本發(fā)明涉及一種豆芽中6種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留的測定方法，尤其是涉及一種通過氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜/質(zhì)譜法對豆芽中6種植物生長調(diào)節(jié)劑進行定量檢測的方法。
背景技術(shù)：
：近年來，隨著“毒豆芽”事件的屢次曝光，引起了人民對豆芽質(zhì)量安全的高度重視。所謂“毒豆芽”，是指在豆芽生產(chǎn)過程中非法添加對人體有害的工業(yè)原料、激素、農(nóng)藥、獸藥、抗生素等，從而改變豆芽生產(chǎn)周期和外觀，增加豆芽產(chǎn)量，最后流入市場銷售的豆芽，因其添加的很多物質(zhì)都對人體有害，故稱為毒豆芽。植物生長調(diào)節(jié)劑是人工合成的對植物的生長發(fā)育有調(diào)節(jié)作用的化學(xué)物質(zhì)和從生物中提取的天然植物激素。根據(jù)其作用可分為：植物生長抑制劑，植物生長促進劑，植物生長延緩劑。在生產(chǎn)上常用的有3種類型植物生長促進劑生長素類，分別是：吲哚衍生物，如吲哚乙酸(IAA)，吲哚丁酸(IBA)；氯代苯的衍生物，如2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，2,4-D丁酯；萘乙酸類，如萘乙酸(NAA)；防落素，如4-氯苯氧乙酸(4-CPA)。它們的生理作用與內(nèi)源激素相似，可以促進植物葉片的擴大生長，維管束的分化、根的形成。不法商販在生產(chǎn)豆芽時通過添加豆芽激素，使豆芽長得粗壯長，無毛根，從而來迎合群眾的選購意愿。而人類食用后可以通過新陳代謝將其降解，正常使用情況下合理地使用植物生長調(diào)節(jié)劑，將它在豆芽中的殘留量控制在一定范圍內(nèi)，是不會對人體造成危害的。但是不合理的過量植物生長調(diào)節(jié)劑被人體吸收后，長期食用會對人體產(chǎn)生蓄積危害。GB2760-2014規(guī)定經(jīng)表面處理的新鮮蔬菜中2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的的最大使用量0.01g/kg，最高殘留限量≤2.0mg/kg。國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的食藥監(jiān)食監(jiān)三便函[2014]73號文件提供了一種氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)，檢測豆芽中4-氯苯氧乙酸(4-CPA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、2,4-D-丁酯、吲哚丁酸(IBA)6種植物生長調(diào)節(jié)劑，并且要求測定低限(LOQ)為0.03mg/kg。美國規(guī)定了果蔬類蔬菜中2,4-D的殘留限量為0.1mg/kg。實驗過程中發(fā)現(xiàn)豆芽基質(zhì)干擾較大，尤其是吲哚乙酸(IAA)和吲哚丁酸(IBA)，回收率低，GC-MS法無法準確定量。因此迫切需要建立一個準確、可靠的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜/質(zhì)譜(GC-MS/MS)測定方法。國內(nèi)外關(guān)于豆芽中相關(guān)藥物殘留的檢測方法報道較少。目前，植物生長調(diào)節(jié)劑的檢測方法主要有氣相色譜法(GC)，氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)，氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜/質(zhì)譜法(GC-MS/MS)，高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜/質(zhì)譜法(LC-MS/MS)。常宇文報道了一種利用凝膠滲透色譜-氣相色譜法測定豆芽中2,4-二氯苯氧乙酸殘留量的方法。石金娥采用GC-MS法檢測了豆芽中4-氯苯氧乙酸、萘乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、2,4-D-乙酯、2,4-D-丁酯、吲哚乙酸、吲哚丁酸7種植物生長調(diào)節(jié)劑的殘留量。吳平谷利用氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)法測定了豆芽中2,4-D-乙酯、2,4-D-丁酯、4-氯苯氧乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、β-萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸、多效唑、激動素、6-芐基腺嘌呤10種植物生長調(diào)節(jié)劑的殘留量。李殷利用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定了豆芽中4-氯苯氧乙酸和2,4-二氯苯氧乙酸2種植物生長調(diào)節(jié)劑的殘留量。柴勇利用高效液相色譜法測定了豆芽中赤霉素、激動素、6-芐氨基嘌呤、2,4-二氯苯氧乙酸4種激素的殘留量，方法的測定低限＜0.5mg/kg。劉春生利用超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法檢測了豆芽中咪鮮胺、頭孢氨芐、諾氟沙星、6-芐氨基嘌呤、赤霉酸、2，4-二氯苯氧乙酸、4-氯苯氧乙酸7種藥物的殘留量。劉印平利用氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)法測定了豆芽中4-氯苯氧乙酸、吲哚乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、2,4-二氯苯氧乙酸丁酯、吲哚丁酸、β-萘乙酸6種植物生長調(diào)節(jié)劑的殘留量。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了解決現(xiàn)有豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑殘留檢測的難題，本發(fā)明的目的是提供一種氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定豆芽中4-氯苯氧乙酸(4-CPA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、2,4-D-丁酯、吲哚丁酸(IBA)殘留量的方法，該方法準確、快速、高效，測定低限均為15μg/kg，回收率和精密度均符合殘留分析要求，并且完全滿足國內(nèi)外有關(guān)法規(guī)對豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑殘留的要求，可為進出口豆芽植物生長調(diào)節(jié)劑殘留的監(jiān)管提供技術(shù)支持。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案：氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜/質(zhì)譜法同時測定豆芽中6種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留的方法，6種植物生長調(diào)節(jié)劑為4-氯苯氧乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、吲哚乙酸、2,4-D-丁酯和吲哚丁酸，該方法包括以下步驟：1)樣品處理：①樣品提取分別稱取兩份豆芽試樣各10.0g(精確至0.01g)于兩個50mL離心管中(一份用于測定4-氯苯氧乙酸(4-CPA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)，另一份用于測定2,4-二氯苯氧乙酸丁酯)，分別加入40μL加酸，再加入20mL乙腈，3.0g氯化鈉，渦旋混勻，4000rpm離心5min后，取10mL上層乙腈，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至近干，分別都用甲醇復(fù)溶。②衍生向第一份復(fù)溶液加入1mL三氟化硼甲醇衍生溶液，渦旋混勻，40℃加熱衍生10min，取出冷卻后待凈化用；③凈化將衍生液和2,4-二氯苯氧乙酸丁酯的復(fù)溶液合并后轉(zhuǎn)移至離心管中，加入2.0mL乙酸乙酯-正己烷混合溶液和2.0mL純水，渦旋混勻，4000rpm離心機離心5min，取出上層有機相，向下層水相再加入2.0mL乙酸乙酯-正己烷混合溶液重復(fù)萃取一遍，合并兩次萃取液，40℃水浴下氮吹至1.0mL以下，再用乙酸乙酯-正己烷混合溶液定容至1.0mL，過膜后轉(zhuǎn)移至進樣瓶中供GC-MS/MS分析測定。2)測定：采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜/質(zhì)譜法，其中：液相色譜條件為：a)色譜柱為HP-5MS，30m×0.25mm×0.25μm；b)進樣口溫度：220℃；c)程序升溫：80℃保溫1.0min，10℃/min升溫至230℃，保溫4min，30℃/min升溫至320℃保溫3min；d)載氣：氦氣，純度≥99.999％，流速：1.0mL/min；e)進樣方式：不分流進樣；f)進樣量：2μL；質(zhì)譜條件為：a)電離模式：電子轟擊源(EI)；b)電離能量：70eV；c)離子源溫度：230℃；d)接口溫度：280℃；e)離子檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)；所述的多反應(yīng)監(jiān)測條件如下：其中，帶“*”的為定量離子，其余為定性離子；(3)標準曲線的制作純?nèi)軇藴嗜芤海阂迫?.25mL4-氯苯氧乙酸、2,4-D、萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸的混合工作溶液于10mL玻璃離心管中，再加入1.0mL三氟化硼甲醇溶液，渦旋混勻，40℃加熱衍生10min，取出冷卻后加入0.25mL2,4-D-丁酯工作溶液，然后按照步驟③進行凈化，制備成含量為50ng/mL、75ng/mL、150ng/mL、300ng/mL、500ng/mL的標準溶液；基質(zhì)匹配標準溶液：準確吸取適量空白樣品基質(zhì)，氮吹干，分別加入等量的混合標準工作液，混勻后，配成系列基質(zhì)匹配的標準工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用；(4)空白試驗不加試樣，在步驟1)和步驟2)相同實驗條件下進行試驗；(5)結(jié)果計算和表述按公式以下公式計算試樣中各個植物生長調(diào)節(jié)劑含量：式中：X—試樣中各個植物生長調(diào)節(jié)劑的含量，單位為微克每千克；C—由標準工作曲線得到樣液中各個植物生長調(diào)節(jié)劑的濃度，單位為納克每毫升；V—樣液最終定容體積，單位為毫升；m—最終樣液所代表的試樣質(zhì)量，單位為克。本發(fā)明的測定方法采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜/質(zhì)譜法同時測定豆芽中6種植物生長調(diào)節(jié)劑，方法簡便、快速、準確、可靠，測定低限、回收率和精密度均符合要求。本發(fā)明的測定方法具有以下技術(shù)效果：1)首次開發(fā)了氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜/質(zhì)譜法同時測定豆芽中6種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留的方法，填補了技術(shù)空白；2)提供了氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜/質(zhì)譜法同時測定豆芽中6種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留的最優(yōu)條件。附圖說明圖1為空白豆芽樣品的選擇性離子流圖。圖2為4-氯苯氧乙酸(4-CPA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、2,4-D-丁酯、吲哚丁酸(IBA)混合標準溶液的選擇性離子流圖。圖3為空白豆芽樣品添加4-氯苯氧乙酸(4-CPA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、2,4-D-丁酯、吲哚丁酸(IBA)混合標準溶液(15μg/kg)的選擇性離子流圖。具體實施方式為進一步說明本發(fā)明，結(jié)合以下實施例具體說明1試劑和材料1.1正己烷：色譜純。1.2甲醇：色譜純。1.3甲酸：色譜純。1.4三氟化硼甲醇溶液：優(yōu)級純。1.5乙腈：色譜純1.6乙酸乙酯：色譜純1.7氯化鈉：分析純1.850mL聚丙烯具塞塑料離心管、10mL聚丙烯具塞塑料離心管、250mL具塞錐形瓶、100mL濃縮瓶、10mL玻璃離心管等器皿、一次性無菌注射器，0.22μm過濾膜，1.0mL、2.0mL、5.0mL帶刻度玻璃移液管等。1.9乙酸乙酯-正己烷混合液：吸取體積為2mL的乙酸乙酯和8mL的正己烷配成體積比為1:4的乙酸乙酯-正己烷混合液。1.2.10標準品：信息見表1表1標準品信息化合物英文名CAS號4-氯苯氧乙酸4-Chlorophenoxyaceticacid122-88-32,4-二氯苯氧乙酸2,4-Dichlorophenoxyaceticacid94-75-7萘乙酸1-Naphthaleneaceticacid86-87-3吲哚乙酸Indole-3-aceticacid87-51-42,4-二氯苯氧乙酸丁酯Butyl2,4-dichlorophenoxyacetate94-80-4吲哚丁酸3-Indolebutyricacid133-32-41.2.11標準溶液及試劑配制植物生長調(diào)節(jié)劑(6種)儲備液1.0mg/mL：分別稱取0.01g(精確至0.1mg)上述植物生長調(diào)節(jié)劑標準品，用甲醇分別溶解定容至10mL，4℃保存。分別準確量取適量的4-氯苯氧乙酸(4-CPA)、2,4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸5種標準儲備液，混合，用甲醇稀釋配制成100.0μg/mL和10.0μg/mL的5種混合標準溶液，2,4-D-丁酯標準溶液按照此法單獨配制成100.0μg/mL和10.0μg/mL標準溶液，4℃保存。標準工作溶液：準確吸取一定量的5種混合標準溶液，用甲醇稀釋至200ng/mL、300ng/mL、600ng/mL、1200ng/mL、2000ng/mL的標準工作溶液，2,4-D-丁酯標準溶液按照此法單獨配制成200ng/mL、300ng/mL、600ng/mL、1200ng/mL、2000ng/mL，4℃保存。2、儀器和設(shè)備2.1Agilent7890A/5975C氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電子轟擊離子源(EI)2.2色譜柱：AgilentHP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)2.3MS2MiniShaker渦旋混合儀；2.4離心機：飛鴿牌TDL80-2B，不低于4000rpm2.5分析天平；金諾牌TD3102。2.6分析天平；MettlerAE260。2.7BuchiR215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；2.8氮吹儀3、測定步驟3.1樣品前處理3.1.1樣品提取分別稱取兩份豆芽試樣各10.0g(精確至0.01g)于兩個50mL離心管中(一份用于測定4-氯苯氧乙酸(4-CPA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)，另一份用于測定2,4-二氯苯氧乙酸丁酯)，分別加入40μL加酸，再加入20mL乙腈，3.0g氯化鈉，渦旋混勻，4000rpm離心5min后，取10mL上層乙腈，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至近干，分別都用甲醇復(fù)溶。3.1.2衍生向第一份復(fù)溶液加入1mL三氟化硼甲醇衍生溶液，渦旋混勻，40℃加熱衍生10min，取出冷卻后待凈化用；3.1.3凈化將衍生液和2,4-D-丁酯的復(fù)溶液合并后轉(zhuǎn)移至離心管中，加入2.0mL乙酸乙酯-正己烷混合溶液和2.0mL純水，渦旋混勻，4000rpm離心機離心5min，取出上層有機相，向下層水相再加入2.0mL乙酸乙酯-正己烷混合溶液重復(fù)萃取一遍，合并兩次萃取液，40℃水浴下氮吹至1.0mL以下，再用乙酸乙酯-正己烷混合溶液定容至1.0mL，過膜后轉(zhuǎn)移至進樣瓶中供GC-MS/MS分析測定。3.2測定3.2.1氣相相色譜串聯(lián)質(zhì)譜/質(zhì)譜條件由于測試條件取決于所使用的儀器，因此不可能給出色譜分析的普遍參數(shù)。采用下列操作條件已被證明對測試是合適的。(1)氣相色譜條件A)色譜柱：HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)；B)進樣口溫度：220℃；C)程序升溫：80℃(1.0min)10℃/min230℃(4min)30℃/min320℃(3min)；D)載氣：氦氣，純度≥99.999％，流速1.0mL/min；E)進樣方式：不分流進樣；F)進樣量：2μL。(2)質(zhì)譜條件A)電離模式：電子轟擊源(EI)，能量為70eV；B)離子源溫度：230℃；C)接口溫度：280℃；D)離子檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)；E)碰撞氣：高純氮氣；F)監(jiān)測離子對及碰撞能量見表2表2多反應(yīng)監(jiān)測條件其中，帶“*”的為定量離子，其余為定性離子。3.2.2標準工作曲線的制作純?nèi)軇藴嗜芤海阂迫?.25mL4-氯苯氧乙酸、2,4-D、萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸的混合工作溶液于10mL玻璃離心管中，再加入1.0mL三氟化硼甲醇溶液，渦旋混勻，40℃加熱衍生10min，取出冷卻后加入0.25mL2,4-D-丁酯工作溶液，然后按照3.1.3步驟進行凈化，制備成含量為50ng/mL、75ng/mL、150ng/mL、300ng/mL、500ng/mL的標準溶液。(相當于樣品中添加10.0、15.0、30.0、60.0、100.0μg/kg6種植物生長調(diào)節(jié)劑混合標準溶液)基質(zhì)匹配標準溶液：準確吸取適量空白樣品基質(zhì)，氮吹干，分別加入等量的混合標準工作液，混勻后，配成系列基質(zhì)匹配的標準工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。3.2.3空白試驗除不加試樣外，均按上述步驟進行。4、結(jié)果計算和表述按公式(1)計算試樣中各個植物生長調(diào)節(jié)劑含量：式中：X—試樣中各個植物生長調(diào)節(jié)劑的含量，單位為微克每千克；C—由標準工作曲線得到樣液中各個植物生長調(diào)節(jié)劑的濃度，單位為納克每毫升；V—樣液最終定容體積，單位為毫升；m—最終樣液所代表的試樣質(zhì)量，單位為克。5、方法測定低限本發(fā)明方法對于豆芽中4-氯苯氧乙酸、2,4-D、萘乙酸、吲哚乙酸、2,4-D-丁酯、吲哚丁酸等6種植物生長調(diào)節(jié)劑的測定低限均為15μg/kg。6、方法的回收率和精密度本方法回收率實驗設(shè)定了三個添加濃度，按本方法所確定的實驗條件，對每個添加濃度進行6次實驗，回收率及精密度結(jié)果見表3。表3豆芽中6種植物生長調(diào)節(jié)劑同時測定方法的添加回收實驗7、結(jié)論綜合上述情況，本發(fā)明方法的回收率、測定低限和精密度等各項技術(shù)指標均符合要求，方法應(yīng)用于豆芽中6種植物生長調(diào)節(jié)劑同時檢測，重現(xiàn)性良好。本發(fā)明建立的檢驗方法操作簡便、結(jié)果準確。當前第1頁1 2 3