沖液，任選地具有BSA和/或聚乙二醇。在一些實施方式中，染色利用緩沖液進行，所述緩沖液包含磷酸鹽、tris、MOPS、MES、HEPES或碳酸氫鹽，并且任選地包括乙基汞硫代水楊酸鈉(hiomersal)、proclin300、錳、鈣、鐵、鎂、鋅、具有400至40,000Da分子量的聚乙二醇、乙二醇、甘油、牛血清白蛋白、馬血清白蛋白、山羊血清白蛋白、兔血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、明膠、吐溫20、吐溫30、具有300-30,000Da分子量的硫酸葡聚糖或具有500-25,000分子量的DEAE葡聚糖。在一些實施方式中，檢測溫度在大約15℃和大約18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50℃之間，在大約20℃和大約21、22、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50℃之間，在大約25℃和大約30℃之間，或在大約25℃和大約37℃之間。在一些實施方式中，檢測溫度為大約14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃。在一些實施方式中，檢測溫度低于大約14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃。在一些實施方式中，檢測溫度大于大約14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃。在一些實施方式中，孵育周期在大約3分鐘至大約30分鐘之間、在大約5分鐘至大約15分鐘之間或在大約3分鐘至大約5分鐘之間。在一些實施方式中，孵育周期為大約1、2、3、5、7、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘。在一些實施方式中，孵育周期小于大約1、2、3、5、7、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘。在一些實施方式中，孵育周期大于大約1、2、3、5、7、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘。在一些實施方式中，檢測溫度為大約14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃，并且孵育周期為大約1、2、3、5、7、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘。在一些實施方式中，檢測溫度低于大約14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃，并且孵育周期小于大約1、2、3、5、7、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘。在一些實施方式中，檢測溫度大于大約14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃，并且孵育周期小于大約1、2、3、5、7、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘。在一些實施方式中，檢測溫度小于大約14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃，并且孵育周期大于大約1、2、3、5、7、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘。在一些實施方式中，檢測溫度大于大約14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃或50℃，并且孵育周期大于大約1、2、3、5、7、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘。在孵育之后，組織樣本利用水比如自來水沖洗一次或多次。在一些實施方式中，酶促反應使用分光光度計檢測。在一些實施方式中，酶促反應使用化學光度計檢測。在一些實施方式中，酶促反應使用熒光檢測器檢測。在一些實施方式中，酶促反應使用比色(colormetric)信號檢測器檢測。在一些實施方式中，酶促反應使用光學顯微鏡或熒光顯微鏡檢測。在一些實施方式中，目標分析物被量化。在一些實施方式中，目標分析物被相對量化。在一些實施方式中，目標分析物相對于標準被量化。在一些實施方式中，目標分析物相對于標準曲線被量化。D.形態(tài)學染色在制備組織切片之后，在載玻片上安裝的切片可以利用形態(tài)學染色劑進行染色以進行評估。一般而言，切片利用一種或多種染料染色，其每一種獨特地染色不同的細胞成分。在一些實施方式中，黃嘌呤染料或其功能等價物和/或噻嗪染料或其功能等價物被用于增強和使得在每個組織切片內的細胞核、細胞質和“顆粒狀”結構可區(qū)分。這類染料是商業(yè)可得的并且常常成組出售。舉例而言，(CMS，Houston，Texas)染色劑組包括黃嘌呤染料和噻嗪染料。在一些實施方式中，還可以使用亞甲基藍?？梢栽诒景l(fā)明的方法中使用的其它形態(tài)學染色劑的實例包括但不限于在與另一種熒光標簽相同的波長下不顯著地自發(fā)熒光的染料。本領域技術人員將理解，通過增加或減少載玻片在染料中停留的時間長度，可以對給定的組織優(yōu)化染色。在染色之后，組織切片可以通過標準的顯微鏡學技術分析。一般而言，病理學家等評估組織中異?；蛘＜毎蛱囟毎愋偷拇嬖诓⑶姨峁└信d趣的細胞類型的位置。因此，例如，在關于乳腺癌中HER2/neu擴增的研究中，病理學家等將檢查載玻片并識別正常乳腺細胞與異常乳腺細胞。在一些實施方式中，對組織進行形態(tài)學染色和聚合的-酶/抗體綴合物染色。II.診斷方法在一方面，本申請?zhí)峁┝擞糜谠\斷(例如，伴隨診斷)的組合物、方法和試劑盒。一般而言，診斷方法包括經由包括使用聚合的-酶/抗體綴合物的方法檢測個體中目標分析物的存在或不存在(即，缺乏可測量的水平)。在一些實施方式中，聚合的酶/抗體綴合物包括治療性抗體。通過檢測治療性抗體對個體中的目標分析物的結合，方法使得技術人員選擇特別適合于使用該治療性抗體治療的個體。因此，例如，在一些實施方式中，提供了治療患有以異常水平的目標分析物為特征的疾病(例如癌癥)的個體的方法，其包括：1)使用包含綴合至識別目標分析物的抗體的多個酶分子的聚合的-酶/抗體綴合物檢測目標分析物的水平或存在；和2)給個體施用有效量的靶向目標分析物的試劑。在一些實施方式中，試劑是特異性地結合至目標分析物的抗體。在一些實施方式中，試劑是與聚合的-酶抗體綴合物中所包含的相同的抗體。在一些實施方式中，疾病是癌癥，并且目標分析物是腫瘤抗原。在一些實施方式中，提供了評估患有以異常水平的目標分析物為特征的疾病(比如癌癥)的個體對于利用靶向目標分析物的試劑治療的適應性，其包括：使用包含綴合至識別目標分析物的抗體的多個酶分子的聚合的-酶/抗體綴合物檢測目標分析物的水平或存在，其中目標分析物的水平或存在被用作評估治療適應性的基礎。在一些實施方式中，試劑是特異性地結合至目標分析物的抗體。在一些實施方式中，試劑是與聚合的-酶抗體綴合物中所包含的相同的抗體。在一些實施方式中，方法進一步包括給臨床醫(yī)生推薦治療。在一些實施方式中，疾病是癌癥，并且目標分析物是腫瘤抗原。在一些實施方式中，提供了選擇(包括識別)患有以異常水平的目標分析物為特征的疾病(比如癌癥)的個體以便利用靶向目標分析物的試劑治療的方法，其包括，使用包含綴合至識別目標分析物的抗體的多個酶分子的聚合的-酶/抗體綴合物檢測目標分析物的水平或存在，其中目標分析物的水平或存在被用作選擇(包括識別)治療個體的基礎。在一些實施方式中，試劑是特異性地結合至目標分析物的抗體。在一些實施方式中，試劑是與聚合的-酶抗體綴合物中所包含的相同的抗體。在一些實施方式中，方法進一步包括給臨床醫(yī)生推薦治療。在一些實施方式中，疾病是癌癥，并且目標分析物是腫瘤抗原。在一些實施方式中，目標抗原的檢測經由IHC進行。在一些實施方式中，目標抗原的檢測經由直接IHC進行。在一些實施方式中，試劑直接地結合至目標分析物。在一些實施方式中，試劑間接地結合至目標分析物。在一些實施方式中，試劑是小分子-、核苷酸-、或氨基酸-基試劑。在一些實施方式中，試劑是抗體或其片段。在一些實施方式中，抗體結合至與用于檢測目標分析物的聚合的-酶/抗體綴合物的抗體相同的目標分析物的表位。在一些實施方式中，抗體與用于檢測目標分析物的聚合的-酶/抗體綴合物的抗體以相同的結合親和力結合至目標分析物的相同表位。在一些實施方式中，抗體可以結合與用于檢測目標分析物的聚合的-酶/抗體綴合物的抗體不同的表位。在一些實施方式中，對目標組織檢測目標分析物的存在。在一些實施方式中，疾病是癌癥。在一些實施方式中，個體是人。在一些實施方式中，個體是人。在一些實施方式中，目標分析物是用于伴隨診斷的生物標記，比如ER、PR、HER2、EGFR、CD117(c-kit)。在一些實施方式中，治療性抗體對G蛋白偶聯(lián)受體或離子通道是特異性的。在一些實施方式中，治療性抗體對以下是特異性的：1-40-β-淀粉狀蛋白、4-1BB、5AC、5T4、ACVR2B、腺癌抗原、AGS-22M6、甲胎蛋白、血管生成素2、血管生成素3、AOC3(VAP-1)、B7-H3、炭疽桿菌(Bacillusanthracisanthrax)、BAFF、β-淀粉狀蛋白、B-淋巴瘤細胞、C242抗原、C5、CA-125、碳酸酐酶9(CA-IX)、心肌球蛋白、CCL11(嗜酸性粒細胞趨化因子(eotaxin)-1)、CCR4、CCR5、CD11、CD18、CD125、CD140a、CD147(基礎免疫球蛋白(basigin))、CD15、CD152、CD154(CD40L)、CD19、CD2、CD20、CD200、CD22、CD221、CD23(IgE受體)、CD25(IL-2受體的α鏈)、CD27、CD28、CD3、CD3ε、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD37、CD38(環(huán)狀ADP核糖水解酶)、CD4、CD40、CD41(整聯(lián)蛋白α-IIb)、CD44v6、CD5、CD51、CD52、CD56、CD6、CD70、CD74、CD79B、CD80、CEA、CEA-相關抗原、CFD、ch4D5、CLDN18.2、艱難梭狀芽胞桿菌(Clostridiumdifficile)、凝聚因子A、CSF2、CTLA-4、DLL4、DR5、EGFL7、EGFR、內毒素、EpCAM、CD3、上皮唾液蛋白、ERBB3、FAP、纖維蛋白II、β鏈、纖連蛋白額外結構域-B(fibronectinextradomain-B)、葉酸鹽受體1、卷曲蛋白受體(Frizzledreceptor)、神經節(jié)苷脂GD2、神經節(jié)苷脂GD3、GMCSF受體α-鏈、GPNMB、血細胞凝集素、HER1、HER2/neu、HER3、HGF、HHGFR、HNGF、Hsp90、人分散因子受體激酶、ICAM-1(CD54)、IFN-α、IFN-γ、IGF-1受體、IGF-I、IGHE、IL20、IL-1、IL-12、IL-23、IL-17A、IL-1β、IL-22、IL23、IL-4、IL-5、IL-6、IL-6受體、IL9、ILGF2、整聯(lián)蛋白α4β7、整聯(lián)蛋白α5β1、整聯(lián)蛋白α7β7、整聯(lián)蛋白αIIbβ3、整聯(lián)蛋白ανβ3、干擾素受體、干擾素α/β受體、干擾素γ誘導的蛋白質、ITGA2、ITGB2(CD18)、KIR2D、路易斯-Y抗原、LFA-1(CD11a)、脂磷壁酸、LOXL2、L-選擇蛋白(CD62L)、LTA、MCP-1、間皮素、MS4A1、MUC1、粘蛋白CanAg、肌生成抑制蛋白(Myostatin)、NARP-1、NCA-90(粒細胞抗原)、NGF、N-羥乙酰神經氨酸、NOGO-A、Notch受體、NRP1、OX-40、OXLDL、PCSK9、PD-1、PD-L1、PDCD1、PDCD1、PDGF-Rα、磷酸鈉協(xié)同轉運蛋白、磷脂酰絲氨酸、RANKL、RHD、Rh因子、RON、RTN4、骨硬化蛋白(Sclerostin)、SDC1、選擇蛋白P、SLAMF7、SOST、鞘氨醇-1-磷酸酯、TAG-72、T-細胞受體、TEM1、生腱蛋白C、TFPI、TGFβ1、TGFβ2、TGF-β、TNF-α、TRAIL-R1、TRAIL-R2、腫瘤抗原CTAA16.88、MUC1的腫瘤特異性糖基化、TWEA受體、TYRP1(糖蛋白75)、VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR2、波形蛋白或VWF。本文還提供了評估患有疾病的個體是否將可能響應治療的方法，其包括使用聚合-酶/抗體綴合物確定目標分析物的存在。此外，本文提供了用于選擇(包括識別)可能響應治療的患有疾病的個體的方法，其包括(a)使用聚合的-酶/抗體綴合物檢測目標分析物的存在；和(b)施用有效量的靶向目標分析物的試劑。本文還提供了調節(jié)接受有效量的靶向目標分析物的試劑的患有疾病的個體的治療療法的方法，該方法包括使用聚合的-酶/抗體綴合物檢測從個體分離的樣本中目標分析物的存在，和基于評估調節(jié)治療療法。在一些實施方式中，調節(jié)試劑的量。在一些實施方式中，疾病是癌癥。在本文中的任何方法的一些實施方式中，方法預測和/或導致腫瘤大小或疾病或疾病進展的跡象的可測量的降低、完全響應、部分響應、疾病穩(wěn)定、無進展生存期的增加或延長、或總生存期的增加或延長。在上述的任何方法的一些實施方式中，如果個體具有通過聚合的-酶/抗體綴合物測量的可檢測的存在的目標分析物，和由腫瘤大小或疾病或疾病進展的跡象的可測量的降低、完全響應、部分響應、疾病穩(wěn)定、無進展生存期的增加或延長、或總生存期的增加或延長證明的，則個體可能響應靶向目標分析物的試劑。在方法的一些實施方式中，提供了延長個體中癌癥的無進展生存期的方法，包括基于通過聚合的-酶/抗體綴合物測量的目標分析物的存在選擇治療個體。在一些實施方式中，方法使疾病進展的時間延長1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12周中的至少一個。在方法的一些實施方式中，提供了延長患有癌癥的個體的生存期的方法，包括基于通過聚合的-酶/抗體綴合物測量的目標分析物的存在選擇治療個體。在一些實施方式中，方法使個體的生存期延長1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24月中的至少一個。在方法的一些實施方式中，提供了降低患有癌癥的個體中AE和SAE的方法，包括基于通過聚合的-酶/抗體綴合物測量的目標分析物的存在選擇治療個體。在本文描述的任何方法的一些實施方式中，方法預測和/或導致客觀響應(比如部分響應或完全響應)。在本文描述的任何方法的一些實施方式中，方法預測和/或導致改善的生活質量。在一些實施方式中，提供了使用聚合的-酶/抗體綴合物測定群體中具有可測量存在的目標分析物的個體的百分比。在一些實施方式中，目標分析物的表達使用IHC測定。在一些實施方式中，目標分析物的表達使用直接IHC測定。在一些實施方式中，目標分析物的表達使用聚合的-酶/抗體綴合物測定。在一些實施方式中，目標分析物的表達使用利用聚合的-酶/抗體綴合物的直接IHC測定。在一些實施方式中，目標分析物是腫瘤抗原。在一些實施方式中，個體是人。在一些實施方式中，提供了使用聚合的-酶/抗體綴合物測定個體中目標分析物的組織分布的方法。在一些實施方式中，對個體中多于一種組織類型測定目標分析物的組織分布。在一些實施方式中，對來自一個或多個個體的組織類型測定目標分析物的組織分布。在一些實施方式中，對來自一個或多個個體的多于一種組織類型測定目標分析物的組織分布。在一些實施方式中，目標分析物的組織分布使用IHC測定。在一些實施方式中，目標分析物的組織分布使用直接IHC測定。在一些實施方式中，組織是癌癥。在一些實施方式中，個體是人。在一些實施方式中，包括使用聚合的-酶/抗體綴合物測定組織上目標分析物的存在的方法還可以使組織上的目標分析物的存在分類(stratify)。在一些實施方式中，組織是目標分析物陽性的。在一些實施方式中，組織是目標分析物弱陽性的。在一些實施方式中，組織是目標分析物陰性的。在一些實施方式中，包括使用聚合的-酶/抗體綴合物測定目標抗原的存在的方法還可以檢測目標抗原的水平。在一些實施方式中，將個體中目標分析物的水平——如使用聚合的-酶/抗體綴合物測定的，與對照樣本中的目標分析物的水平——也如使用聚合的-酶/抗體綴合物測定的——進行比較。在一些實施方式中，將個體中目標分析物的水平——如使用聚合的-酶/抗體綴合物測定的，與多個對照樣本中的目標分析物的水平——每個如使用聚合的-酶/抗體綴合物測定的——進行比較。在一些實施方式中，多個對照樣本用于生成統(tǒng)計值，其用于將患有癌癥的個體中目標分析物的水平分類。如使用聚合的-酶/抗體綴合物測定的目標分析物的水平還可以用于測定下列的任意：(a)個體最初接受治療(一種或多種)的大概的或可能的適應性；(b)個體最初接受治療(一種或多種)的大概的或可能的不適應性；(c)對治療的響應性；(d)個體繼續(xù)接受治療(一種或多種)的大概的或可能的適應性；(e)個體繼續(xù)接受治療(一種或多種)的大概的或可能的不適應性；(f)調節(jié)劑量；(g)預測臨床益處的可能性。在一些實施方式中，如使用聚合的-酶/抗體綴合物測定的目標分析物的水平還可用于幫助評估下列的任意：(a)個體最初接受治療(一種或多種)的大概的或可能的適應性；(b)個體最初接受治療(一種或多種)的大概的或可能的不適應性；(c)對治療的響應性；(d)個體繼續(xù)接受治療(一種或多種)的大概的或可能的適應性；(e)個體繼續(xù)接受治療(一種或多種)的大概的或可能的不適應性；(f)調節(jié)劑量；(g)預測臨床益處的可能性。如本文所使用，“基于(basedupon或basedon)”包括評估、測定或測量如本文描述的個體的特性(并且優(yōu)選地選擇適合于接受治療的個體)。當如使用聚合的-酶/抗體綴合物測定的目標分析物的存在或水平被用作如本文描述的治療方法的選擇、評估(或幫助評估)、測量或測定的基礎時，在治療之前和/或期間測量目標分析物的水平，并且獲得的值可以被臨床醫(yī)生用于評估下列的任意：(a)個體最初接受治療(一種或多種)的大概的或可能的適應性；(b)個體最初接受治療(一種或多種)的大概的或可能的不適應性；(c)對治療的響應性；(d)個體繼續(xù)接受治療(一種或多種)的大概的或可能的適應性；(e)個體繼續(xù)接受治療(一種或多種)的大概的或可能的不適應性；(f)調節(jié)劑量；或(g)預測臨床益處的可能性。在一些實施方式中，個體是人。在一些實施方式中，個體是女性。在一些實施方式中，個體是男性。在一些實施方式中，個體為低于大約65歲。在一些實施方式中，個體為至少大約65歲、至少大約70歲或至少大約75歲。在一些實施方式中，個體具有慢性應激的一種或多種癥狀，包括與癌癥相關聯(lián)的身體和心理應激，比如焦慮、沮喪、頭痛、疼痛、疲勞、失眠、厭食、惡心、營養(yǎng)不良或其任意組合。在一些實施方式中，個體患有晚期癌癥，比如基于TNM分期體系的T2、T3、T4、N1、N2、N3或M1期癌癥中的任一種。在一些實施方式中，個體具有高腫瘤負荷，比如大的腫瘤尺寸和/或腫瘤床中大數(shù)目的癌細胞。在一些實施方式中，個體具有可觸及的淋巴結，或者具有擴散至附近淋巴結的癌細胞。在一些實施方式中，個體具有遠腫瘤轉移。在任何方法的一些實施方式中，癌癥選自肺癌、子宮癌、腎癌、卵巢癌、乳腺癌、子宮內膜癌、頭頸癌、胰腺癌和黑素瘤。在一些實施方式中，癌癥選自乳腺癌、肺癌和胰腺癌。在一些實施方式中，癌癥是三陰性乳腺癌(TNBC)。在一些實施方式中，癌癥是非小細胞肺癌(NSCLC)。在一些實施方式中，癌癥是胰腺導管腺癌(PDAC)。在一些實施方式中，癌癥選自腎上腺皮質癌、膽管癌、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、結腸癌、子宮內膜癌(endometroidcancer)、食管癌、成膠質細胞瘤(glioblasoma)、頭頸癌、腎嫌色細胞癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、肝癌、低級膠質瘤、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、黑素瘤、間皮瘤、眼黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、嗜鉻細胞瘤和副神經節(jié)瘤、前列腺癌、肉瘤、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌和子宮癌肉瘤。在一些實施方式中，癌癥是實體上皮細胞瘤或肉瘤。在一些實施方式中，癌癥選自腎上腺皮質癌、卡波西肉瘤、肛門癌、胃腸道類癌腫瘤、基底細胞癌、膽管癌、膀胱癌(比如膀胱移行細胞癌、膀胱鱗狀細胞癌和膀胱腺癌)、骨癌(比如尤文氏肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤和惡性纖維組織細胞瘤)、乳腺癌(比如導管癌、小葉癌、纖維腺瘤)、支氣管腫瘤、原發(fā)灶不明轉移癌、宮頸癌、脊索瘤、結腸癌、直腸癌、子宮內膜癌、食道癌(包括食管鱗狀細胞癌和食管腺癌)、眼內黑素瘤、卵巢癌(比如卵巢上皮癌、輸卵管癌和腹膜癌)、膽囊癌、胃癌、頭頸癌(比如下咽癌、喉癌、嘴唇和口腔癌(lipandoralcavitycancer)、利用隱匿性初級治療的轉移性鱗狀頸癌(metastaticsquamousneckcancerwithoccultprimarytreatment)、鼻咽癌、口咽癌、鼻旁竇和鼻腔癌、唾液腺癌以及化學療法和頭/頸輻射的口腔并發(fā)癥)、心臟腫瘤(比如橫紋肌瘤、粘液瘤、纖維瘤、纖維肉瘤和血管肉瘤)、肝細胞(肝)癌、腎癌(比如腎細胞癌、腎盂和輸尿管的移行細胞癌以及維爾姆斯腫瘤)、肺癌(比如非小細胞肺癌和小細胞肺癌)、皮膚癌(比如基底細胞癌、鱗狀細胞癌、皮膚神經內分泌癌、黑素瘤和梅克爾細胞癌)、胰腺癌、嗜鉻細胞瘤、甲狀旁腺癌、陰莖癌、垂體瘤、前列腺癌、子宮肉瘤(比如平滑肌肉瘤和子宮內膜間質肉瘤)、小腸癌(比如小腸腺癌和小腸肉瘤，以及胃腸道間質瘤)、軟組織肉瘤(比如成人軟組織肉瘤和小兒軟組織肉瘤)、甲狀腺癌(比如甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺濾泡性癌、甲狀腺髓樣癌和甲狀腺未分化癌)、尿道癌(包括尿道移行細胞癌、尿道鱗狀細胞癌和尿道腺瘤)、陰道癌(比如陰道鱗狀細胞癌和陰道腺癌)和外陰癌。在方法的一些實施方式中，該方法是一線療法。在一些實施方式中，癌癥處于晚期(比如III期或IV期)。在一些實施方式中，癌癥是轉移癌。如使用聚合的-酶/抗體綴合物測定的目標分析物水平(即，高或低)的分類或等級可以相對于對照水平的統(tǒng)計學分布測定。在一些實施方式中，分類或等級相對于對照樣本比如正常組織。在一些實施方式中，目標分析物的水平相對于對照水平的統(tǒng)計學分布進行分類或分級。在一些實施方式中，目標分析物的水平相對于從個體獲得的對照樣本的水平進行分類或分級。對照樣本可以使用與非對照樣本相同的來源和方法獲得。在一些實施方式中，對照樣本從不同個體(例如，不患癌癥的個體，患有與癌癥對應的良性或較早期(lessadvanced)形式疾病的個體，和/或共享相似的種族、年齡和性別特性的個體)獲得。在一些實施方式中，當樣本是腫瘤組織樣本時，對照樣本可以是來自相同個體的非癌樣本。在一些實施方式中，多種對照樣本(例如來自不同個體的)被用于測定特定組織、器官或細胞群中目標分析物水平的范圍。在一些實施方式中，生物信息學方法被用于對目標分析物的水平進行測定和分類。在一些實施方式中，目標分析物水平使用聚合的-酶/抗體綴合物例如通過直接免疫組織化學進行測定。例如，低或高水平的標準可以基于陽性染色細胞的數(shù)目和/或染色的強度創(chuàng)建，例如通過使用特異性地識別目標分析物的抗體。在一些實施方式中，如果少于大約1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的細胞含有陽性染色，則水平是低的。在一些實施方式中，如果染色的強度比陽性對照染色小1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％，則水平是低的。在一些實施方式中，如果多于大約40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％的細胞具有陽性染色，則水平是高的。在一些實施方式中，如果聚合的-酶/抗體綴合物的染色與陽性對照染色的強度一樣，則水平是高的。在一些實施方式中，如果聚合的-酶/抗體綴合物的染色的強度是聚合的-酶/抗體綴合物的陽性對照染色的強度的80％、85％或90％，則水平是高的。在一些實施方式中，強染色、中等染色和弱染色是聚合的-酶/抗體綴合物的染色的校準水平，其中建立范圍并且染色的強度置于(bin)該范圍內。在一些實施方式中，強染色是高于強度范圍的75％的聚合的-酶/抗體綴合物的染色，中等染色是強度范圍的25％-75％的聚合的-酶/抗體綴合物的染色，并且弱染色是低于強度范圍的25％的聚合的-酶/抗體綴合物的染色。在一些方面，本領域技術人員和熟悉具體染色技術的人員調節(jié)面元大小(binsize)并限定染色類別。在一些實施方式中，如樣本、患者等中的目標分析物水平——如通過聚合的-酶/抗體綴合物測定的——的評估和評分由一個或多個有經驗的臨床醫(yī)生——即在使用聚合的-酶/抗體綴合物的目標分析物表達和目標分析物染色模式方面有經驗的那些——執(zhí)行。例如，在一些實施方式中，臨床醫(yī)生(一個或多個)對正在評估和評分的樣本、患者等的臨床特性和結果不知情。在一些實施方式中，本文描述的方法在診所中執(zhí)行。在一些實施方式中，本文描述的方法在診所外執(zhí)行。在一些實施方式中，本文描述的方法在診斷實驗室執(zhí)行。III.試劑盒在進一步方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的一種或多種組合物以及使用組合物和/或實行公開的方法的說明書的試劑盒。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了與上面描述的免疫檢測方法一起使用的免疫檢測試劑盒。因為抗體通常被用于檢測野生型和/或突變體蛋白質、多肽和/或肽，所以抗體將優(yōu)選地被包含在試劑盒中。免疫檢測試劑盒將因而包括——在適合的容器工具中——結合至野生型和/或突變體蛋白質、多肽和/或肽的一次抗體，和/或任選地免疫檢測試劑，和/或進一步任選地，野生型和/或突變體蛋白質、多肽和/或肽。試劑盒的免疫檢測試劑可以采取多種形式中的任一種，包括與給定一次抗體相關聯(lián)的和/或連接的那些可檢測的標簽——優(yōu)選地作為聚合的-酶/抗體綴合物。試劑盒可以進一步包括野生型和/或突變體蛋白質、多肽和/或肽的適合的等分組合物，無論是標記的和/或未標記的，其可被用于制備檢測測定的標準曲線。試劑盒可以包含抗體-標簽綴合物，其以完全綴合形式、中間體形式、和/或作為待被試劑盒的使用者綴合的單獨部分。試劑盒的成分可以以水性介質和/或以凍干形式包裝。試劑盒的容器工具將通常包括至少一個小瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器和/或其它容器工具，抗體可以放置在其中，和/或優(yōu)選地，在其中適當?shù)氐确?。本發(fā)明的試劑盒還將通常包括容納抗體、抗原的工具，和/或用于商業(yè)出售的封閉限制的任何其它試劑容器。這類容器可以包括注射和/或吹塑成型的塑料容器，期望的小瓶被保持在其內。本發(fā)明的試劑盒處于適合的包裝中。適合的包裝包括但不限于小瓶、瓶、罐、軟包裝(例如，聚酯薄膜或塑料袋)等。試劑盒可以任選地提供額外的組件，比如緩沖液和解釋信息。本發(fā)明因而還提供了制造品，其包括小瓶(比如密封的小瓶)、瓶、罐、軟包裝等。例如，在本發(fā)明的一個實施方式中，試劑盒將在寬的臨床和研究環(huán)境中評估全面范圍(panel)的分子(例如，癌癥的臨床相關預后和預測因子)。在一些實施方式中，試劑盒將進一步包括根據(jù)本文描述的任何方法的使用說明書。試劑盒可以包括對適合于治療的個體的選擇的說明。本發(fā)明的試劑盒中提供的說明書通常為標簽或包裝插頁(例如，試劑盒中包括的紙張)上的書面指示，但是機器可讀的指示(例如，磁性或光學存儲盤上攜帶的指示)也是可以接受的。例如，在一些實施方式中，試劑盒包括a)聚合的-酶/抗體綴合物。在一些實施方式中，試劑盒包括a)聚合的-酶/抗體綴合物，和b)使用說明書。在一些實施方式中，試劑盒包括a)聚合的-酶/抗體綴合物，和b)聚合的-酶的底物。在一些實施方式中，試劑盒包括a)聚合的-酶/抗體綴合物，b)聚合的-酶的底物，和c)使用說明書。在一些實施方式中，聚合的-酶是聚合的-HRP。在一些實施方式中，抗體是治療性抗體。雖然本文已經示出并描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是對于本領域技術人員顯而易見的是這些實施方式僅通過舉例的方式提供。本領域技術人員將在不背離本發(fā)明的情況下想到眾多變化、改變和替換。應當理解，本文描述的發(fā)明的實施方式的各種替代方案可以在實踐本發(fā)明中采用。目的是所附權利要求書限定本發(fā)明的范圍并且在這些權利要求范圍內的方法和結構以及其等價物由此被涵蓋。實施例闡明本發(fā)明的復合物的制備的如下實施例進一步示例本發(fā)明但不對其進行限制。實施例1.在冷凍組織載玻片上直接IHC的方案該實施例展示了用于對從冷凍組織樣本獲得的組織切片進行直接IHC的方案。組織切片如在下面的示例性方法中描述的進行制備。將新鮮地切開的組織塊(＜5mm厚)放置在預先標記的組織基底模具上。用冷包埋介質(例如，OCT)覆蓋整個組織塊。將包含組織塊的基底模具緩慢地置于液氮中，將整個組織塊浸沒在液氮中以確保組織塊被完全冷凍。將冷凍的組織塊轉移至低溫切片機(cryotome)恒冷箱(例如，-20℃)。使用低溫切片機將冷凍的組織塊切片成期望的厚度(通常地5-10μm)。將組織切片放置在適合于免疫組織化學的玻璃載玻片上(例如，Plus，VWR)。組織切片如在下面的示例性方法中描述的進行免疫染色。組織切片利用包含75％的甲醇、5％的冰醋酸和20％的37％甲醛的固定劑固定1至2分鐘。然后將具有組織切片的載玻片利用封閉緩沖液——例如，5％脫脂乳或2％BSA——封閉2分鐘。在封閉之后，載玻片在中性pH下的10mM磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中清洗10秒；載玻片被清洗3次。將用1％BSA稀釋的聚合的-HRP/抗體綴合物施加至載玻片以覆蓋組織切片的整個區(qū)域并且在室溫下孵育3至5分鐘。在孵育之后，載玻片用PBS緩沖液洗滌3次，每次10秒。將DAB溶液施加至載玻片以覆蓋組織切片的整個區(qū)域并且孵育1至3分鐘。通過利用自來水洗滌使反應停止。載玻片利用蘇木精復染10秒，然后用水洗滌。隨后，將載玻片短暫地浸入酸性乙醇(0.25％的酸性乙醇溶液，通過結合11mL濃鹽酸和4400mL的80％乙醇)；將載玻片浸入1至3次。然后，將載玻片短暫地浸入碳酸鋰(碳酸鋰溶液，通過結合2.3g碳酸鋰和200mL的80％乙醇)15秒，然后在自來水中清洗10秒。然后，將載玻片浸入100％乙醇三次，每次持續(xù)10秒，以使組織切片脫水。在脫水之后，通過浸入二甲苯三次每次10秒清潔載玻片。實施例2.組織載玻片的脫蠟和再水化該實施例展示了在組織切片的脫蠟、再水化和表位恢復之后對組織切片進行直接IHC的方案。將具有組織切片的載玻片浸入二甲苯5分鐘。二甲苯浸入利用清潔二甲苯再重復兩次，每次5分鐘。然后，將載玻片浸入以下系列的乙醇溶液：100％乙醇持續(xù)3分鐘；100％乙醇持續(xù)3分鐘；95％乙醇持續(xù)3分鐘；和75％乙醇持續(xù)3分鐘。隨后通過將載玻片浸入清潔自來水中持續(xù)3分鐘，在自來水中清洗載玻片；另外重復兩次。在組織切片的再水化之后，使用胰蛋白酶暴露蛋白質表位。首先，0.1％胰蛋白酶溶液在0.1％氯化鈣中使用蒸餾水制備。使用1M氫氧化鈉將胰蛋白酶溶液的pH調節(jié)至7.2。將加濕室、0.1％胰蛋白酶溶液和在蒸餾水中的具有組織切片的載玻片在37℃下預熱。隨后，將具有組織切片的載玻片在0.1％胰蛋白酶溶液中孵育20分鐘。然后，使載玻片在室溫下冷卻10分鐘。10分鐘后，通過將載玻片浸入清潔自來水中2分鐘，在自來水中清洗載玻片；另外重復一次。然后將載玻片在3％過氧化氫溶液中封閉2分鐘。然后通過浸入載玻片持續(xù)2分鐘，將載玻片在具有0.05％的吐溫20的PBS中清洗；另外重復一次。隨后，將載玻片在1％BSA中封閉30分鐘。在封閉之后，組織切片利用聚合的-HRP/抗體綴合物免疫染色。將包含聚合的-HRP/抗體綴合物的溶液施加至載玻片以覆蓋組織切片的整個區(qū)域并在室溫下孵育5至30分鐘。孵育之后，利用PBS吐溫20緩沖液洗滌載玻片3次，每次兩分鐘。將包含30μl色原/1mL稀釋劑的DAB溶液施加至載玻片以覆蓋組織切片的整個區(qū)域并在室溫下孵育5分鐘。通過利用自來水洗滌使反應停止。利用蘇木精對載玻片復染10秒，然后利用水洗滌。然后將載玻片浸入pH8的0.1％碳酸鈉(發(fā)藍溶液(bluingsolution))中持續(xù)15秒。隨后，通過將載玻片浸入如下溶液將載玻片上的組織切片脫水：95％乙醇持續(xù)3分鐘；100％乙醇持續(xù)3分鐘；和100％乙醇持續(xù)3分鐘。然后在二甲苯中洗滌2.5分鐘。隨后，通過將載玻片浸入二甲苯中兩次清潔載玻片，每次10秒。實施例3.使用聚合的-HRP抗Ck8/18抗體綴合物的直接IHC該實施例展示了使用利用聚合的-HRP抗Ck8/18抗體綴合物的直接IHC染色檢測組織樣本中的Ck8/18。使用實施例1和2中描述的技術制備FFPE前列腺組織切片和冷凍的人淋巴結組織切片并免疫染色。使用胰蛋白酶處理FFPE前列腺組織切片以恢復蛋白質表位，并且將聚合的-HRP綴合的抗Ck8/18小鼠單克隆抗體與組織樣本在37℃下孵育5分鐘。將冷凍的人淋巴結組織切片與聚合的-HRP綴合的抗Ck8/18小鼠單克隆抗體在室溫下一起孵育3分鐘。對于FFPE前列腺組織切片(圖9A)和冷凍的人淋巴結組織切片(圖9B)提供了染色癌組織的代表性圖像。實施例4.使用聚合的-HRP抗Ki-67抗體綴合物的直接IHC該實施例展示了使用利用聚合的-HRP抗Ki-67抗體綴合物的直接IHC染色檢測組織樣本中的Ki-67。使用實施例1和2中描述的技術制備人扁桃體組織切片并免疫染色。另外，組織切片利用Q-染色劑染色。對于人扁桃體組織切片，提供了抗Ki-67染色組織的代表性圖像(圖10)。實施例5.使用聚合的-HRP抗Ck5抗體綴合物的直接IHC該實施例展示了使用利用聚合的-HRP抗Ck5抗體綴合物的直接IHC染色檢測人扁桃體組織樣本中的Ck5。使用實施例1和2中描述的技術制備冷凍的人扁桃體組織切片并免疫染色。將冷凍的人扁桃體組織切片與聚合的-HRP抗Ck5抗體綴合物在室溫下一起孵育10分鐘。對于人扁桃體組織切片提供了抗Ck5染色組織的代表性圖像(圖11)。實施例6.使用聚合的-HRP抗Mart-1抗體綴合物的直接IHC該實施例展示了使用利用聚合的-HRP抗Mart-1抗體克隆A103綴合物的直接IHC染色檢測黑素瘤組織樣本中的Mart-1。使用實施例1和2中描述的技術制備黑素瘤組織切片并免疫染色。對于黑素瘤組織切片，提供了抗Mart-1染色組織的代表性圖像(圖12)。實施例7.使用聚合的-HRP抗CD45抗體綴合物的直接IHC該實施例展示了使用利用聚合的-HRP抗CD45抗體克隆3A4綴合物的直接IHC染色檢測扁桃體組織樣本中的CD45。使用實施例1和2中描述的技術制備扁桃體組織切片并免疫染色。對于扁桃體組織切片，提供了抗CD45染色組織的代表性圖像(圖13)。實施例8.使用治療性抗體的直接IHC的方法和結果該實施例展示了使用綴合有聚合的-HRP的治療性抗體對多種組織樣本直接IHC染色的方法。獲得特異性地結合ROR2的人治療性抗體。用聚合的-HRP標記治療性抗體以產生治療性抗體的聚合的-HRP綴合物。使用本文描述的技術，比如實施例1和2中描述的那些技術，制備組織切片并免疫染色。免疫染色的圖像被評分為“0-4”，其中4為最強，“3-4”為陽性，“1-2”為弱陽性以及0為陰性。聚合的-HRP抗ROR2抗體綴合物的工作條件基于已知表達或不表達ROR2的組織切片優(yōu)化。已知的陽性和陰性組織切片的染色分類結果在表1中報告。利用與組織樣本中ROR2的已知表達相關的本方法識別表達ROR2的組織。表1.組織樣本的染色分類組織樣本染色分類胃陽性腎臟陽性扁桃體陰性皮膚陰性乳房陰性肌肉陰性粘膜陰性結腸陰性闌尾陰性肺陰性肝臟陰性腎上腺陰性甲狀腺陰性胰腺陰性胎盤陰性前列腺陰性對于下列，提供了染色組織的代表性圖像：扁桃體(圖14A)、前列腺(圖14B)、胃(圖14C)和腎臟(圖14D)。隨后，使用聚合的-HRP抗ROR2抗體綴合物的優(yōu)化的直接IHC方法被用于對一系列癌組織樣本進行分類。染色分類結果在表2中報告。表2.癌組織樣本的ROR2染色分類對于下列，提供了直接IHC染色組織的代表性圖像：黑素瘤(圖15A和15B)、肝細胞癌(圖15C和15D)、神經內分泌腫瘤(圖15E和15F)、肺癌(圖15G)和腎透明細胞癌(圖15H)。當前第1頁1 2 3