本發(fā)明涉及血液中未知毒物的氣相色譜-質(zhì)譜篩查方法，屬于化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

常見毒物篩查在法庭科學(xué)理化檢驗(yàn)中占據(jù)了相當(dāng)大的比重。申請(qǐng)人通過調(diào)研山東省近10年來的涉毒案件，發(fā)現(xiàn)此類案件物證檢驗(yàn)中存在以下問題：

(一)涉案毒物種類明顯增多，在偵辦某些是否中毒不明確的案件中，需要篩查的毒物不僅僅局限于某幾種或某一類，即目標(biāo)性不強(qiáng)。此種情況下，如果仍沿用老方法僅就幾種最常見的毒物進(jìn)行篩查，極有可能造成漏檢。

(二)目前，氣質(zhì)聯(lián)用法是全省各地市普遍掌握和采用的儀器分析方法，此方法相應(yīng)的的樣品前處理方法不規(guī)范，也未經(jīng)過優(yōu)化考查。

(三)利用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)涉案毒物的檢出限進(jìn)行系統(tǒng)性考查仍屬空白，陰性結(jié)果評(píng)價(jià)缺乏科學(xué)的數(shù)據(jù)支撐。

鑒于以上情況，為滿足新形勢(shì)下公安工作的需求，有必要提供一種具有通用性的、操作簡(jiǎn)便的篩查方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一種血液中未知毒物的氣相色譜-質(zhì)譜篩查方法。本申請(qǐng)系統(tǒng)開展了毒物(主要包括有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類、有機(jī)氯類、除草劑、鼠藥等)、藥物(主要包括苯并雜氮卓類、巴比妥類、吩噻嗪類、其他安眠鎮(zhèn)靜類藥物等)的檢驗(yàn)方法學(xué)研究，在最優(yōu)條件下得到它們的檢出限，為陰性結(jié)果評(píng)價(jià)提供數(shù)據(jù)支撐，繼而為相關(guān)的臨床診斷、搶救及刑事偵查、訴訟提供有力的科學(xué)依據(jù)。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種血液中未知毒物的氣相色譜-質(zhì)譜篩查方法：取待檢測(cè)血液，進(jìn)行前處理，然后進(jìn)行g(shù)c-ms分析，根據(jù)分析結(jié)果判斷待檢測(cè)血液樣品中是否含有毒物成分；所述前處理的方法為液液萃取方法或固相萃取方法。

所述液液萃取方法具體為：(1)當(dāng)目標(biāo)檢測(cè)物為毒物時(shí)：取待檢測(cè)血液2ml，置于15ml尖底離心試管中，加100μg/ml環(huán)氧七氯工作液10μl，振蕩混勻，經(jīng)乙酸乙酯：苯(體積比1:1)6ml×2提取，振蕩10min，離心10min，分離有機(jī)相，合并于試管中，濃縮至近干，加甲醇定容至100μl，供gc-ms分析；(2)當(dāng)目標(biāo)檢測(cè)物為藥物時(shí)：取待檢測(cè)血液2ml，置于15ml尖底離心試管中，加200μg/mlskf525a、烯丙異丙巴比妥內(nèi)標(biāo)工作液各2μl，用8％氫氧化鈉溶液調(diào)ph至11～12，經(jīng)乙酸乙酯：苯(體積比1:1)6ml×2提取，振蕩10min，離心10min，分離有機(jī)相，合并于試管中，剩余液體用10％鹽酸調(diào)ph至2～3，經(jīng)乙酸乙酯：苯(體積比1:1)6ml×2提取，振蕩10min，離心10min，分離有機(jī)相，合并于試管中；將以上兩步所得提取液合并，濃縮至近干，加甲醇定容至100μl，供gc-ms分析。

所述固相萃取方法具體為：(1)取待檢測(cè)血液2ml，置于15ml尖底塑料離心試管中，加200μg/mlskf525a、烯丙異丙巴比妥內(nèi)標(biāo)工作液各2μl，100μg/ml環(huán)氧七氯工作液10μl，振蕩混勻，加入0.1m磷酸鹽緩沖溶液(ph6.0)6ml，振蕩10min，離心10min，分離上清液，用于固相萃取上樣；(2)固相萃取步驟：①柱活化：分別用5ml甲醇及5ml磷酸鹽緩沖溶液(0.1m，ph6.0)活化固相柱，流速1.5ml/min；所用固相柱選自hlb固相萃取柱或pep固相萃取柱；②上樣：將樣品上清液5ml分別加入到已活化好的固相萃取柱，流速0.5ml/min；③淋洗：分別用3ml水及3ml磷酸鹽緩沖液(0.1m，ph6.0)淋洗固相柱，流速5ml/min；之后空氣加壓5min，流速50ml/min，再通氮?dú)飧稍?0min；④洗脫：用4ml乙酸乙酯：苯(體積比1:1)洗脫，流速0.5ml/min；收集洗脫液，濃縮近干，甲醇定容至100μl，供gc-ms分析。

上述所涉及的毒物包括：1.滅多威；2.甲胺磷；3.敵敵畏；4.乙酰甲胺磷；5.速滅威；6.異丙威；7.氧化樂果；8.治冥磷；9.久效磷；10.甲拌磷；11.毒鼠強(qiáng)；12.樂果；13.呋喃丹；14.特丁磷；15.抗蚜威；16.乙草胺；17.甲草胺；18.甲基對(duì)硫磷；19.馬拉硫磷；20.毒死蜱；21.對(duì)硫磷；22.甲基異柳磷；23.硫丹內(nèi)酯；24.環(huán)氧七氯；25.殺撲磷；26.丁草胺；27.α-硫丹；28.硫丹醇；29.β-硫丹；30.吡氟甲禾靈；31.胺菊酯；32.氰甲菊酯；33.伏殺磷；34.高效氯氟氰菊酯；35.氯菊酯；36.氯氰菊酯；37.氰戊菊酯；38.溴氰菊酯。

上述所涉及的藥物包括：39.巴比妥；40.布洛芬；41.烯丙異丙巴比妥；42.異戊巴比妥；43.戊巴比妥；44.哌替啶；45.眠爾通；46.司可巴比妥；47.咖啡因；48.安替比林；49.氨基比林；50.苯巴比妥；51.撲爾敏；52.阿米替林；53.丙咪嗪；54.多慮平；55.異丙嗪；56.卡馬西平；57.skf525a；58.奧沙西泮；59.苯妥英；60.勞拉西泮；61.安定；62.氯丙嗪；63.利眠寧；64.咪達(dá)唑侖；65.三氟拉嗪；66.芬太尼；67.氯硝西泮；68.氯氮平；69.艾司唑侖；70.阿普唑侖；71.三唑侖；72.佐匹克隆。

進(jìn)一步地，進(jìn)行g(shù)c-ms分析時(shí)的條件為：色譜柱：db-5ms彈性石英毛細(xì)柱(30m×0.25mm×0.25μm)或等效色譜柱；離子源：ei，230℃；升溫程序：初始溫度80℃保持2min，以10℃/min程序升溫至280℃，保持13min；進(jìn)樣口溫度：280℃；傳輸線溫度：280℃；載氣：高純氦氣，純度大于等于99.999％；柱流量：1ml/min；掃描方式：scan，質(zhì)量范圍：40～450amu；分流比：10:1。

進(jìn)一步地，以向空白血液樣品中添加檢出限濃度的2～5倍量的目標(biāo)檢測(cè)物作為陽性對(duì)照樣品，以空白血液樣品作為陰性對(duì)照，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)：

在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，待測(cè)樣品中出現(xiàn)的色譜峰保留時(shí)間與添加對(duì)照樣品的色譜峰保留時(shí)間相比較，相對(duì)誤差在±2％內(nèi)，且特征碎片離子均出現(xiàn)，所選擇的離子相對(duì)豐度比與添加對(duì)照品的離子相對(duì)豐度比之相對(duì)誤差不超過表1規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在這種化合物。

表1相對(duì)離子豐度比的最大允許相對(duì)誤差(％)

陽性結(jié)果評(píng)價(jià)：如果待測(cè)樣品中檢出毒物成分且空白樣品無干擾，則陽性結(jié)果可靠；如果待測(cè)樣品中檢出毒物成分且空白樣品亦呈陽性，則陽性結(jié)果不可靠。

陰性結(jié)果評(píng)價(jià)：如果待測(cè)樣品中出現(xiàn)與內(nèi)標(biāo)環(huán)氧七氯、skf525a和烯丙異丙巴比妥rt相同的色譜峰，且信噪比≥3，未檢出毒物成分，則陰性結(jié)果可靠；如果待測(cè)樣品中未出現(xiàn)內(nèi)標(biāo)環(huán)氧七氯、skf525a和烯丙異丙巴比妥的色譜峰，則陰性結(jié)果不可靠。

本發(fā)明的血液中未知毒物的氣相色譜-質(zhì)譜篩查方法，建立了不同類別毒物的檢測(cè)方法，檢測(cè)快速、準(zhǔn)確，優(yōu)化了前處理方法，給出了常見毒物(基本涵蓋了法庭科學(xué)領(lǐng)域涉及的常見毒物)的檢出限(見附錄a)，確保各類目標(biāo)物的高靈敏有效檢驗(yàn)，為陰性檢驗(yàn)結(jié)果提供了科學(xué)的數(shù)據(jù)支撐，繼而為相關(guān)的臨床診斷、搶救及刑事偵查、訴訟提供有力的科學(xué)依據(jù)。

附圖說明

圖1：38種毒物總離子流色譜圖，其中，出峰順序：1.滅多威；2.甲胺磷；3.敵敵畏；4.乙酰甲胺磷；5.速滅威；6.異丙威；7.氧化樂果；8.治冥磷；9.久效磷；10.甲拌磷；11.毒鼠強(qiáng)；12.樂果；13.呋喃丹；14.特丁磷；15.抗蚜威；16.乙草胺；17.甲草胺；18.甲基對(duì)硫磷；19.馬拉硫磷；20.毒死蜱；21.對(duì)硫磷；22.甲基異柳磷；23.硫丹內(nèi)酯；24.環(huán)氧七氯；25.殺撲磷；26.丁草胺；27.α-硫丹；28.硫丹醇；29.β-硫丹；30.吡氟甲禾靈；31.胺菊酯；32.氰甲菊酯；33.伏殺磷；34.高效氯氟氰菊酯；35.氯菊酯；36.氯氰菊酯；37.氰戊菊酯；38.溴氰菊酯。

圖2：34種藥物總離子流色譜圖，其中，出峰順序：39.巴比妥；40.布洛芬；41.烯丙異丙巴比妥；42.異戊巴比妥；43.戊巴比妥；44.哌替啶；45.眠爾通；46.司可巴比妥；47.咖啡因；48.安替比林；49.氨基比林；50.苯巴比妥；51.撲爾敏；52.阿米替林；53.丙咪嗪；54.多慮平；55.異丙嗪；56.卡馬西平；57.skf525a；58.奧沙西泮；59.苯妥英；60.勞拉西泮；61.安定；62.氯丙嗪；63.利眠寧；64.咪達(dá)唑侖；65.三氟拉嗪；66.芬太尼；67.氯硝西泮；68.氯氮平；69.艾司唑侖；70.阿普唑侖；71.三唑侖；72.佐匹克隆。

圖3：液液萃取四種有機(jī)溶劑提取率比較圖。

圖4：三家實(shí)驗(yàn)室不同固相柱目標(biāo)物最高回收率個(gè)數(shù)所占比重。

圖5：三家實(shí)驗(yàn)室不同洗脫體積目標(biāo)物最高回收率個(gè)數(shù)所占比重。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

下述實(shí)施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)儀器、試劑、材料等，可通過正規(guī)商業(yè)途徑獲得。下述實(shí)施例中所涉及的實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)方法等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)方法等。

實(shí)驗(yàn)血液中毒物/藥物的氣相色譜-質(zhì)譜篩查方法的優(yōu)化

(一)儀器、試劑與材料

儀器：gc-ms(配有ei源)；分析天平(感量0.1mg)；高速離心機(jī)；電動(dòng)振蕩器；固相萃取儀；移液器。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：根據(jù)目標(biāo)物前處理提取方式的不同，將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分為兩大類：一是毒物，主要包括有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類、有機(jī)氯類、除草劑、鼠藥等；二是藥物，主要包括苯并雜氮卓類、巴比妥類、吩噻嗪類、其他安眠鎮(zhèn)靜類藥物等。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具體名稱見表2。

表272種毒(藥)物名稱、cas號(hào)、分子量、化學(xué)類別和類型參數(shù)表

甲醇，8％氫氧化鈉水溶液，10％鹽酸水溶液，磷酸鹽緩沖溶液(0.1m，ph6.0)，所用試劑除另有說明外均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

空白血為健康人血液(血站提供)；尖底塑料離心試管；hlb固相萃取柱、c18固相萃取柱、pep固相萃取柱(規(guī)格均為6ml、200mg)。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液：準(zhǔn)確稱取72種毒(藥)物適量，用甲醇配成1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液，置于冰箱冷凍儲(chǔ)存，保存期限為12個(gè)月；實(shí)驗(yàn)所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液均由儲(chǔ)備液稀釋而得。

同時(shí)，按照毒物和藥物所屬類別(有機(jī)磷、有機(jī)氯、氨基甲酸酯、除草劑、苯并雜氮卓類、巴比妥類、吩噻嗪類，其他類安眠藥等類型)，配制一批濃度為1mg/ml的混標(biāo)溶液。

內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取skf525a和烯丙異丙巴比妥適量，用甲醇配成1mg/ml的混合內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液，置于冰箱中冷凍儲(chǔ)存，保存期限為12個(gè)月。將內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液用甲醇稀釋5倍，得200μg/ml的內(nèi)標(biāo)工作液。環(huán)氧七氯內(nèi)標(biāo)工作液(100μg/ml)購(gòu)自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)監(jiān)測(cè)所。

樣品配制

樣品配制1(用于提取條件考查)：

取空白血液11份，每份2ml，分別向其中添加毒物和藥物混標(biāo)，使目標(biāo)物濃度均為2.0μg/ml。

樣品配制2(用于方法檢出限考查)：

取空白血液12份，每份2ml，分別向其中添加毒物和藥物混標(biāo)，使目標(biāo)物濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0μg/ml(每個(gè)濃度兩份)。

(二)gc-ms條件與前處理方法

(1)gc-ms條件

色譜柱：thermoscientifictg-5ms(agilentdb-5ms或其它等效柱)30m×0.25mm×0.25μm彈性石英毛細(xì)管柱。

色譜條件：進(jìn)樣口：280℃，柱溫：80℃(2min)10℃/min280℃(13min)，流量：1ml/min，分流比：10:1，載氣：he氣。

質(zhì)譜條件：離子源：ei，質(zhì)量掃描范圍：40～450amu，掃描方式：scan，傳輸線溫度：280℃，離子源溫度：230℃。

(2)前處理方法

a.藥物

①直接提取方法(液液萃取)

取空白血液2ml(根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，添加不同濃度的目標(biāo)分析物)，用8％naoh調(diào)ph11–12(體積參考值：50μl)，經(jīng)提取溶劑6ml×2提取，振蕩10min，離心(8000r/min，10min)，分離有機(jī)相，合并于尖底玻璃試管中；剩余液體用10％hcl調(diào)ph2.0–3.0(加入體積參考值：100μl)，經(jīng)提取溶劑6ml×2提取，振蕩10min，離心(8000r/min，10min)，分離有機(jī)相，合并于尖底玻璃試管中；將以上兩步所得提取液合并，濃縮至近干，100μl甲醇定容，供儀器分析。

取空白血液2ml，按上述步驟平行操作，作為空白對(duì)照。

②固相萃取方法

固相萃取柱：c18、hlb、pep；

分別采用c18、hlb、pep三種固相萃取柱，平行進(jìn)行如下操作：

第一步：樣品處理：取空白血液2ml(根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，添加不同濃度的目標(biāo)分析物)，加入0.1m磷酸鹽緩沖液(ph6.0)6ml，混勻，振蕩10min，離心(8000r/min，10min)，分離上清液，用于固相萃取上樣。

第二步：固相萃取步驟：

柱活化：分別用5ml甲醇及5ml磷酸鹽緩沖溶液(0.1m，ph6.0)活化固相小柱，流速1.5ml/min。

加樣：將制備好的樣品分別加入到已活化好的c18柱(加樣量均為5ml)，流速0.5ml/min。

淋洗：分別用3ml水及3ml磷酸鹽緩沖溶液(0.1m，ph6.0)淋洗小柱，流速5ml/min；之后空氣加壓5min(流速50ml/min)，再通氮?dú)飧稍?0min。

洗脫：用6ml洗脫溶劑(直接提取最優(yōu)溶劑)進(jìn)行洗脫，流速0.5ml/min。

第三步：收集洗脫液，濃縮至近干，100μl甲醇定容，供儀器分析。

取空白血液2ml，按上述步驟平行操作，作為陰性對(duì)照。

(2)毒物

①直接提取方法(液液萃取)

取空白血液2ml(根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，添加不同濃度的目標(biāo)分析物)，經(jīng)提取溶劑6ml×2提取，振蕩10min，離心(8000r/min，10min)，分離有機(jī)相，合并于尖底玻璃試管中，常溫濃縮至近干，100μl甲醇定容，供儀器分析。

②固相萃取方法

參見上述藥物固相萃取方法。收集洗脫液后，常溫濃縮至近干，100μl甲醇定容，供儀器分析。

(三)結(jié)果與分析

(1)毒(藥)物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的gc-ms分析

gc-ms聯(lián)用技術(shù)，既具有g(shù)c高分離效能，又具有ms準(zhǔn)確定性的特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)多種目標(biāo)物同時(shí)掃描，快速定性和定量分析。大大提高了分析效率。該檢測(cè)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于環(huán)境、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品安全及法庭科學(xué)等領(lǐng)域。

本研究利用gc-ms全掃描采集模式，以保留時(shí)間和特征碎片離子來確定目標(biāo)物。特征離子選擇原則遵循以下幾點(diǎn)：一是離子豐度相對(duì)較高，分子量較大的碎片離子；二是避免來自離子源污染物、柱流失物、基質(zhì)干擾物等產(chǎn)生的離子，如57、71、73、85、147、207等碎片離子；三是與nist譜圖庫(kù)中目標(biāo)物的質(zhì)譜圖相匹配。一般以豐度比最高且測(cè)定干擾較少的離子作為定量離子(用于計(jì)算回收率)。

為摸索72種毒(藥)物的氣相色譜-質(zhì)譜儀器分析方法，采用單標(biāo)確定保留時(shí)間和混標(biāo)測(cè)試分離情況的方法，分別取濃度為100μg/ml的單標(biāo)和混標(biāo)(分毒物和藥物兩類)，采用前述儀器條件，用氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行分析。同時(shí)，通過不斷稀釋混標(biāo)的濃度，測(cè)試目標(biāo)物對(duì)應(yīng)的儀器檢出限。通過分析，72種毒(藥)物的保留時(shí)間得以確定，每種毒(藥)物的儀器檢出限濃度(s/n≥3)在0.5μg/ml～40μg/ml范圍內(nèi)。該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)了采用前述儀器條件，在35min之內(nèi)，完全能夠?qū)崿F(xiàn)72種毒(藥)物地良好分離，確保了檢驗(yàn)結(jié)果的靈敏度和準(zhǔn)確性，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1、圖2、表3所示。

表372種毒(藥)物和內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間、特征離子和儀器檢出限

從以上圖表中可以看出，利用前述的儀器分析條件，72種毒(藥)物均有著良好的響應(yīng)值和分離度。表3中特征離子有下劃線的，為該物質(zhì)豐度比最高的離子碎片，作為下步已知標(biāo)準(zhǔn)添加測(cè)定回收率的定量離子。

(2)液液萃取條件的優(yōu)化

物質(zhì)在不同溶劑中有不同的溶解度。當(dāng)兩種互不混溶的溶劑共存時(shí)，溶質(zhì)在這兩種溶劑中能分配不同的溶解量?；ゲ幌嗳艿娜軇┩ǔＶ杆团c水不互溶的有機(jī)溶劑，且兩者密度具有一定的差距，易于分離。利用這一性質(zhì)將溶質(zhì)從一種溶劑轉(zhuǎn)移到另一種溶劑中的過程，稱之為液-液萃取。本研究中的72種毒(藥)物，均為有機(jī)化合物，需要用有機(jī)溶劑將其從血液(水相)中萃取出來，經(jīng)濃縮定容后進(jìn)行g(shù)c-ms分析。不同的有機(jī)溶劑對(duì)同一種毒(藥)物的提取率是不相同的；對(duì)于72種毒(藥)物，所選用的提取溶劑應(yīng)能實(shí)現(xiàn)對(duì)大多數(shù)毒(藥)物的良好提取，從而達(dá)到提高檢出靈敏度的目的。因此，提取劑的選擇，對(duì)血液中未知物的篩查至關(guān)重要。

a.液液萃取有機(jī)溶劑的選擇：根據(jù)大量的文獻(xiàn)資料和工作實(shí)踐，選擇了乙酸乙酯、乙酸乙酯/苯(1:1)、乙酸乙酯/氯仿(1:1)、乙酸乙酯/苯/氯仿(1:1:2)四種試劑組合，分別按照前述的方法進(jìn)行提取分析。

為了考查重現(xiàn)性，濟(jì)寧、濰坊和青島均按照上述方法平行操作，分別得到72種毒(藥)物的液液萃取回收率?；厥章视?jì)算方法如下：已知空白血添加毒(藥)物目標(biāo)物的峰面積與相應(yīng)的質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積比值來計(jì)算回收率。

在完成每種物質(zhì)的回收率的計(jì)算后，為方便統(tǒng)計(jì)和表述，分別統(tǒng)計(jì)三家研究單位四種萃取溶劑中回收率最高的毒(藥)物種類個(gè)數(shù)，計(jì)算出其在四種溶劑中所占的比重，最后再將三家單位的數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)四種萃取溶劑，分別求平均值，結(jié)果見表4和圖3。

表4三家實(shí)驗(yàn)室四種溶劑萃取百分比(％)

通過以上圖表中的數(shù)據(jù)可以看出，萃取率最高的毒(藥)物所占比重最大的，無論是毒物還是藥物，均為乙酸乙酯/苯(1:1)。根據(jù)這一實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，最終確定液液萃取溶劑和固相萃取中的洗脫溶劑均選用該試劑。

b.液液萃取-氣質(zhì)聯(lián)用的方法檢出限

確定了乙酸乙酯/苯(1:1)作為篩查方法最優(yōu)萃取溶劑后，我們利用液液萃取-氣質(zhì)聯(lián)用方法，對(duì)72種毒(藥)物的檢出限進(jìn)行了系統(tǒng)性考查。濟(jì)寧、青島和濰坊三家平行進(jìn)行操作。按照72種目標(biāo)物各自的色譜峰(10≥s/n≥3)進(jìn)行評(píng)判，得到三家實(shí)驗(yàn)室的72種目標(biāo)物檢出限數(shù)據(jù)。表5為毒物檢出限，表6為藥物檢出限。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，在檢出限以上濃度(含檢出限)已知添加的目標(biāo)物回收率均在50％～150％之間，完全滿足準(zhǔn)確定性的需要。

表5液液萃取毒物檢出限(μg/ml)

表6液液萃取藥物檢出限(μg/ml)

由于三家實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備新舊不同，人員操作亦存在一定的差異，故液液萃取檢出限濃度不盡相同。綜合分析三家實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)，最終確定了72種毒(藥)物的方法檢出限濃度，見表7。

表772種毒(藥)物的液液萃取方法檢出限表(μg/ml)

(3)固相萃取前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

利用固體吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附，與樣品的基體和干擾化合物分離，然后再用洗脫液洗脫，達(dá)到分離和富集目標(biāo)化合物的目的。

血液中未知物的篩查，常用到的固相萃取柱依據(jù)其萃取填料分為以下三種：(1)烷基鍵合硅膠基質(zhì)。主要有c18，常用于中等極性到非極性化合物的分析；(2)親脂性二乙烯苯和親水性n-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物，如hlb柱，可用于分析酸性、中性和堿性化合物的萃取；(3)官能化聚苯乙烯/二乙烯共聚物，如pep柱，對(duì)各種極性、非極性化合物均具有較均衡的吸附作用。

a.不同固相萃取柱的選擇

本研究中，我們分別選用了c18、hlb、pep三種小柱比較萃取效果。濟(jì)寧、濰坊和青島均按照上述方法平行操作，分別得到72種毒(藥)物的固相萃取回收率。為方便統(tǒng)計(jì)和表述，分別統(tǒng)計(jì)三家單位不同固相萃取柱中回收率最高的毒(藥)物種類個(gè)數(shù)，計(jì)算出其在總數(shù)中所占的比重，最后再將三家測(cè)試單位的數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)求平均值，結(jié)果見表8和圖4。

表8三家實(shí)驗(yàn)室不同固相柱目標(biāo)物最高回收率個(gè)數(shù)所占比重表(％)

從表8和圖4中可以看出，對(duì)于38種毒物來講，60％(23種)以上的均為hlb柱回收率最高；對(duì)于34種藥物來講，80％(27種)以上均為pep柱回收率最高。綜合三家實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)，最終選擇hlb柱作為毒物的最優(yōu)固相萃取柱；pep柱作為藥物的最優(yōu)固相萃取柱。

b.洗脫體積的影響

濟(jì)寧、濰坊和青島分別對(duì)待篩查毒(藥)物在不同洗脫體積下的提取率進(jìn)行了考查。通過測(cè)定目標(biāo)物回收率，計(jì)算出不同洗脫體積中回收率最高的個(gè)數(shù)比，再將三家實(shí)驗(yàn)室對(duì)應(yīng)洗脫體積中的個(gè)數(shù)比求平均值，具體數(shù)據(jù)見表9和圖5。

表9三家實(shí)驗(yàn)室不同洗脫體積目標(biāo)物最高回收率個(gè)數(shù)所占比重表(％)

從表9和圖5中看出，對(duì)于毒物而言，隨著洗脫溶劑體積的不斷增加，大部分毒物的回收率呈下降趨勢(shì)。對(duì)于藥物而言，隨著洗脫溶劑體積的不斷增加，大部分目標(biāo)物回收率僅以非常小的幅度增加，例如洗脫溶劑體積從4ml增至8ml時(shí)，大部分藥物回收率提高不到5％。由此證明，提高洗脫溶劑的體積，不但沒有大幅提高目標(biāo)物回收率，反而增加了濃縮時(shí)間，造成目標(biāo)物的損失，從而最終影響檢驗(yàn)效果。綜合三家實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，最終確定固相萃取洗脫體積定為4ml。

c.固相萃取-氣質(zhì)聯(lián)用方法檢出限

在最優(yōu)條件下，利用固相萃取-氣質(zhì)聯(lián)用方法對(duì)72種毒(藥)物的檢出限進(jìn)行了系統(tǒng)性考查。濟(jì)寧、青島和濰坊三家平行進(jìn)行操作。按照72種目標(biāo)物各自的色譜峰(10≥s/n≥3)進(jìn)行評(píng)判，得到三家實(shí)驗(yàn)室的72種目標(biāo)物固相萃取檢出限數(shù)據(jù)。表10為毒物檢出限，表11為藥物檢出限。根據(jù)三家實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，在檢出限以上濃度(含檢出限)已知添加的目標(biāo)物回收率均在50％～150％之間，完全滿足準(zhǔn)確定性的需要。

表10毒物hlb固相萃取柱檢出限比較(μg/ml)

表11藥物pep固相萃取柱檢出限比較(μg/ml)

同液液萃取檢出限情況一樣，由于三家實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備新舊不同，人員操作亦存在一定的差異，故固相萃取檢出限濃度不盡相同。綜合分析三家實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)，最終確定了72種毒(藥)物的固相萃取方法檢出限濃度，見表12。

表1272種毒(藥)物的固相萃取方法檢出限表(μg/ml)

(4)液液萃取和固相萃取前處理方式的比較

表13液液萃取和固相萃取前處理方式的比較

本研究對(duì)液液提取和固相萃取兩種前處理方式中影響提取率的重要因素進(jìn)行了詳細(xì)考查，并從多個(gè)層面對(duì)兩者進(jìn)行了比較。從表13可以看出，兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。在實(shí)際案件檢驗(yàn)中，可根據(jù)待篩查目標(biāo)物的性質(zhì)及實(shí)驗(yàn)室前處理設(shè)備配置情況，選擇最優(yōu)方法以達(dá)到高效、快速、高靈敏篩查的目的。

(5)目標(biāo)物檢驗(yàn)過程中內(nèi)標(biāo)的使用

在實(shí)際檢測(cè)工作中，血液中未知毒物篩查的陰性結(jié)果所占檢案結(jié)果的比重更大。陰性結(jié)果的判定，現(xiàn)行通用的方法主要有兩種。一種是在空白血中做目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)添加，添加濃度一般接近該目標(biāo)物的檢出限濃度；另一種是在檢血中添加一個(gè)或數(shù)個(gè)內(nèi)標(biāo)，通過內(nèi)標(biāo)的檢出與否來判定陰性結(jié)果的可靠性。對(duì)于多種目標(biāo)物的篩查，為保證定性結(jié)果準(zhǔn)確性，往往需要添加若干種物質(zhì)，操作起來費(fèi)時(shí)費(fèi)力。如果選擇第二種方法，則可以大大簡(jiǎn)化操作步驟。運(yùn)用此方法時(shí)，內(nèi)標(biāo)物的選擇極為關(guān)鍵。按照慣例，內(nèi)標(biāo)物應(yīng)當(dāng)是一個(gè)能得到純樣的化合物，而且是樣品中沒有且投毒案(事)件中極為罕見，它應(yīng)當(dāng)和被分析的樣品組分有基本相同或盡可能一致的物理化學(xué)性質(zhì)、色譜行為和響應(yīng)特征，且在色譜分析條件下，內(nèi)標(biāo)物必須能與樣品中各個(gè)待測(cè)目標(biāo)物充分分離。

本研究結(jié)合實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析，將烯丙異丙巴比妥、skf525a和環(huán)氧七氯三種物質(zhì)分別確定為酸性藥物、中性和堿性藥物及毒物的篩查內(nèi)標(biāo)。實(shí)際案件檢驗(yàn)中，可依據(jù)前述標(biāo)準(zhǔn)溶液配制方法制備這三種物質(zhì)的內(nèi)標(biāo)工作液，根據(jù)所需篩查毒(藥)物種類，向檢材或樣本中添加檢出限濃度的對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，然后按照前述“gc-ms條件與前處理方法”的步驟進(jìn)行檢測(cè)分析，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)毒物篩查陰性結(jié)果的良好質(zhì)控。

實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

本研究中選擇了乙酸乙酯：苯(1:1)作為液液萃取的有機(jī)溶劑，直接定為6ml。主要是考慮到體積過小，有可能形成乳化，直接影響到目標(biāo)物回收率；體積過大，又增加了濃縮的時(shí)間，從而影響分析效率。但具體的影響情況未做進(jìn)一步考察。

考慮到毒物中有部分酸性和堿性目標(biāo)物，故分別在酸性和堿性條件下各提取兩次，實(shí)驗(yàn)證明目標(biāo)物的加標(biāo)回收率均能滿足分析要求，所以未做進(jìn)一步的提取次數(shù)考查。

由于三家單位實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備型號(hào)、狀況不同，所用色譜柱型號(hào)亦不相同，還有不同操作人員實(shí)驗(yàn)操作的差異，造成同一目標(biāo)物的色譜峰保留時(shí)間在不同的實(shí)驗(yàn)室間存在細(xì)微差異，但72種毒(藥)物出峰先后順序，三家實(shí)驗(yàn)室均一致。故篩查目標(biāo)物時(shí)，本研究給出的保留時(shí)間可作為參考依據(jù)。陽性結(jié)果定性時(shí)，要注重與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的已知添加進(jìn)行比對(duì)。

在液液萃取前處理方法中，由于血液中基質(zhì)的干擾，部分目標(biāo)物被基質(zhì)峰所覆蓋，這種情況往往在目標(biāo)物濃度較低時(shí)出現(xiàn)。在進(jìn)行譜圖分析時(shí)，一是通過提取特征離子來尋找目標(biāo)物；二是在確定了目標(biāo)物色譜峰位置后，采取扣除背景的方式，能夠準(zhǔn)確地篩查出目標(biāo)物，避免漏檢。

該研究選擇的72種毒(藥)物涵蓋了農(nóng)藥、鼠藥、安眠鎮(zhèn)靜類藥物、鎮(zhèn)痛藥、消炎藥等種類，對(duì)毒品、其他人工合成藥物等適合用gc-ms法進(jìn)行分析的毒(藥)亦可進(jìn)行篩查。

結(jié)論

本研究對(duì)涉案毒物進(jìn)行了系統(tǒng)調(diào)研總結(jié)，基本涵蓋了法庭科學(xué)領(lǐng)域涉及的常見毒物，并且根據(jù)不同物質(zhì)的性質(zhì)，分別制定了氣質(zhì)聯(lián)用定性篩查方法，極大程度地避免漏檢發(fā)生。

針對(duì)氣質(zhì)聯(lián)用法，優(yōu)化并建立了血液中常見毒物的液液和固相提取方法，提高了目標(biāo)物回收率，確立了兩種定性篩查方法，并提供了兩套完整的與不同提取方法對(duì)應(yīng)的常見毒物在血液中的檢出限數(shù)據(jù)。在未知毒物篩查案件中，可以根據(jù)每種定性篩查方法的檢出限數(shù)據(jù)對(duì)陰性結(jié)果進(jìn)行監(jiān)控，從而快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行定性評(píng)價(jià)。

附錄a72種毒(藥)物和內(nèi)標(biāo)的gc-ms參考參數(shù)

附錄a1：毒物(以目標(biāo)物保留時(shí)間先后為序排列)

附錄a2：藥物(以目標(biāo)物保留時(shí)間先后為序排列)