本發(fā)明涉及一種雙通道熒光成像檢測(cè)活細(xì)胞中微量離子的方法，特別是一種雙通道熒光成像檢測(cè)活細(xì)胞中微量al³⁺的方法。

背景技術(shù)：

鋁是地殼中含量最豐富的第三種元素，日常生活中作為包裝材料的鋁箔、容器材料、藥物制劑、漂白劑、造紙工業(yè)、食品添加劑、藥物包裝等被廣泛使用。眾所周知，對(duì)生命體而言，鋁不是一種必須元素，它對(duì)人類(lèi)健康會(huì)產(chǎn)生明顯不利的影響。在各種生物和環(huán)境相關(guān)的重要金屬離子中，由于鋁對(duì)環(huán)境和人類(lèi)健康的毒性作用，鋁的檢測(cè)尤為重要。而且，以鋁為基礎(chǔ)的藥物如止汗藥、抗?jié)兯?、抗酸劑等?duì)人體健康的危害更甚于食物中鋁離子的污染。過(guò)量鋁的攝入與骨質(zhì)疏松癥和貧血癥有關(guān)，因其影響腸胃中鈣和血液中鐵的吸收。在活細(xì)胞和組織中能夠發(fā)現(xiàn)離子形態(tài)的鋁，在被排泄出體內(nèi)之前，鋁離子能滯留在細(xì)胞和組織中更長(zhǎng)的時(shí)間。在以毒性金屬離子研究為中心的生物化學(xué)研究中，al³⁺已經(jīng)凸顯其重要性，被建議為一種有助于病原學(xué)研究人類(lèi)多種神經(jīng)障礙癥的影響因子。人類(lèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損是導(dǎo)致阿爾茨海默癥、帕金森氏綜合癥和肌萎縮性骨髓側(cè)索硬化癥等的主要因素。已被證實(shí)，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)換及在細(xì)胞生命周期中光解和蛋白質(zhì)抗水解系統(tǒng)的不平衡過(guò)程中，鋁都發(fā)揮了重要的作用。上述不利于人類(lèi)健康的效應(yīng)使al³⁺在金屬離子識(shí)別中成為一個(gè)重要的目標(biāo)，迫切需要方便、靈敏、選擇性的檢測(cè)生物體系中al³⁺的方法。

傳統(tǒng)的al³⁺分析技術(shù)存在諸如破壞樣品、耗時(shí)、樣品前處理繁瑣、設(shè)備復(fù)雜等問(wèn)題，限制了不能快速、在線地檢測(cè)，特別不適用于特殊的生物樣品檢測(cè)。熒光探針能實(shí)時(shí)傳感生物學(xué)相關(guān)的重要離子并能實(shí)現(xiàn)體內(nèi)外熒光成像，在生物成像、臨床診斷、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和生物科學(xué)中已經(jīng)成為不可或缺的重要工具。靈敏的細(xì)胞內(nèi)al³⁺的生物成像是理解al³⁺如何誘導(dǎo)人類(lèi)疾病潛在機(jī)制的先決條件。然而，相對(duì)于其他金屬離子，al³⁺的檢測(cè)由于缺乏光譜特征和較弱的配合能力一直存在困難。

因此，現(xiàn)有方法檢測(cè)活細(xì)胞中微量al³⁺時(shí)，存在試劑與al³⁺的配合能力困難，檢測(cè)不方便，可視性差，靈敏度低，選擇性差，易受其他離子的干擾，且不能實(shí)時(shí)在線檢測(cè)的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，提供一種雙通道熒光成像檢測(cè)活細(xì)胞中微量al³⁺的方法，本發(fā)明方法中探針與al³⁺的配合能力好，檢測(cè)方便，可視性好，靈敏度高、選擇性好，受其他離子的干擾小，且能實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)在線檢測(cè)。

本發(fā)明的技術(shù)方案：一種雙通道熒光成像檢測(cè)活細(xì)胞中微量al³⁺的方法，是以三[二(萘基硫脲基)-羅丹明甲酰氨基]乙基胺，作為雙通道熒光成像檢測(cè)活性細(xì)胞中微量al³⁺的熒光成像探針，通過(guò)雙通道熒光成像檢測(cè)活性細(xì)胞中微量al³⁺；所述探針化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：

前述的雙通道熒光成像檢測(cè)活細(xì)胞中微量al³⁺的方法中，所述的通過(guò)雙通道熒光成像檢測(cè)活性細(xì)胞中微量al³⁺；是先用探針與細(xì)胞孵化使探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，再將孵化有探針的細(xì)胞與al³⁺孵化，使探針與al³⁺在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合生成能發(fā)射特征波長(zhǎng)熒光的探針-al³⁺配合物，實(shí)現(xiàn)探針對(duì)細(xì)胞內(nèi)離子染色成像，用熒光倒置顯微鏡觀測(cè)孵化后的活性細(xì)胞熒光像；具體包括以下步驟：

(1)細(xì)胞培養(yǎng)：活性細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇接種于含10％胎牛血清以及含1％雙抗的改良型rpmi1640的培養(yǎng)基中，在溫度為37℃，5％co2及飽和濕度為100％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2-3天傳代1次，選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于12孔板中培養(yǎng)，密度為2×10⁴個(gè)/ml，次日用新鮮培養(yǎng)基清洗細(xì)胞；

(2)探針對(duì)細(xì)胞孵育：將步驟(1)的細(xì)胞中加入含10～40μm探針的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液的組成為90％培養(yǎng)基，8％h2o，2％乙腈，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20～60min，吸出含探針的培養(yǎng)液，用新鮮的培養(yǎng)基清洗細(xì)胞，置于熒光倒置顯微鏡下分別進(jìn)行場(chǎng)亮場(chǎng)和暗場(chǎng)拍照，明場(chǎng)下觀察到細(xì)胞清晰的圖像，暗場(chǎng)下沒(méi)有觀察到細(xì)胞圖像；

(3)al³⁺對(duì)細(xì)胞染色：在步驟(2)的細(xì)胞中加入含50～120μmal³⁺的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液的組成為90％培養(yǎng)基和10％h2o，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20～60min，吸出含al³⁺的培養(yǎng)液，用新鮮的培養(yǎng)基清洗細(xì)胞，置于熒光倒置顯微鏡的綠色通道下觀察探針對(duì)細(xì)胞內(nèi)al³⁺染色后的熒光像，細(xì)胞呈現(xiàn)明亮的綠色熒光，拍攝得到清晰的綠色熒光細(xì)胞輪廓影像，探針在活性細(xì)胞中檢測(cè)到微量al³⁺離子；

(4)再將步驟(3)經(jīng)探針和al³⁺分別染色后的細(xì)胞置于倒置熒光顯微鏡紅色通道下觀察探針對(duì)細(xì)胞內(nèi)al³⁺染色后的熒光像，細(xì)胞呈現(xiàn)明亮的紅色熒光，拍攝得到清晰的紅色熒光細(xì)胞輪廓影像，探針在活性細(xì)胞中檢測(cè)到微量al³⁺離子。

前述的雙通道熒光成像檢測(cè)活細(xì)胞中微量al³⁺的方法中，所述的熒光倒置顯微鏡；是綠色通道的激發(fā)波長(zhǎng)為450nm～490nm，紅色通道的激發(fā)波長(zhǎng)為510nm～550nm的熒光倒置顯微鏡。

前述的雙通道熒光成像檢測(cè)活細(xì)胞中微量al³⁺的方法中，所述的1640培養(yǎng)基；是rpmi1640培養(yǎng)基；rpmi為英文roswellparkmemorialinstitute的縮寫(xiě)，代指洛斯維·帕克紀(jì)念研究所，rpmi是該研究所研發(fā)的一類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)基，1640是培養(yǎng)基代號(hào)。

前述的雙通道熒光成像檢測(cè)活細(xì)胞中微量al³⁺的方法中，所述的活性細(xì)胞是；人體前列腺癌細(xì)胞，簡(jiǎn)稱(chēng)pc3細(xì)胞。

前述的雙通道熒光成像檢測(cè)活細(xì)胞中微量al³⁺的方法中，所述的探針；是按下述合成路線合成的：

前述的雙通道熒光成像檢測(cè)活細(xì)胞中微量al³⁺的方法中，所述的探針；是這樣制備的：在100ml的三口燒瓶中，加入三(2-氨乙基)胺27.36mmol、羅丹明b3.42mmol和60ml的無(wú)水乙醇，氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流36h，減壓蒸去乙醇，用100ml二氯甲烷萃取3次，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鎂干燥過(guò)夜，蒸去溶劑，得紅色粘稠狀物，硅膠柱層析分離，洗脫液為體積比為9/1/1的甲醇/三氯甲烷/三乙胺，得1.71g無(wú)色粘稠狀中間體；在250ml的三口瓶中，加入中間體2.03mmol、120ml三氯甲烷和1-萘異硫氰酸酯4.00mmol，氮?dú)獗Ｗo(hù)下58-62℃反應(yīng)過(guò)夜，蒸去溶劑，硅膠柱層析分離，洗脫液為體積比為7/3的乙酸乙酯/正己烷，得白色固體。

發(fā)明人對(duì)本發(fā)明方法進(jìn)行了長(zhǎng)期的大量的試驗(yàn)研究，以下是部分試驗(yàn)：

1、按實(shí)施例1進(jìn)行制備的探針，溶于體積比為49/1的乙腈/水溶液中，配制成探針濃度為10μm的溶液，分別不加金屬離子或加入200μm金屬離子al³⁺，li⁺，na⁺，k⁺，mg²⁺，ca²⁺，ba²⁺，sr²⁺，hg²⁺，pb²⁺，cd²⁺，zn²⁺，co²⁺，ni²⁺，cu²⁺，ag⁺，fe³⁺后的熒光光譜。見(jiàn)圖1，al³⁺的加入使探針在590nm處的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，而其他上述實(shí)驗(yàn)金屬離子的加入均不改變探針的熒光光譜和強(qiáng)度，表明在此條件下，探針能選擇性檢測(cè)al³⁺。測(cè)試的激發(fā)波長(zhǎng)為240nm，發(fā)射波長(zhǎng)為590nm。

2、按實(shí)施例1進(jìn)行制備的探針，溶于體積比為49/1的乙腈/水溶液中，配制成探針濃度為10μm的溶液，分別加入200μm的金屬離子al³⁺，li⁺，na⁺，k⁺，mg²⁺，ca²⁺，ba²⁺，sr²⁺，hg²⁺，pb²⁺，cd²⁺，zn²⁺，co²⁺，ni²⁺，cu²⁺，ag⁺，fe³⁺后，測(cè)定590nm處的熒光強(qiáng)度值，僅有al³⁺的加入能使探針產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光。再分別向探針1-al³⁺混合溶液中加入200μm上述其他金屬離子后，測(cè)定590mn處的熒光強(qiáng)度值的變化。見(jiàn)圖2，黑色條表示在探針溶液中分別加入金屬離子后在590mn處的熒光強(qiáng)度值；白色條表示在探針-al³⁺混合溶液再分別加入上述其他共存金屬離子后在590nm處的熒光強(qiáng)度值的變化。表明探針檢測(cè)al³⁺的熒光強(qiáng)度不受上述離子共存的影響。測(cè)試的激發(fā)波長(zhǎng)為240nm。

3、按實(shí)施例1進(jìn)行制備的探針，溶于體積比為49/1的乙腈/水溶液中，配制成探針濃度為50μm的溶液，分別加入不同濃度al³⁺測(cè)得的熒光光譜。隨al³⁺濃度增大，在590nm處的熒光強(qiáng)度線性增強(qiáng)。測(cè)試的激發(fā)波長(zhǎng)為240nm。見(jiàn)圖3。

4、按實(shí)施例1進(jìn)行制備的探針，溶于體積比為49/1的乙腈/水溶液中，配制成探針濃度為50μm的溶液，分別加入不同濃度al³⁺，測(cè)定590nm處熒光強(qiáng)度。縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度值，橫坐標(biāo)為al³⁺的濃度。激發(fā)波長(zhǎng)為240nm。見(jiàn)圖4。

5、探針對(duì)活性pc3細(xì)胞中al³⁺的熒光成像檢測(cè)照片，見(jiàn)圖5；5-a是經(jīng)濃度為20μm的探針?lè)跤?0min后的pc3細(xì)胞的熒光倒置顯微鏡的明場(chǎng)照片，細(xì)胞貼壁正常，呈飽滿狀態(tài)，證明探針在該測(cè)試條件下對(duì)pc3細(xì)胞沒(méi)有毒性；5-b為上述經(jīng)探針?lè)跤^(guò)的pc3細(xì)胞的暗場(chǎng)熒光顯微照片，顯示無(wú)細(xì)胞熒光成像；5-c為上述經(jīng)先20μm的探針?lè)跤?0min的pc3細(xì)胞，再用100μm的al³⁺孵育40min后，在熒光倒置顯微鏡紅色通道下拍攝的細(xì)胞圖片，觀測(cè)到清晰的紅色熒光細(xì)胞分布，證明探針與al³⁺離子在細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)了染色，呈現(xiàn)細(xì)胞染色熒光成像，紅色通道激發(fā)波長(zhǎng)為510nm～550nm。5-d為上述先經(jīng)先20μm的探針?lè)跤?0min的pc3細(xì)胞，再用100μm的al³⁺孵育40min后，在熒光倒置顯微鏡綠色通道下拍攝的細(xì)胞圖片，觀測(cè)到清晰的綠色熒光細(xì)胞分布，證明探針與al³⁺離子在細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)了染色，呈現(xiàn)細(xì)胞染色熒光成像，綠色通道的激發(fā)波長(zhǎng)為450nm～490nm。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)選擇在乙腈/水混合介質(zhì)中，以240nm為激發(fā)波長(zhǎng)，探針選擇性識(shí)別al³⁺，探針-al³⁺發(fā)射590nm橙色熒光，據(jù)此利用探針實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)al³⁺熒光成像；

(2)激發(fā)波長(zhǎng)為420nm而發(fā)射波長(zhǎng)為590nm，不僅消除了激發(fā)波長(zhǎng)對(duì)發(fā)射波長(zhǎng)的影響，同時(shí)使成像細(xì)胞的熒光波長(zhǎng)接近近紅外波段；

(3)作為一種細(xì)胞內(nèi)微量al³⁺的熒光成像方法，能同時(shí)在熒光激發(fā)波長(zhǎng)為510nm～550nm的紅色通道和熒光激發(fā)波長(zhǎng)為450nm～490nm的綠色通道下實(shí)現(xiàn)熒光成像。作為一種活細(xì)胞內(nèi)微量al³⁺的成像試劑，具有檢測(cè)方便、可視性強(qiáng)、靈敏度高、選擇性好受其他離子的干擾小，可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)在線檢測(cè)。

(4)通過(guò)發(fā)明人合成的一種對(duì)al³⁺高靈敏、高選擇性檢測(cè)的熒光探針，探針先與細(xì)胞孵育，使探針滲透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，再用孵育有探針的細(xì)胞對(duì)al³⁺進(jìn)行孵育，使探針與al³⁺在細(xì)胞內(nèi)形成配合物，在熒光倒置顯微鏡下進(jìn)行熒光成像檢測(cè)，分別在兩個(gè)激發(fā)通道下都能實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞中微量金屬離子al³⁺的不同顏色的熒光染色和成像檢測(cè)。

因此，本發(fā)明方法中探針與al³⁺的配合能力好，檢測(cè)方便，可視性好，靈敏度高、選擇性好，受其他離子的干擾小，且能實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)在線檢測(cè)。

附圖說(shuō)明：

圖1是探針檢測(cè)al³⁺的熒光光譜圖；

圖2是共存金屬離子對(duì)探針檢測(cè)al³⁺的熒光強(qiáng)度影響圖；

圖3是不同濃度的al³⁺對(duì)探針的熒光滴定光譜圖；

圖4是探針檢測(cè)al³⁺的熒光光譜法校正曲線；

圖5是探針對(duì)活性pc3細(xì)胞中al³⁺的熒光成像檢測(cè)照片；5-a是經(jīng)濃度為20μm的探針?lè)跤?0min后的pc3細(xì)胞的熒光倒置顯微鏡的明場(chǎng)照片；5-b為經(jīng)探針?lè)跤^(guò)的pc3細(xì)胞的暗場(chǎng)熒光顯微照片；5-c為經(jīng)先20μm的探針?lè)跤?0min的pc3細(xì)胞，再用100μm的al³⁺孵育40min后，在熒光倒置顯微鏡紅色通道下拍攝的細(xì)胞圖片；5-d為先經(jīng)先20μm的探針?lè)跤?0min的pc3細(xì)胞，再用100μm的al³⁺孵育40min后，在熒光倒置顯微鏡綠色通道下拍攝的細(xì)胞圖片。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

1、探針的合成路線：

探針的具體配制方法：在100ml的三口燒瓶中，加入三(2-氨乙基)胺(4.0g，27.36mmol)，羅丹明b(1.638g，3.42mmol)，60ml的無(wú)水乙醇，氮?dú)獗Ｗo(hù)下回流36h，減壓蒸去乙醇，用二氯甲烷(3×100ml)萃取，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鎂干燥過(guò)夜，蒸去溶劑，得紅色粘稠狀物，硅膠板層析分離，洗脫液為體積比為9/1/1的甲醇/三氯甲烷/三乙胺，得1.71g無(wú)色粘稠狀中間體，產(chǎn)率87.3％。結(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù)如下：¹hnmr(500mhz,cdcl3)δppm7.89(d,j＝5.0hz,1h,arh),7.44-7.46(br,2h,arh),7.10(bs,1h,arh),6.40～6.42(m,4h,arh),6.27(d,j＝5.0hz,2h,arh),3.34(q,j＝10.0hz,8h,nch2ch3),3.15(m,2h,nch2ch2n),2.55-2.57(m,4h,nch2ch2n),2.36(t,j＝5.0hz,4h,nch2ch2n),2.24(t,j＝5.0hz,4h,nch2ch2n),1.17(t,j＝10.0hz,12h,nch2ch3)；¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ12.16,37.51,38.54,43.96,51.29,54.79,56.91,97.23,104.97,107.71,122.25,123.43,127.79,128.47,131.08,132.03,148.41,152.55,153.11,167.41ppm.

在250ml的三口瓶中，加入中間體(1.16g，2.03mmol)，120ml三氯甲烷(干)，1-萘異硫氰酸酯(740mg，4.00mmol)，氮?dú)獗Ｗo(hù)下60℃反應(yīng)過(guò)夜，蒸去溶劑，硅膠柱層析分離，洗脫液為體積比為7/3的乙酸乙酯/正己烷，得白色固體1.45g，即探針，產(chǎn)率76.3％。結(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù)如下：m.p.125～127℃；ir(kbr,νcm^-1):3333(n-h),1603(c＝c),1518(c-n-h),1103(c-o),772(ar-h),625(ar-h).¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ:8.10(d,j＝10.0hz,2h,arh),8.01(d,j＝10.0hz,2h,arh),7.91(s,2h,csnh),7.76(d,j＝5.0hz,2h,arh),7.63(d,j＝5.0hz,1h,arh),7.47～7.51(m,3h,arh),7.33～7.38(m,4h,arh),7.26-7.29(m,1h,arh),7.19(d,j＝5.0hz,1h,arh),7.07-7.10(m,2h,arh),6.93(s,2h,csnh),6.40-6.45(m,4h,arh),6.28-6.31(m,2h,arh),3.33～3.37(m,8h,nch2ch3),3.25～3.28(m,6h,nch2ch2n),2.45(br,4h,nch2ch2n),2.14(br,2h,nch2ch2n),1.17-1.20(m,12h,nch2ch3)；¹³cnmr(500mhz,cdcl3)δ12.56,37.72,40.24,44.41,53.55,54.33,66.81,97.67,104.66,108.48,118.01,121.10,122.68,123.18,124.08,125.49,125.58,126.07,126.63,128.38,128.44,128.70,131.02,133.00,134.09,134.52,149.03,152.86,153.62,156.62,169.55ppm；ms(maldi-tof)計(jì)算值[c56h60n8o2s2]:m/z941.435,實(shí)測(cè)值:m/z941.514[m+h]⁺.

2、試劑的配制：

(1)探針溶液的配制：稱(chēng)取按上述方法制備的探針9.4mg，用乙腈溶解，配制成探針濃度為1mm的溶液10ml。

(2)al³⁺離子儲(chǔ)備液配制：稱(chēng)量九水合高氯酸鋁343.3mg，用超純水溶解，配制成濃度為20mm的溶液50ml。

(3)75％的乙醇溶液：無(wú)水乙醇75ml加超純水至100ml，混勻，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

(4)磷酸鹽緩沖溶液(d-hanks平衡鹽溶液)：0.4gkcl、0.06gkh2po4、8.0gnacl、1.0g葡萄糖、0.35gnahco3、0.152gna2hpo4·12h2o、10萬(wàn)iu雙抗，調(diào)整ph為7.2～7.4，去超純水定容至1000ml，針式濾器(0.22um進(jìn)口微孔濾膜)過(guò)濾除菌，分裝備用。

(5)1萬(wàn)單位(iu)/ml雙抗溶液：將80萬(wàn)單位青霉素鈉溶于40mld-hanks溶液中，配成終濃度2萬(wàn)單位/ml；將160萬(wàn)單位硫酸鏈霉素溶于80mld-hanks溶液中，配成終濃度2萬(wàn)單位/ml。分別取等體積的青霉素鈉溶液和硫酸鏈霉素溶液混合，得到青霉素鈉和硫酸鏈霉素的終濃度均為1萬(wàn)單位/ml的溶液；針式濾器(0.22um進(jìn)口微孔濾膜)過(guò)濾除菌，分裝1ml/支，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(6)0.25％胰蛋白酶：稱(chēng)取0.25g胰蛋白酶，溶解于100ml的d-hanks液中，針式濾器(0.22um進(jìn)口微孔濾膜)過(guò)濾除菌，分裝1ml/支，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(7)0.02％乙二胺四乙酸(edta)：將0.02gedta，溶解于100ml的d-hanks液中，針式濾器(0.22μm進(jìn)口微孔濾膜)過(guò)濾除菌，分裝1ml/支，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(8)培養(yǎng)液：用無(wú)菌移液管量取10ml已滅活的胎牛血清、90ml改良型rpmi-1640培養(yǎng)基，以及1ml雙抗液混合于100ml的無(wú)菌培養(yǎng)瓶中，2～8℃保存?zhèn)溆谩?/p>

本發(fā)明所用熒光分光光度計(jì)型號(hào)為caryeclipse熒光分光光度計(jì)，美國(guó)varian公司生產(chǎn)；thermofisher8000儲(chǔ)水型co2細(xì)胞培養(yǎng)箱；ix-71型熒光倒置相差顯微鏡，日本olympus公司；ar1530/c電子天平；25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶，美國(guó)corning公司立式壓力蒸汽滅菌器(ls-b75)；dhg-9230a電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

3、熒光光譜法檢測(cè)al³⁺

在10ml容量瓶中加入探針溶液(1mm，100μl)，用乙腈/水稀釋?zhuān)固结樔芤旱慕M成為乙腈/水的體積比是49/1，搖勻。在1cm的比色皿中加入3ml稀釋后的溶液，以240nm為熒光激發(fā)波長(zhǎng)，進(jìn)行熒光光譜測(cè)定。

在體積比為49/1的乙腈/水溶液中，濃度為10μm的探針溶液在590nm波長(zhǎng)處有熒光發(fā)射。分別加入200μm的金屬離子li⁺，na⁺，k⁺，mg²⁺，ca²⁺，ba²⁺，hg²⁺，sr²⁺，zn²⁺，cd²⁺，ni²⁺，co²⁺，pb²⁺，fe³⁺，cr³⁺，ag²⁺，cu²⁺時(shí)，沒(méi)有觀察到熒光光譜明顯的變化，只有加入20μm的al³⁺使探針在590nm處的熒光峰顯著增強(qiáng)(見(jiàn)圖1)。

在體積比為49/1的乙腈/水溶液中，對(duì)濃度為50μm探針溶液分別用不同濃度的al³⁺離子，進(jìn)行熒光光譜滴定(見(jiàn)圖2)。測(cè)定al³⁺濃度變化時(shí)探針在590nm處的熒光強(qiáng)度，獲得熒光校正曲線(見(jiàn)圖3)。由校正曲線的斜率和測(cè)定11次空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，測(cè)定并計(jì)算得到探針熒光法檢測(cè)al³⁺的濃度線性范圍和檢出限列于表1。

探針檢測(cè)al³⁺在590nm處的熒光強(qiáng)度在上述其他金屬離子分別作為共存離子存在于探針-al³⁺混合溶液中，當(dāng)濃度與al³⁺相同時(shí)，共存金屬離子對(duì)探針檢測(cè)al³⁺的熒光強(qiáng)度的不干擾(見(jiàn)圖4)。

表1探針熒光法檢測(cè)al³⁺的分析參數(shù)

4、活性pc3細(xì)胞的熒光成像

(1)復(fù)蘇細(xì)胞

從-80℃冰箱內(nèi)取出pc3細(xì)胞，置于37℃的水中快速晃動(dòng)細(xì)胞凍存管，于1-2分鐘內(nèi)完全解凍，在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，將其吸入離心管內(nèi)，加約11ml含10％胎牛血清，1％雙抗液的培養(yǎng)液，混均，并將此細(xì)胞懸液于1000r/min離心機(jī)上離心5min，去除上層清液，將底部沉淀的細(xì)胞加培養(yǎng)液輕吹、打散、混均、轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，使培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液體積在5～7ml內(nèi)，并置入37℃，含5％co2，飽和濕度為100％的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

(2)觀察→傳代→接板

每日更換一次培養(yǎng)液，并在顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，直至pc3細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿于整個(gè)培養(yǎng)瓶壁上，即可傳代，在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)倒掉舊培養(yǎng)液，加入1ml的edta液侵入細(xì)胞30s后倒掉，再加入1ml的胰蛋白酶液進(jìn)行消化，在顯微鏡下觀察直至細(xì)胞縮小變圓后，拍打培養(yǎng)瓶使細(xì)胞脫落并立即加入適量培養(yǎng)液阻止消化，將它一分為二培養(yǎng)于2個(gè)培養(yǎng)瓶中，待傳代后的細(xì)胞貼壁鋪滿于整個(gè)培養(yǎng)瓶壁上時(shí)，與傳代操作相同，加入edta和胰蛋白酶后使細(xì)胞消化脫落并立即加入3ml的培養(yǎng)液阻止消化，準(zhǔn)備接種于12孔板內(nèi)。在每個(gè)孔板內(nèi)加入200μl的已阻止消化的細(xì)胞液，再加適量新培養(yǎng)液混均后將孔板置入培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

(3)細(xì)胞染色

次日觀察孔板內(nèi)的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，待細(xì)胞貼壁生成，棄去舊培養(yǎng)液，用新培養(yǎng)液洗滌2次，備用。

將上述pc3細(xì)胞孔板內(nèi)加入含20μm探針的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液由90％培養(yǎng)基，8％h2o，2％乙腈組成，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育40min后，用新鮮的rpmimediummodified培養(yǎng)基清洗孔板內(nèi)的細(xì)胞三次后，分別置于熒光倒置顯微鏡的明場(chǎng)成像拍照(見(jiàn)圖5-a)和激發(fā)波長(zhǎng)為450nm～490nm的綠色通道暗場(chǎng)拍照(見(jiàn)圖5-b)，細(xì)胞無(wú)熒光。

往上述孔板內(nèi)再加入0.5ml含100μm的al³⁺的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液的組成為90％培養(yǎng)基和10％h2o，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育40min后用新鮮的rpmimediummodified培養(yǎng)基洗三次，置于熒光倒置顯微鏡的激發(fā)波長(zhǎng)為510nm～550nm的紅色通道下觀察，細(xì)胞呈現(xiàn)明亮的紅色熒光影像(見(jiàn)圖5-c)；置于熒光倒置顯微鏡的激發(fā)波長(zhǎng)為450nm～490nm的綠色通道下觀察拍照，細(xì)胞呈明亮的綠色熒光影像(見(jiàn)圖5-d)。