已知用于測定液體樣品中存在被分析物的免疫測定法。免疫測定法的常見類型是夾心免疫測定法。在這樣的測定法中，在涂有捕獲抗體的試板上添加樣品。樣品中存在的被分析物與捕獲抗體結(jié)合并且保留在試板上。清洗試板以去除未結(jié)合的被分析物，然后添加與結(jié)合在捕獲抗體上的被分析物結(jié)合的檢測抗體，從而在兩種抗體之間形成被分析物夾層?？梢酝ㄟ^與檢測抗體附連的標記或者通過添加與檢測抗體結(jié)合的另外被標記的抗體檢測被分析物夾層。被檢測的標記的量與樣品中的被分析物的濃度成正比。

替代方法是競爭抑制試驗。又一次，在試板上設(shè)置捕獲抗體。在試板上添加樣品以及目標被分析物的被標記的版本。為了與捕獲抗體結(jié)合，被標記的被分析物與樣品中存在的被分析物競爭。清洗試板，測定捕獲的被標記的被分析物存在的量。檢測的被標記的被分析物的量通常與樣品中的被分析物的濃度成反比。

已知的測定法有許多問題。例如，對于某些測定法形式，空間位阻會危及抗體與被分析物之間的免疫復合物的形成(例如當所述相互作用發(fā)生在表面時)。

在第一方面，本發(fā)明提供了測定液體樣品中存在的被分析物的方法。本發(fā)明提供了測定液體樣品中存在的被分析物的方法，所述方法包括：

a)使所述液體樣品與預(yù)定量的所述被分析物的類似物以及過量的第一結(jié)合片段(moiety)接觸，其中所述第一結(jié)合片段能夠與所述被分析物和所述類似物的每種獨立地結(jié)合，使得形成混合物，所述混合物包含類似物-第一結(jié)合片段復合物，或者，當所述樣品中存在被分析物時，所述混合物包含(i)類似物-第一結(jié)合片段復合物和被分析物-第一結(jié)合片段復合物；或(ii)被分析物-第一結(jié)合片段復合物且無類似物-第一結(jié)合片段復合物；

b)使所述混合物與第二結(jié)合片段接觸，其中所述第二結(jié)合片段能夠與所述類似物-第一結(jié)合片段復合物結(jié)合，但是不與所述被分析物-第一結(jié)合片段復合物結(jié)合，并且被固定在或能夠被固定在固相上；

c)測定表示存在與所述第二結(jié)合片段結(jié)合的所述類似物-第一結(jié)合片段復合物的信號水平；

其中如果步驟c)中測定的信號水平低于當不存在被分析物時測定的最大信號水平，則所述樣品中存在被分析物。

在上述步驟(a)中，所述第一結(jié)合片段能夠與所述類似物和被分析物同時結(jié)合。

本發(fā)明還提供了一種測定液體樣品中存在被分析物的方法，所述方法包括：

a)使所述液體樣品與預(yù)定量的所述被分析物的類似物以及過量的第一結(jié)合片段接觸，其中所述第一結(jié)合片段能夠與所述被分析物和所述類似物的每種獨立地結(jié)合但是不與所述類似物和被分析物同時結(jié)合，使得形成混合物，所述混合物包含類似物-第一結(jié)合片段復合物，或者當所述樣品中存在被分析物時，所述混合物包含(i)類似物-第一結(jié)合片段復合物和被分析物-第一結(jié)合片段復合物；或(ii)被分析物-第一結(jié)合片段復合物且無類似物-第一結(jié)合片段復合物；

b)使所述混合物與第二結(jié)合片段接觸，其中所述第二結(jié)合片段能夠與所述類似物-第一結(jié)合片段復合物結(jié)合，但是不與所述被分析物-第一結(jié)合片段復合物結(jié)合，并且被固定在或能夠被固定在固相上；

c)測定表示存在與所述第二結(jié)合片段結(jié)合的所述類似物-第一結(jié)合片段復合物的信號水平；

其中如果步驟c)中測定的信號水平低于當不存在被分析物時測定的最大信號水平，則所述樣品中存在被分析物。

本發(fā)明提供了相對于現(xiàn)有技術(shù)的測定法形式的許多優(yōu)點，這些優(yōu)點包括在溶液相形成第一抗體靶復合物；在溶液相中操作競爭免疫測定法形式，然后表面捕獲并且結(jié)合物從游離的標記分離，這比現(xiàn)有技術(shù)的測定法形式涉及更少的清洗步驟。本發(fā)明的方法可以允許比已知方法例如RIA測定法和/或Immulite測定法更快地測定液體樣品中存在被分析物。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法允許在24小時、12小時或4小時內(nèi)測定液體樣品中被分析物的存在。

一旦液體樣品與類似物和第一結(jié)合片段接觸，類似物、第一結(jié)合片段和被分析物(在存在時)根據(jù)公知的布朗運動原理在溶液中自由擴散并且彼此相互作用。當樣品中沒有被分析物時，第一結(jié)合片段可以僅與類似物結(jié)合，并且形成包含類似物-第一結(jié)合片段復合物的混合物?；旌衔锱c第二結(jié)合片段接觸。第二結(jié)合片段與類似物(甚至當其與第一結(jié)合片段復合時)結(jié)合，并且因此在第二結(jié)合片段上捕獲類似物-第一結(jié)合片段復合物，所述第二結(jié)合片段優(yōu)選地被過量提供。第二結(jié)合片段可以例如被固定在表面上，如微孔板的孔中?？商娲?，第二結(jié)合片段可以是能夠被固定的，例如通過被固定的結(jié)合片段，使得其在與類似物-第一結(jié)合片段復合物結(jié)合之前或之后被固定在表面上。在這種情況下，所述方法可以包括使第二結(jié)合片段與表面接觸以便在表面上固定第二結(jié)合片段的額外的步驟。第二結(jié)合片段尚未捕獲的任何第一結(jié)合片段可以在執(zhí)行步驟(c)之前與捕獲的類似物-第一結(jié)合片段復合物分離。這避免了第二結(jié)合片段尚未捕獲的任何第一結(jié)合片段的后續(xù)檢測?？梢允褂萌魏魏线m的分離方法，例如，用緩沖劑清洗、用空氣清洗、磁性分離、過濾或免疫色譜法。然后測定表示存在捕獲的類似物-第一結(jié)合片段復合物的信號水平。

該信號優(yōu)選地從與第一結(jié)合片段直接或間接附連或關(guān)聯(lián)的標記(直接地或間接地)得到。不論如何產(chǎn)生信號以及標記如何與第一結(jié)合片段關(guān)聯(lián)，信號的水平將與第二結(jié)合片段捕獲的類似物-第一結(jié)合片段的量成正比。

第一結(jié)合片段本身可以包含標記。可替代地，第一結(jié)合片段可以不包含標記，并且方法還可以包括使第一結(jié)合片段與第三結(jié)合片段接觸，其中第三結(jié)合片段與第一結(jié)合片段(直接或間接)結(jié)合并且包含標記。因此，在這樣的實施方式中，被標記的第三結(jié)合片段提供表示存在捕獲的類似物-第一結(jié)合片段復合物的信號。第三結(jié)合片段可以在測定信號的水平之前在方法的任何階段與第一結(jié)合片段接觸。例如，在液體樣品與第一結(jié)合片段接觸之前、在此步驟之后但是在混合物與第二結(jié)合片段接觸之前或者在混合物與第二結(jié)合片段接觸之后但是在測定信號水平之前，第三結(jié)合片段可以與第一結(jié)合片段接觸。當?shù)谝唤Y(jié)合片段已經(jīng)與類似物形成復合物并且第二結(jié)合片段已經(jīng)捕獲所述復合物時，第三結(jié)合片段可以與第一結(jié)合片段接觸。一個或更多個中間結(jié)合部分可以被用來使第三結(jié)合片段或標記與第一結(jié)合片段聯(lián)結(jié)?？梢酝ㄟ^標記直接或間接信號的產(chǎn)生。例如，標記可以通過與試劑反應(yīng)而引起產(chǎn)生信號。在這種情況下，方法還可以包括添加合適的試劑以便產(chǎn)生信號的步驟。以下詳細討論合適的標記。

當樣品中不存在被分析物時檢測到的信號水平是測試的最大信號。這是因為沒有被分析物與用于與第一結(jié)合片段結(jié)合的類似物競爭，并且因此形成最大量的類似物-第一結(jié)合片段復合物并被第二結(jié)合片段捕獲。這樣，通過對已知不包含被分析物的樣品進行本發(fā)明的方法可以獲得最大信號。該最大信號可以與在相同條件下(例如，第一結(jié)合片段、類似物和第二結(jié)合片段的濃度)對具有未知的被分析物含量的樣品執(zhí)行的測試進行比較，以便確定是否存在以及存在多少被分析物。

第一結(jié)合片段能夠與被分析物和類似物的每種獨立地結(jié)合，但是優(yōu)選地不同時結(jié)合被分析物和類似物。優(yōu)選地，第一結(jié)合片段對被分析物的親和力與第一結(jié)合片段對類似物的親和力基本上相同。樣品和類似物可以與第一結(jié)合片段同時接觸。在這種情況下，當樣品中存在被分析物時，類似物和被分析物之間直接競爭與第一結(jié)合片段結(jié)合?？商娲?，樣品可以在樣品或第一結(jié)合片段與類似物接觸之前與第一結(jié)合片段接觸。在這種情況下，當樣品中存在被分析物時，被分析物與一定比例的可用的第一結(jié)合片段結(jié)合。類似物然后僅能與被分析物未占用的第一結(jié)合片段結(jié)合(如果實際上被分析物未占用任何第一結(jié)合片段)。在兩種實施方式中，被分析物和類似物競爭與第一結(jié)合片段結(jié)合，并且被分析物-第一結(jié)合片段復合物以與樣品中被分析物的濃度成正比的量形成。因此，與當樣品中不存在被分析物時相比，形成更少的類似物-第一結(jié)合片段復合物。如果存在非常高濃度的被分析物，可能會完全擊敗類似物從而與第一結(jié)合片段結(jié)合，使得不形成類似物-第一結(jié)合片段。因此，形成包含以下各項的任一種的混合物：(i)類似物-第一結(jié)合片段復合物和被分析物-第一結(jié)合片段復合物；或(ii)只有被分析物-第一結(jié)合片段復合物。

所述混合物與第二結(jié)合片段(可以被固定在或不被固定在表面上)接觸。由于混合物中存在比樣品中不存在被分析物時更少的類似物-第一結(jié)合片段復合物(或者完全沒有類似物-第一結(jié)合片段復合物)，第二結(jié)合片段捕獲的類似物-第一結(jié)合片段的量也少于當樣品中不存在被分析物時捕獲的量。第二結(jié)合片段不與類似物-第一結(jié)合片段結(jié)合，并且因此，該復合物不會被第二結(jié)合片段捕獲。第二結(jié)合片段不具有對于被分析物的結(jié)合親和力。這意味著最大量的第二結(jié)合片段可用于捕獲類似物-第一結(jié)合片段復合物，因為第二結(jié)合片段僅具有與類似物的結(jié)合親和力。

在第二結(jié)合片段與混合物接觸之后，按照如上所述測定表示存在與第二結(jié)合片段結(jié)合的類似物-第一結(jié)合片段復合物的信號水平。在第二結(jié)合片段與類似物-第一結(jié)合片段復合物結(jié)合時而不被固定在表面上的情況下，所述方法優(yōu)選地包括使第二結(jié)合片段與表面接觸使得其在測定信號水平之前被固定的步驟。

當樣品中存在被分析物時，步驟(c)中測定的信號水平將低于當樣品中不存在被分析物時測定的信號水平，因為更少的類似物-第一結(jié)合片段復合物形成并被第二結(jié)合片段捕獲。換句話講，檢測的信號與樣品中的被分析物的濃度成反比。

本發(fā)明的方法還可以用于測定樣品中存在的被分析物的量或濃度。為此，步驟(c)中測定的信號水平通常與校準數(shù)據(jù)進行比較。校準數(shù)據(jù)可以通過進行對照獲得，在對照中測定一系列已知的被分析物濃度所產(chǎn)生的信號水平。類似物、第一結(jié)合片段和第二結(jié)合片段的濃度應(yīng)當對被檢測的每種分析物濃度保持恒定。類似地，檢測中使用的這些的每種的濃度應(yīng)當與用于產(chǎn)生校準數(shù)據(jù)的濃度相同，所述校準數(shù)據(jù)將被與檢測結(jié)果比較。因此，本發(fā)明的方法可以包括通過將步驟(c)中測定的信號水平與校準數(shù)據(jù)進行比較來測定樣品中存在的被分析物的量或濃度。

由于檢測的信號水平與被分析物的濃度成反比，信號水平越高，樣品中的被分析物的濃度越低，反之，信號水平越低，樣品中的被分析物的濃度越高。當存在非常低水平的被分析物時，這種相反的關(guān)系特別有用。這是因為這些情況中檢測的信號水平是高的并且因此比信號水平與被分析物的濃度成正比(并且因此，當被分析物以低濃度存在時，產(chǎn)生極低的信號)的常規(guī)分析更容易檢測。因此，本發(fā)明的方法具有以下優(yōu)點：對低水平的被分析物具有高靈敏度。

被分析物可以是能夠與本發(fā)明的第一結(jié)合片段結(jié)合的任何存在物。例如，被分析物可以是或可以包括：肽、多肽、蛋白質(zhì)、核酸、多核苷酸、碳水化合物、病原體、激素、維生素、類固醇、藥物(例如濫用或DOA的藥物)、感染性試劑或表示感染狀態(tài)的存在物、微生物、細菌、病毒、毒素、有機化合物、污染物、殺蟲劑、疾病的生物標記物、用于懷孕或任何上述項的代謝物或抗體的生物標志物。術(shù)語被分析物還包括任何抗原物質(zhì)、半抗原、抗體、大分子及其組合。優(yōu)選地，被分析物包括抗體識別的表位。在一種實施方式中，被分析物是人絨毛膜促性腺激素(hCG)或其片段或部分，包括完整的二聚體hCG、游離α亞基、游離β亞基以及完整的二聚體hCG、游離α亞基、游離β亞基的剪切的、裂解的或截短的形式，包括糖基化的變體，尤其可以包括游離β核心。

人絨毛膜促性腺激素(hCG)是妊娠和腫瘤的重要生物標記物，其通常通過特異性免疫測定法來檢測并定量。在妊娠期是必不可少的并且在受精的幾天內(nèi)可檢測的hCG已經(jīng)成為最頻繁測定的激素之一，并且簡單的、一步式的、基于抗體的hCG測量現(xiàn)在是妊娠檢測的標準。此外，hCG測定在惡性滋養(yǎng)細胞疾病(絨毛膜癌)的診斷和管理中的作用是腫瘤學的偉大成就之一。它是理想的腫瘤標記物，當絨毛膜癌細胞存在時總是存在，并且與那些細胞的數(shù)量在數(shù)量上直接相關(guān)。結(jié)合適當?shù)寞煼ㄕ_使用hCG測定在這種原本侵略性的腫瘤中已經(jīng)產(chǎn)生接近100％的存活率(Gregor，CR等人，J 2011，'Antibody Recognition of a Human Chorionic Gonadotropin Epitope(hCG beta_66-80)Depends on Local Structure Retained in the Free Peptide'，Journal of Biological Chemistry，Vol.286,No.28，pp.25016-25026)。

被分析物的類似物與被分析物的關(guān)系在于，第一結(jié)合片段能夠結(jié)合類似物和被分析物，優(yōu)選地具有基本上相等的親和力。因此，類似物和被分析物可以具有結(jié)構(gòu)的、序列的、化學的或免疫學的相似性，并且可以包含結(jié)合表位。例如，如果被分析物包含氨基酸或核酸序列，類似物可以具有與被分析物的序列的序列同一性。在一些實施方式中，類似物包含與整個被分析物序列或被分析物序列的部分相同的序列。在其他實施方式中，被分析物包含與整個被分析物序列或被分析物序列的部分具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性的序列。與類似物序列的部分相同的被分析物序列的部分的長度可以是約5個至約1000個殘基。例如，該部分的長度可以是約5個至約10個，約10個至約15個，約15個至約20個，約20個至約30個，約30個至約50個，約50個至約70個，約70個至約100個，約100個至約150個，約150個至約250個，約250個至約500個，約500個至約750個，或約750個至約1000個殘基。

類似物-第一結(jié)合片段復合體可以被第二結(jié)合片段結(jié)合。優(yōu)選地，類似物本身能夠被第二結(jié)合片段結(jié)合。然而，第二結(jié)合片段也可以僅結(jié)合類似物與第一結(jié)合片段的復合物。相比之下，第二結(jié)合片段無法結(jié)合被分析物-第一結(jié)合片段復合物。因此，類似物可以包含用于第二結(jié)合片段的結(jié)合區(qū)域，其在被分析物中不存在或是存在于被分析物中但無法與第二結(jié)合片段結(jié)合，例如，其處于被分析物中第二結(jié)合片段不可觸及的位置。所述結(jié)合區(qū)域可以包含氨基酸或核苷酸序列，例如，當類似物僅僅由氨基酸序列或核酸序列組成時。當類似物包含氨基酸序列，第二結(jié)合片段識別的結(jié)合區(qū)域可以是在類似物的氨基酸序列的N-末端、C-末端或任意其他位置。當類似物包含核酸序列時，第二結(jié)合片段識別的結(jié)合區(qū)域可以是在類似物的核酸序列的序列的5’端、序列的3’端或任意其他位置。

在類似物包含氨基酸序列的情況中，類似物優(yōu)選地被重組地表達以包括可以與第二結(jié)合片段結(jié)合并且在被分析物中不存在或者存在于被分析物中但是第二結(jié)合片段不可觸及的氨基酸序列(結(jié)合區(qū)域)?？商娲?，類似物可以使用標準的多肽合成技術(shù)進行合成。重組地表達類似物或者從頭到尾合成類似物以包括被第二結(jié)合片段識別的氨基酸結(jié)合區(qū)域的優(yōu)點在于，這些結(jié)合區(qū)域中僅一個(one)可以摻入到每個類似物分子中。如果在類似物被合成之后向類似物添加第二結(jié)合片段識別的結(jié)合區(qū)域，有可能使多個(multiple)結(jié)合區(qū)域摻入到類似物中。類似物中存在多個結(jié)合區(qū)域可能破壞或抑制本發(fā)明的方法。例如，多個結(jié)合區(qū)域可能阻止類似物與被分析物競爭來結(jié)合第一結(jié)合片段，或當與第一結(jié)合片段復合時，可能阻止類似物與第二結(jié)合片段結(jié)合。

N-末端或C-末端序列可以是一般稱為標簽的類型。非限制性實例一般包括：親和標簽、增溶標簽、色譜標簽和表位標簽。特異性標簽的非限制性實例包括FLAG-標簽、MYC-標簽、HA-標簽、GST-標簽、鏈霉素標簽(Strep-tag)和聚組氨酸標簽(poly-histidine tag)。本技術(shù)人員將意識到許多其他一般類別的標簽以及每個類別的更具體的實例，并且將能夠因此選擇合適的第二結(jié)合片段。在一些實施方式中，結(jié)合區(qū)域可以是已知的抗原表位或可以是合成的。如果是合成的，其鑒于被分析物可以針對類似物特異性地設(shè)計結(jié)合區(qū)域。對已知的抗體或抗體片段特異性的表位可以形成類似物的部分。

在一種實施方式中，被分析物是hCG并且類似物包含與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列具有75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列：

SEQ ID NO:1：

HHHHHHHNELSHFLEGSSSS KEPLRPRCRP INATLAVEKE GCPVCITVNT TICAGYCPTM TRVLQGVLPA LPQVVCNYRD VRFEVALSCQCA LCRRSTTDCG GPKDHPLTCD DPRFQDSSSS KAPPPSLPSP SRLPGPSDTP ILPQ

SEQ ID NO:2：

NELSHFLEGS SSSKEPLRPR CRPINATLAV EKEGCPVCIT VNTTICAGYC PTMTRVLQGV LPALPQVVCN YRDVRFEVALSC QCALCRRSTT DCGGPKDHPL TCDDPRFQDS SSSKAPPPSL PSPSRLPGPS DTPILPQ

兩種序列的下劃線區(qū)域表示唯一表位區(qū)域，在本文中稱為“ST068”。下劃線區(qū)域與第二結(jié)合片段結(jié)合并且在被分析物中不存在，例如hCG中。

SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的雙下劃線區(qū)域，即，序列：SIRLPGCPRGVNP VVSYA，表示hCG中發(fā)現(xiàn)的結(jié)合區(qū)域，稱為β-3。因此，類似物可以包含(并且第一結(jié)合片段可以結(jié)合)下述序列，所述序列包含SEQ ID NO:1的雙下劃線部分，即，SEQ ID NO:1的第85至102位殘基，或SEQ ID NO:2的雙下劃線部分，即，SEQ ID NO:2的第78-95位殘基；或由SEQ ID NO:1的雙下劃線部分，即，SEQ ID NO:1的第85至102位殘基組成；或由SEQ ID NO:2的雙下劃線部分，即，SEQ ID NO:2的第78-95位殘基組成。類似物可以包含(并且第二結(jié)合片段可以結(jié)合)下述序列，所述序列包含SEQ ID NO:1的第8-15位殘基或SEQ ID NO:2的第1-8位殘基；或由SEQ ID NO:1的第8-15位殘基或SEQ ID NO:2的第1-8位殘基組成。所述SEQ ID NO:1的第8-15位殘基或SEQ ID NO:2的第1-8位殘基即序列：NELSHFLE，其可以稱為TAG表位。類似物可以包含與序列：SIRLPGCPRGVNPVVSYA具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的序列，或者可以包含與序列：NELSHFLE具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的序列。類似物可以包括多組氨酸標簽，例如，SEQ ID NO:1的第1-7位殘基。

在其他實施方式中，具體地講，在其中被分析物為hCG的實施方式中，類似物包含至少157個氨基酸，并且可以至少包含SEQ ID NO:2的第1-8位和第84-95位氨基酸。可替代地，類似物可以包含至少164個氨基酸，并且可以至少包含SEQ ID NO:1的第1-15位和第95-102位氨基酸。在一個實施方式中，類似物可以與SEQ ID NO:1具有50％的同一性，并且至少包含SEQ ID NO:1的第1-15位和第71-83位氨基酸。

在另一個實施方式中，類似物包含NELSHFLEX_mSIRLPGZ_nPVVSYA(SEQ ID NO:3)，其中X是具有長度“m”的連接肽，并且Z是具有長度“n”的連接肽。X和Z可以相同或者可以不同，并且可以每個獨立地為例如，氨基酸序列、聚乙二醇(PEG)、VA(參見以下結(jié)構(gòu))或β-丙氨酸。

VA連接肽：

連接肽X的功能是減少TAG表位與hCG序列之間的空間干擾。為此，至少1.5nm(15埃)的距離應(yīng)當足夠。這大約等于五個氨基酸或兩個AEEAc連接肽(PEG的短的替代選擇)或合適的PEG連接肽(例如，具有兩個重復單元)。

連接肽Z的功能是鼓勵反平行β轉(zhuǎn)角，使得hcG-β3的兩個側(cè)翼序列以可以與第一結(jié)合片段結(jié)合的構(gòu)象表位排列。所述構(gòu)象表位的第一結(jié)合片段的親和力在測定法的背景中很重要，并且可以通過調(diào)節(jié)連接肽的性能，例如其長度和氨基酸含量來優(yōu)化。

當X和/或Z為氨基酸序列時，“m”和“n”的長度均可以是約3個至約100個殘基，長度均可以是約5個至約90個殘基，長度均可以是約10個至約80個殘基，長度均可以是約20個至約70個殘基。例如，“m”和/或“n”的長度可以是3個、4個或5個殘基。在“m”和/或“n”的長度為3個殘基的實施方式中，可以使用序列PPN。本文中使用的術(shù)語氨基酸包括氨基和羧酸基的任何分子，包括自然產(chǎn)生的氨基酸、非自然產(chǎn)生的氨基酸和氨基酸衍生物，例如AEEAc和氨基-PEG-酸。

所需的類似物的量取決于多個因素。通常以低的、有限的濃度提供類似物。這可以是約4-8微微克/ml，但是所需的濃度對每個批次都不同，并且技術(shù)人員可以測定合適的濃度。

結(jié)合片段(第一、第二和/或第三)可以是自然產(chǎn)生的或完全合成的或部分合成的。結(jié)合片段及其靶(類似物和被分析物是第一結(jié)合片段的靶，類似物-第一結(jié)合片段復合物是第二結(jié)合片段的靶，并且第一結(jié)合片段是第三結(jié)合片段(當存在時)的靶)共同形成一對結(jié)合伙伴。結(jié)對的成員具有彼此特異性結(jié)合的性質(zhì)。特異性結(jié)合的結(jié)對的類型的實例是抗原-抗體，生物素-抗生物素蛋白，激素-激素受體，互補核苷酸序列，互補的肽序列，受體-配體，酶輔助因子-酶，酶抑制劑-酶，酶-底物，碳水化合物-凝集素，聚合酸-堿，染料-蛋白結(jié)合劑，肽-特異性蛋白結(jié)合劑(例如，核糖核酸酶、S-肽和核糖核酸酶S-蛋白)等。雖然本發(fā)明一般涉及抗原-抗體類型的反應(yīng)，并且本發(fā)明的優(yōu)選的結(jié)合片段是抗體或其片段，也設(shè)計了采用其他類型的結(jié)合片段和結(jié)合結(jié)對的其他實施方式。

本文中使用的術(shù)語“抗體”指的是免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，包含特異性地結(jié)合抗原的抗原結(jié)合位點的分子(自然產(chǎn)生的或者部分合成的或全部合成的)。所述術(shù)語還涵蓋具有作為抗體結(jié)合域或與抗體結(jié)合域同源的結(jié)合域的任何多肽或蛋白質(zhì)。這些可以從自然來源獲得，或者可以部分合成地或全部合成地產(chǎn)生?？贵w的實例是：免疫球蛋白同種型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)及其同型子類；包含抗原結(jié)合域的片段，如Fab、F(ab’)₂、scFv、Fv、dAb、Fd；和雙體?？贵w可以是多克隆的或單克隆的。單克隆抗體可以在本文中稱為“mab”。

能夠利用單克隆抗體和其他抗體，并且使用重組DNA技術(shù)的技術(shù)來產(chǎn)生保留原始抗體的特異性的其他抗體或嵌合體分子。這些技術(shù)可以涉及向不同的免疫球蛋白的恒定區(qū)或恒定區(qū)加上框架區(qū)引入編碼抗體的免疫球蛋白可變區(qū)、或互補決定區(qū)(CDR)的DNA。例如參見EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400。

因為可以以許多方式制作或修飾抗體，術(shù)語抗體應(yīng)當理解為涵蓋任何特異性結(jié)合成員或具有帶有所需特性的結(jié)合域的物質(zhì)。因此，該術(shù)語涵蓋抗體片段、衍生物、抗體的功能等同物和同系物、人源化抗體，包括包含免疫球蛋白結(jié)合域的任何多肽(不論是自然產(chǎn)生的還是全部合成的或部分合成的)。因此包含免疫球蛋白結(jié)合域或等同物的與另一種多肽融合的嵌合體分子也被包括。嵌合體抗體的克隆和表達詳見于EP-A-0120694和EP-A-0125023。人源化抗體可以是具有非人源(例如，鼠科)抗體的可變區(qū)和人源抗體的恒定區(qū)的經(jīng)修飾的抗體。例如美國專利號5225539中描述了用于制備人源化抗體的方法。

已經(jīng)表明了整個抗體的片段可以執(zhí)行結(jié)合抗原的功能。結(jié)合片段的實例是：(i)由VL、VH、CL和CH1域組成的Fab片段；(ii)由VH和CH1域組成的Fd片段；(iii)由單個抗體的VL和VH域組成的Fv片段；(iv)由VH域組成的dAb片段(Ward，E.S.等人，Nature 341:544-546(1989))；(v)隔離的CDR區(qū)；(vi)F(ab’)2片段，包含兩個關(guān)聯(lián)的Fab片段的二價體片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH域和VL域通過多肽連接肽關(guān)聯(lián)，其允許兩個域關(guān)聯(lián)來形成抗原結(jié)合位點(Bird等人，Science 242:423-426(1988)；Huston等人，PNAS USA 85:5879-5883(1988))；(viii)雙特異性單鏈Fv二聚體(PCT/US92/09965)和(ix)通過基因融合構(gòu)造的“雙體”、多價體或多特異性片段(WO94/13804；P.Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993))。

雙體是多肽的多聚體，每個多肽包含：包含免疫球蛋白輕鏈的結(jié)合區(qū)的第一域和包含免疫球蛋白重鏈的結(jié)合區(qū)的第二域，這兩個域是聯(lián)結(jié)的(例如，通過多肽連接肽)但是無法彼此關(guān)聯(lián)上來形成抗原結(jié)合位點：抗原結(jié)合位點通過使多聚體內(nèi)的一個多肽的第一域與多聚體內(nèi)的另一個多肽的第二域關(guān)聯(lián)來形成(WO94/13804)。

在使用雙特異性抗體的情況中，這些雙特異性抗體可以是能夠通過多種方式制造的常規(guī)的雙特異性抗體(Hollinger&Winter，Current Opinion Biotechnol.4:446-449(1993))，例如，通過化學方式制備或從混合雜交瘤制備，或者可以是任何以上提及的雙特異性抗體片段。優(yōu)選的是使用scFv二聚體或雙體，而非整個抗體。僅使用可變域，可以在沒有Fc區(qū)的情況下構(gòu)造雙體和scFv，潛在地降低抗個體基因型反應(yīng)的效應(yīng)。其他形式的雙特異性抗體包括單鏈“Janusins”，詳見于Traunecker等人，EMBO Journal 10:3655-3659(1991)。

雙特異性雙體，相比雙特異性整個抗體，也可以是有用的，因為它們?nèi)菀讟?gòu)造并且在大腸桿菌中表達。合適的結(jié)合特異性的雙體(和許多其他多肽，如抗體片段)可以通過使用來自庫的噬菌體展示(WO94/13804)容易地進行選擇。如果雙特異性抗體的一個臂將要保持恒定，例如，具有針對抗原X的特異性，那么可以制作其中另一個臂被改變并且選擇合適的特異性的抗體的庫。

“抗原結(jié)合域”是包含與抗原部分或全部特異性結(jié)合的區(qū)域的抗體的部分。在大抗原的情況下，抗體可以僅結(jié)合抗原的特異性部分，該部分被稱為表位。抗原結(jié)合域可以由一個或更多個抗體可變域提供?？乖Y(jié)合域可以包含抗體輕鏈可變區(qū)(VL)和抗體重鏈可變區(qū)(VH)。

“特異性”一般用于指結(jié)合片段不會表現(xiàn)出與除其靶之外的分子任何顯著結(jié)合的情形，例如，與任何其他分子具有小于約30％、優(yōu)選地小于約20％、10％、1％、0.5％、0.3％、0.2％或0.1％的交叉反應(yīng)性。該術(shù)語還適用于例如抗原結(jié)合域?qū)τ谟稍S多抗原攜帶的特定表位是特異性的情形，在這種情況下，攜帶抗原結(jié)合域的結(jié)合片段將能夠結(jié)合攜帶表位的多種抗原。

第一、第二和第三結(jié)合片段沒必要必須具有相同類型的結(jié)合片段，盡管它們在一些實施方式中可以是這樣的。

第一結(jié)合片段可以是hCGβ3-環(huán)-特異性單克隆抗體，例如，抗體“8G5”(參見Gregor等人，J Biol Chem.2011Jul 15；286(28):25016-26)。第一結(jié)合片段可以在約1ng/ml的濃度下使用，并且可以是抗體-HRP綴合物。

第二結(jié)合片段可以被固定在或能夠被固定在選自包含以下各項的組的表面上：微量滴定板、硝基纖維素基質(zhì)、玻璃纖維基質(zhì)、顆粒、膜、栓(peg)、載玻片(slide)、吸水膜、微流體裝置的表面、色譜材料。顆?？梢岳缡谴判灶w粒、乳膠顆粒、玻璃顆粒、磁敏感顆粒或膠態(tài)金屬顆粒。

如上所述，該信號優(yōu)選地從與第一結(jié)合片段直接或間接附連或關(guān)聯(lián)的標記(直接地或間接地)得到。“標記”指的是能夠產(chǎn)生視覺或儀器裝置可檢測的信號的任何物質(zhì)。本發(fā)明中有用的多種標記包括通過化學的或物理的方式產(chǎn)生信號的標記，例如，可通過光學方式檢測到。所述標記包括酶和底物、色原體、催化劑、熒光化合物、化學發(fā)光化合物、電活性物質(zhì)、染料分子、放射性標記和顆粒標記。第一結(jié)合片段本身可以內(nèi)在地能夠產(chǎn)生可檢測的信號。標記可以與第一結(jié)合片段共價結(jié)合。特別地，標記可以選自可通過光學方式檢測到的標記。當標記包含酶時，所述方法可以包括使酶與底物接觸以產(chǎn)生信號的步驟。在一種實施方式中，標記是辣根過氧化物酶(HRP)。

標記可以包括顆粒，如金顆粒，銀顆粒，膠體非金屬顆粒，如硒或碲，染色或著色的顆粒，如摻入染料或染料溶膠的聚合物顆粒。染料可以是任何合適的顏色，例如，藍色。染料可以是發(fā)熒光的。染料溶膠可以從市售的疏水性染料如Foron Blue SRP(Sandoz)和Resolin Blue BBLS(Bayer)制備。合適的聚合物標記可以選自合成的聚合物范圍，如聚苯乙烯、聚乙烯基甲苯、聚苯乙烯-丙烯酸和聚丙烯醛。使用的單體通常是水溶性的，并且在水性表面活性劑中乳化使得形成單體膠粒(micelle)，然后通過向乳液添加引發(fā)劑使單體膠粒聚合。產(chǎn)生基本上球形的聚合物顆粒。所述聚合物顆粒的理想粒度范圍為約0.05至約0.5μm。根據(jù)示例性的實施方式，標記為藍色聚合物顆粒或金顆粒。

如上所述，在所述方法的開始，第二結(jié)合片段可以被固定在表面上，或者可以不被固定。在后一種情況中，第二結(jié)合片段可以在其已經(jīng)與表面接觸并被固定之前或之后與類似物-第一結(jié)合片段復合物接觸。

液體樣品可以源自任何來源，如工業(yè)來源、環(huán)境來源、農(nóng)業(yè)來源或生物來源。樣品可以源自生物來源或由生物來源組成，所述生物來源包括：血、血清、血漿、組織間液、唾液、痰、水晶體結(jié)構(gòu)液(ocular lens liquid)、汗液、尿液、乳、腹水液、粘液、滑液液、腹膜液、經(jīng)皮滲出物、咽排泄物、支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage)、氣管呼吸物(tracheal aspirations)、腦脊髓液、精液、宮頸粘液、陰道或尿道分泌物及羊水。液體樣品可以通過稀釋、處理或提取成水性液體而從半固態(tài)或固態(tài)來源得到。

在某些情況下，可能預(yù)期樣品含有非常高濃度的被分析物。例如，當樣品已經(jīng)從具有晚期疾病狀態(tài)的受試者獲得時，可能是這種情況。在這種情況下，在樣品與第一結(jié)合片段和類似物接觸之前可以稀釋樣品以使被分析物的濃度在合適的范圍內(nèi)以供測定。

在第二方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測目標被分析物的測試試劑盒。本發(fā)明提供了用于檢測目標被分析物的測試試劑盒，所述試劑盒包含：

i)被分析物類似物；

ii)(a)被標記的第一結(jié)合片段或(b)未被標記的第一結(jié)合片段和被標記的第三結(jié)合片段；以及

iii)能夠被固定的第二結(jié)合片段，

其中所述第一結(jié)合片段能夠與目標被分析物和類似物的每種獨立地結(jié)合，所述第二結(jié)合片段能夠與所述類似物和所述第一結(jié)合片段的復合物結(jié)合，但是不能與所述被分析物或所述第一結(jié)合片段和所述被分析物的復合物結(jié)合，并且所述第三結(jié)合片段能夠與所述第一結(jié)合片段或與所述類似物-第一結(jié)合片段復合物結(jié)合。

所述第一結(jié)合片段能夠與所述類似物和被分析物兩者同時結(jié)合。

本發(fā)明還提供了一種用于檢測目標被分析物的測試試劑盒，所述試劑盒包含：

i)被分析物類似物；

ii)(a)被標記的第一結(jié)合片段或(b)未被標記的第一結(jié)合片段和被標記的第三結(jié)合片段；以及

iii)能夠被固定的第二結(jié)合片段，

其中所述第一結(jié)合片段能夠與目標被分析物和類似物的每種獨立地結(jié)合但是不能與所述類似物和所述被分析物同時結(jié)合，所述第二結(jié)合片段能夠與所述類似物和所述第一結(jié)合片段的復合物結(jié)合，但是不能與所述被分析物或所述第一結(jié)合片段和所述被分析物的復合物結(jié)合，并且所述第三結(jié)合片段能夠與所述第一結(jié)合片段或所述類似物第一結(jié)合片段復合物結(jié)合。

被分析物、類似物以及第一、第二和第三結(jié)合片段可以如在與本發(fā)明的第一方面所定義。

在第三方面，本發(fā)明提供了包含與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列具有75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的同一性的氨基酸序列的或由與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列具有75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的同一性的氨基酸序列組成的多肽，或者包含氨基酸序列NELSHFLEX_nSIRLPGZ_nPVVSYA(SEQ ID NO:3)的或由氨基酸序列NELSHFLEX_nSIRLPGZ_nPVVSYA(SEQ ID NO:3)組成的多肽，其中X和Z是長度分別為“m”和“n”的連接肽。X、Z、m”和“n”如本發(fā)明的第一方面所限定。

所述多肽可以包含與序列：SIRLPGCPRGVNPVVSYA具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的序列，和/或可以包含與序列：NELSHFLE具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的同一性的序列。所述多肽可以包含至少164個氨基酸，并且可以至少包含SEQ ID NO:1的第1-15位和第95-102位氨基酸。所述多肽可以包含至少157個氨基酸，并且可以至少包含SEQ ID NO:2的第1-8位和第84-95位氨基酸。在一個實施方式中，所述多肽可以與SEQ ID NO:1具有50％的同一性，并且至少包含SEQ ID NO:1的第1-15位和第71-83位氨基酸。

本發(fā)明多肽可以設(shè)置為隔離的或重組的形式，并且可以與其他片段融合。多肽可以設(shè)置為基本上純的形式，也就是說，在基本程度上不含其他蛋白。因此，多肽可以在其作為主要成分存在的組合物中被提供(即，當以排除溶劑或載體的重量為基礎(chǔ)來測定時，其以至少50％的水平；優(yōu)選地至少75％、至少90％或至少95％的水平存在)。

本發(fā)明的第四方面提供編碼第三方面的多肽的核酸。

如在本文中所使用，關(guān)于核酸分子，隔離的或重組的意味著以下各項的任一種：a)體外擴增的，通過例如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)；b)通過克隆重組產(chǎn)生；c)純化的，通過例如凝膠分離；或d)合成的，例如通過化學合成。

核酸，例如，DNA和RNA，可以通過使用本領(lǐng)域中已知的方法合成，例如，使用常規(guī)的化學方法或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增或其他擴增方法。

在第五方面，本發(fā)明提供了包含編碼第三方面的多肽的核酸的表達載體。

很多種宿主表達載體系統(tǒng)可以用于表達本發(fā)明的多肽。所述宿主表達系統(tǒng)可以表示目標的編碼序列可以經(jīng)其產(chǎn)生并且被后續(xù)純化的載體，但還可以表示，當用合適的核苷酸編碼序列轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)導或轉(zhuǎn)染時，可以原地(in situ)表達本發(fā)明的多肽的細胞。這些包括，但不限于，微生物，例如用含有多肽編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達載體轉(zhuǎn)化的細菌(例如，E.coli、B.subtilis)；用含有多肽編碼序列的重組酵母表達載體轉(zhuǎn)化的酵母(例如，Saccharomyces、Pichia)；用含有多肽編碼序列的重組病毒表達載體(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統(tǒng)；用重組病毒表達載體(例如，花椰菜花葉病毒、CaMV；煙草花葉病毒、TMV)感染的，或用含有多肽編碼序列的重組質(zhì)粒表達載體(例如，Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細胞系統(tǒng)；或攜帶下述重組表達構(gòu)建體的哺乳動物細胞系統(tǒng)(例如COS、CHO、BHK、293、3T3細胞)，所述構(gòu)建體含有來自哺乳動物細胞基因組的啟動子(例如，金屬硫蛋白啟動子)或來自哺乳動物病毒的啟動子(例如，腺病毒晚期啟動子；牛痘病毒7.5K啟動子)。

在細菌系統(tǒng)中，許多表達載體可以根據(jù)旨在用于表達的多肽的用途來有利地選擇。例如，當將要生產(chǎn)大量的所述多肽時，可能希望指導表達容易純化的高水平融合蛋白產(chǎn)物的載體。這些載體包括，但是不限于，E.coli表達載體pUR278(Ruther等人，1983，EMBO J.2:1791)；pIN載體(Inouye&Inouye，1985，Nucleic Acids Res.13:3101-3109；Van Heeke&Schuster，1989，J.Biol.Chem.24:5503-5509)等。pGEX載體也可以用于表達作為具有谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白的外源多肽。一般來講，所述融合蛋白是可溶的，并且可以通過以下方式容易地從溶解的細胞被純化：吸附并與包含谷胱甘肽-瓊脂糖珠的基質(zhì)結(jié)合，然后在游離谷胱甘肽的存在下洗脫。pGEX載體被設(shè)計成包含凝血酶或Xa因子蛋白酶切割位點，使得從GST片段可以釋放被克隆的靶基因產(chǎn)物。

在昆蟲系統(tǒng)中，Autographa californica核型多角體病毒(AcNPV)用作載體來表達外源基因。病毒在Spodoptera frugiperda細胞中生長。多肽編碼序列可以被單獨地克隆到病毒的非必要區(qū)域(例如，多角體蛋白基因)中，并且在AcNPV啟動子(例如，多角體蛋白啟動子)的控制下放置。在哺乳動物宿主細胞中，可以利用許多基于病毒的表達系統(tǒng)(例如，腺病毒表達系統(tǒng))。

如上所述，可以選擇調(diào)節(jié)插入的序列的表達的或者以所需的特異性方式修飾并處理基因產(chǎn)物的宿主細胞株。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的所述修飾(例如，糖基化)以及處理(例如，裂解)對蛋白質(zhì)的功能會很重要。

為了本發(fā)明的多肽的長期的、高產(chǎn)率生產(chǎn)，穩(wěn)定的表達是優(yōu)選的。例如，通過以下方式可以產(chǎn)生穩(wěn)定表達多肽的細胞系：用包含多肽的核苷酸序列和可選的(例如，新霉素或潮霉素)核苷酸序列的表達載體轉(zhuǎn)染細胞，并且選擇用于可選的標記物的表達。所述改造的細胞系在篩選和評價與多肽直接或間接相互作用的化合物中特別有用。

本發(fā)明的多肽的表達水平可以載體擴增來提高(作為綜述，參見Bebbington and Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning，Vol.3(Academic Press，New York，1987))。當表達多肽的載體系統(tǒng)中的標記物是可擴增的，宿主細胞的培養(yǎng)物中存在的抑制劑的水平提高會提高標記物基因的副本的數(shù)量。由于被擴增的區(qū)域與多肽基因相關(guān)，所以多肽的生產(chǎn)也會提高(Crouse等人，1983，Mol.Cell.Biol.3:257)。

一旦本發(fā)明的多肽已經(jīng)被重組地表達，其可以通過本領(lǐng)域中用于純化多肽的已知的任何方法來純化，例如，通過色譜法(例如，離子交換色譜法、親和色譜法例如與蛋白A、聚組氨酸或特異性抗原，以及分級柱色譜法)，離心，差異溶解度或通過用于蛋白質(zhì)純化的任何其他標準技術(shù)。

可替代地，通過利用對被表達的融合蛋白特異性的抗體可以容易地純化任何融合蛋白。例如，Janknecht等人描述的系統(tǒng)允許人源細胞系中表達的非變性融合蛋白的即用的純化(Janknecht等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8972-897)。在該系統(tǒng)中，目標基因被亞克隆到牛痘重組質(zhì)粒中，使得基因的開放讀碼框架轉(zhuǎn)譯地融合至由6個組氨酸殘基組成的氨基末端標簽。所述標簽用作融合蛋白的基質(zhì)結(jié)合域。來自用重組牛痘病毒感染的細胞的提取物被裝載到Ni²⁺氮基乙酸-瓊脂糖柱上，并且用含咪唑緩沖劑選擇性地洗脫組氨酸標簽的蛋白。

在本發(fā)明的一個實施方式中，在第一反應(yīng)階段，在存在有限量的改性形式(“標記靶”或“類似物”)的目標靶分子(被分析物)的情況下孵育被標記的抗體，以便形成類似物被標記的抗體復合物。有限量的類似物被應(yīng)用于混合物，以避免類似物戰(zhàn)勝樣品中存在的自然產(chǎn)生的被分析物而與抗體結(jié)合。因此，由于所述測定法的配置，待研究的樣品中存在的被分析物的量越大，第一結(jié)合片段將捕獲更少量的類似物。所述測定法因此被認為是負讀數(shù)(negative read)免疫測定法，因為源自被標記的抗體的可檢測的信號與樣品中存在的目標被分析物的濃度成反比。

在第二階段中，類似物-被標記的抗體復合物被施加在固相上，對反應(yīng)室中的類似物分子上的獨有標簽有特異性的捕獲物質(zhì)被固定在該固相上。所述固相載有過量的捕獲分子以確保有效捕獲溶液中存在的任何類似物-被標記的抗體復合物。捕獲分子在固相上捕獲類似物-被標記的抗體復合物之后，通過清洗步驟從反應(yīng)室去除任何未結(jié)合的被標記的抗體(即，與靶被分析物復合的抗體)，從而僅留下已經(jīng)在固相上捕獲的類似物-被標記的抗體復合物。此后，根據(jù)已經(jīng)使用的標記，通過使用合適的方法來量化標記的存在。

抗體上的標記可以選自酶、氟、放射性核素、溶膠、發(fā)色團、發(fā)光化合物。根據(jù)選擇的酶，酶的反應(yīng)產(chǎn)物可以通過光學方法(吸光度或熒光或用肉眼)或電化學方法測定。

本發(fā)明還提供了以下各項：

1.與SEQ ID NO:1具有至少50％同源性的重組肽。

2.與SEQ ID NO:1具有至少75％同源性的重組肽。

3.與SEQ ID NO:2具有至少50％同源性的重組肽。

4.與SEQ ID NO:2具有至少75％同源性的重組肽。

5.包含至少157個氨基酸、由至少SEQ ID NO:2的第1-8位和第84-95位氨基酸組成的重組肽。

6.包含至少164個氨基酸、由至少SEQ ID NO:1的第1-15位和第95-102位氨基酸組成的重組肽。

7.包含SEQ ID NO:3的序列的重組肽，其中X和Z均表示連接肽。

8.根據(jù)SEQ ID NO:1的肽用于免疫測定法的制備的用途，包含：

第一抗體，所述第一抗體具有對包含第95-102位氨基酸的區(qū)域的結(jié)合特異性；

第二抗體，所述第二抗體具有對包含第8-15位氨基酸的區(qū)域的結(jié)合特異性；其中所述第二抗體被固定在固相上且其中所述第一抗體與可檢測的標記綴合。

9.根據(jù)第8段的免疫測定法，其中可檢測的標記選自包含酶、熒光團、放射性核素、溶膠、發(fā)色團和發(fā)光化合物的組。

10.根據(jù)第8段的免疫測定法，其中所述第二抗體被固定至固相，所述固相選自包含微量滴定板、磁性顆粒、膜、栓、乳膠粒子、載玻片、吸水膜、微流體裝置的表面、色譜材料的組。

11.一種執(zhí)行免疫測定法的方法，包括：

使懷疑包含目標靶的樣品與第一標記抗體、以及根據(jù)SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中之一的重組肽接觸以啟動競爭免疫測定法以使第一標記抗體與靶結(jié)合來形成第一抗體-重組肽復合物；

向第二抗體施加第一標記抗體-靶復合物，以形成第二抗體-第一標記抗體-重組肽復合物；

從第二抗體-第一抗體-重組肽復合物混合物分離未結(jié)合的第一抗體；并且

檢測第二抗體捕獲的在重組肽上的第一標記抗體的存在。

12.根據(jù)第11段的方法，其中形成第一標記抗體-靶復合物的步驟發(fā)生在本體溶液(bulk solution)中。

13.根據(jù)第11段的方法，其中形成第二抗體-第一標記抗體重組肽復合物的步驟發(fā)生在表面上，并且其中第二抗體被固定在所述表面上。

14.根據(jù)第11段的方法，其中可檢測的標記選自包含酶、熒光劑、放射性核素、溶膠、發(fā)色團和發(fā)光化合物的組。

15.根據(jù)第13段的方法，其中所述第二抗體被固定在顆粒、膜、微量滴定板、載玻片、硝化纖維基質(zhì)、玻璃纖維基質(zhì)的表面上。

16.根據(jù)第15段的方法，其中所述顆粒是磁敏感顆粒、膠態(tài)金屬顆粒、乳膠顆?；虿Ａьw粒。

17.根據(jù)第11段所述的方法，其中從第二抗體第一標記抗體靶復合物分離未結(jié)合的第一標記抗體的步驟包括用緩沖液洗滌，用空氣洗滌，使用磁體、過濾或免疫色譜法去除溶液中的復合物。

18.與SEQ ID NO:1具有至少50％的同一性、由至少SEQ ID NO:1的第1-15位和第71-83位氨基酸組成的重組肽。

本發(fā)明還可以在下面的帶數(shù)字標記的各項中被定義：

1.一種測定液體樣品中存在被分析物的方法，所述方法包括：

a)使所述液體樣品與預(yù)定量的所述被分析物的類似物以及過量的第一結(jié)合片段接觸，其中所述第一結(jié)合片段能夠與所述被分析物和所述類似物的每種獨立地結(jié)合但是不與所述類似物和被分析物同時結(jié)合，使得形成混合物，所述混合物包含類似物-第一結(jié)合片段復合物，或者當所述樣品中存在被分析物時，所述混合物包含(i)類似物-第一結(jié)合片段復合物和被分析物-第一結(jié)合片段復合物；或(ii)被分析物-第一結(jié)合片段復合物且無類似物-第一結(jié)合片段復合物；

b)使所述混合物與第二結(jié)合片段接觸，其中所述第二結(jié)合片段能夠與所述類似物-第一結(jié)合片段復合物結(jié)合，但是不與所述被分析物-第一結(jié)合片段復合物結(jié)合，并且被固定在或能夠被固定在固相上；

c)測定表示與所述第二結(jié)合片段結(jié)合的所述類似物-第一結(jié)合片段復合物的存在的信號水平；

其中如果步驟c)中測定的信號水平低于當不存在被分析物時測定的最大信號水平，則所述樣品中存在被分析物。

2.根據(jù)第1項的方法，其中所述樣品在與所述類似物接觸之前與所述第一結(jié)合片段接觸。

3.根據(jù)第1項或第2項的方法，還包括通過將步驟(c)中測定的信號水平與校準數(shù)據(jù)進行比較來測定所述樣品中存在的被分析物的量或濃度的步驟。

4.根據(jù)前述各項的任一項的方法，其中所述被分析物是hCG或其片段或部分。

5.根據(jù)前述各項的任一項的方法，其中所述信號源自與所述第一結(jié)合片段直接或間接關(guān)聯(lián)的標記。

6.根據(jù)第5項的方法，其中所述標記選自包含酶、熒光團、放射性核素、溶膠、發(fā)色團和發(fā)光化合物的組。

7.根據(jù)前述各項的任一項的方法，其中所述被分析物包含氨基酸序列，并且所述類似物包括與所述被分析物序列的全部或所述被分析物序列的部分相同的氨基酸序列。

8.根據(jù)前述各項的任一項的方法，其中所述類似物包含所述被分析物中不存在的結(jié)合區(qū)。

9.根據(jù)前述各項的任一項的方法，其中所述類似物包含氨基酸序列并且被重組地表達。

10.根據(jù)前述各項的任一項的方法，其中所述類似物包含氨基酸序列NELSHFLEX_mSIRLPGZ_nPVVSYA(SEQ ID NO:3)，其中X和Z是長度分別為“m”和“n”的連接肽。

11.根據(jù)前述各項的任一項的方法，其中所述類似物包含(i)至少164個氨基酸，以及至少SEQ ID NO:1的第1-15位和第95-102位氨基酸；或(ii)至少157個氨基酸，以及至少SEQ ID NO:2的第1-8位和第84-95位氨基酸。

12.根據(jù)前述各項的任一項的方法，其中所述類似物包含SEQ ID NO:1的第8-15位殘基和/或SEQ ID NO:1的第85至102位殘基。

13.根據(jù)前述各項的任一項的方法，其中所述類似物包含與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列具有90％、95％或100％的同一性的氨基酸序列。

14.根據(jù)前述各項的任一項的方法，其中所述第一結(jié)合片段和/或所述第二結(jié)合片段是抗體。

15.根據(jù)前述各項的任一項的方法，其中所述第一結(jié)合片段是hCGβ3-環(huán)特異性單克隆抗體。

16.根據(jù)前述各項的任一項的方法，其中所述樣品源自生物來源或由生物來源組成，所述生物來源包括血、血清、血漿、組織間液、唾液、痰、水晶體結(jié)構(gòu)液、汗液、尿液、乳、腹水液、粘液、滑液液、腹膜液、經(jīng)皮滲出物、咽排泄物、支氣管肺泡灌洗液、氣管呼吸物、腦脊髓液、精液、宮頸粘液、陰道或尿道分泌物或羊水。

17.一種用于檢測目標被分析物的試劑盒，包含：

i)被分析物類似物；

ii)(a)被標記的第一結(jié)合片段或(b)未被標記的第一結(jié)合片段和被標記的第三結(jié)合片段；以及

iii)能夠被固定的第二結(jié)合片段，

其中所述第一結(jié)合片段能夠與目標被分析物和類似物的每種獨立地結(jié)合但是不能與所述類似物和被分析物同時結(jié)合，所述第二結(jié)合片段能夠與所述類似物和所述第一結(jié)合片段的復合物結(jié)合，但是不能與所述被分析物或所述第一結(jié)合片段和所述被分析物的復合物結(jié)合，并且所述第三結(jié)合片段能夠與所述第一結(jié)合片段或所述類似物第一結(jié)合片段復合物結(jié)合。

18.一種多肽，所述多肽包含與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列具有75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列或由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列具有75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列組成，或者包含序列NELSHFLEX_mSIRLPGZ_nPVVSYA(SEQ ID NO:3)或由序列NELSHFLEX_mSIRLPGZ_nPVVSYA(SEQ ID NO:3)組成，其中X和Z是長度分別為“m”和“n”的連接肽。

19.對根據(jù)第18項的編碼多肽的核酸。

20.包含根據(jù)第19項的核酸的表達載體。

本發(fā)明的每個方面的優(yōu)選特征作必要修正后也適用于每個其他方面。本文中提及的現(xiàn)有技術(shù)文件以法律允許的最完整程度被并入。

附圖說明

圖1表示根據(jù)本發(fā)明的實施方式的混合競爭免疫測定法的示意性描述，并且表示目標被分析物與樣品中存在的或可能存在的另一種物質(zhì)之間可能發(fā)生的可能的交叉反應(yīng)。在目標被分析物為hCG的示例性實施方式中，交叉反應(yīng)物質(zhì)為LH。

圖2表示抑制曲線，表明用于hCG測定的選擇的單克隆抗體，moc1(針對保守的β3-hCG環(huán)區(qū)提出)，與LH交叉反應(yīng)。數(shù)據(jù)表示以使50％的抗體飽和所需的配體的量為基礎(chǔ)，相比hCG，與LH的交叉反應(yīng)性是0.27％。

圖3提供了顯示用于與βhCG結(jié)合的單克隆抗體，moc1的特異性的進一步的表征數(shù)據(jù)。曲線圖表示歸因于I125放射標記的moc 1(具有結(jié)合的被標簽的hCG)的在y軸上的計數(shù)的數(shù)量，x軸表示從1000倍至512000倍的稀釋水平。數(shù)據(jù)表示一系列曲線，這些曲線顯示moc1抗體能夠辨別βhCG以及αhCG或LH的能力。緩沖液對照、569游離α和LH都遵循類似樣態(tài)，在低稀釋具有高計數(shù)，計數(shù)隨著樣品被稀釋而下降。然而，當用游離βhCG、“缺刻的(nicked)”βhCG、完整的hCG、“缺刻的”hCG或“核心(core)”hCG(未被標記的靶)孵育抗體和被標簽的hCG時，信號被顯著抑制，甚至在低稀釋時被顯著抑制，因為未被標記的靶成功地戰(zhàn)勝被標簽的hCG而結(jié)合抗體。

圖4表示重組的moc1Fab₁(單體)和Fab₂(二聚體)的比較。

圖5示出了血清TAG測定與RIA測定之間以具有低hCG濃度至高hCG濃度的樣品為基礎(chǔ)的比較。x軸表示通過TAG測定測量的hCG濃度(IU/L)。y軸表示通過RIA測定測量的hCG濃度(IU/L)。

圖6示出了血清TAG測定法與Immulite測定法之間以具有低hCG濃度至高hCG濃度的樣品為基礎(chǔ)的比較。x軸表示通過TAG測定法測量的hCG濃度(IU/L)。y軸表示通過Immulite測定法測量的hCG濃度(IU/L)。

圖7示出了血清TAG測定法與RIA測定法之間以具有中等hCG濃度至高hCG濃度的樣品為基礎(chǔ)的比較。x軸表示通過TAG測定法測量的hCG濃度(IU/L)。y軸表示通過RIA測定法測量的hCG濃度(IU/L)。

圖8示出了血清TAG測定法與Immulite測定法之間的以具有中等hCG濃度至高hCG濃度的樣品為基礎(chǔ)的比較。x軸表示通過Immulite測定法測量的hCG濃度(IU/L)。y軸表示通過TAG測定法測量的hCG濃度(IU/L)。

實施例1-血清TAG測定法方案

試劑

樣品制備

0-100IU/L–在SS中按1:2稀釋

100-1000–在NSS中按1:5稀釋，然后根據(jù)需要在SS中進一步稀釋。

1000–在NSS中按1:50稀釋，然后根據(jù)需要在SS中進一步稀釋。

測定

·通過在SS中稀釋最高hCG標準液(100IU/L)六次以產(chǎn)生50、25、12.5、6.25、3.125和1.56IU/L標準液來制備標準曲線。僅包含SS以得到零標準液。

·酌情稀釋血清樣品(如上所述)。

·使用多道移液器，向微量滴定板的孔添加35μl moc1溶液。

·添加35μl標準液和樣品。

·使用多道移液器，向所有的孔添加35μl TAG溶液。

·在室溫下?lián)u晃板1小時。

·通過傾斜(tipping)并吸附(blotting onto)在薄頁紙上來去除孔中的內(nèi)容物。

·用0.1％Tween/PBS清洗六次。

·添加100μl femto底物，在BMG Fluostar光度計上讀數(shù)。

·使用BMG Omega Mars數(shù)據(jù)分析軟件計算結(jié)果。

實施例2-尿液TAG測定方案

試劑

樣品制備

0-100IU/L–純凈的

>100IU/L–在10％NSS/US中稀釋

測定

●通過在US中稀釋最高hCG標準液(100IU/L)六次以產(chǎn)生50、25、12.5、6.25、3.125和1.56IU/L標準液來制備標準曲線。僅包含SS以得到零標準液。

·酌情稀釋尿液樣品(如上所述)。

·使用多道移液器，向微量滴定板的孔添加35μl moc1溶液。

·添加35μl標準液和樣品。

·使用多道移液器，向所有的孔添加35μl TAG溶液。

●搖晃板，然后在37℃孵育兩小時。

·通過傾斜并吸附在薄頁紙上來去除孔中的內(nèi)容物。

·用0.1％Tween/PBS清洗六次。

●添加100μl femto底物，在BMG Fluostar光度計上讀數(shù)(參見設(shè)置數(shù)據(jù))。

●使用BMG Omega Mars數(shù)據(jù)分析軟件計算結(jié)果(參見設(shè)置數(shù)據(jù))。

實施例3–moc1Fab變體的比較

本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法在E.coli中生產(chǎn)重組moc1Fab₁(單體)和Fab₂(二聚體)。每種Fab變體(單體變體和二聚體變體)被純化，并且根據(jù)制造商的說明書通過使用Lightning Link HRP試劑盒(Innova Bioscience)與辣根過氧化物酶(HRP)綴合。針對綴合過程考慮每個Fab變體的分子量，使得單體Fab₁變體和二聚體Fab₂變體用HRP經(jīng)歷相當水平的標記。

在用HRP標記以及初始活性測試之后，通過使用TAG和hCG在競爭測定中評估被標記的Fab變體以便得到按照實施例1中提供的一般方法的標準曲線。

表1和圖4中給出了測定結(jié)果。

表1.相對于負hCG標準的測定輸出和％信號的平均數(shù)據(jù)

表1和圖4表明了在可比較的測定條件下Fab₂二聚體變體相對于Fab₁單體變體在化學發(fā)光輸出方面具有顯著的約1倍的提高。此外，F(xiàn)ab₂二聚體變體在hCG濃度范圍1.56-25IU/L下對樣品中的hCG濃度比Fab₁單體變體更敏感，如該范圍內(nèi)％信號更劇烈地減小所示(參見圖4)。

實施例4-TAG測定法與Immulite和RIA測定法的臨床研究

進行研究來對TAG測定法(采用本文所描述的Fab₂二聚體變體)和已知的測定法，Immulite測定法和RIA測定法，在臨床樣品中檢測hCG的能力進行比較。

通過每種測定法方法分析臨床血清樣品中hCG的存在和濃度。按照實施例1所描述進行TAG測定法。根據(jù)制造商的說明書進行Immulite測定法(Siemens)。根據(jù)英國國家衛(wèi)生署(National Health Service，UK)提供的方案進行RIA測定法。簡而言之，測定法使用純化的多克隆抗體和碘化的hCG，其中樣品在測量之前被稀釋并與抗體和被標記的hCG混合24小時。

表2和3以及圖5-8中給出了測定法的結(jié)果。

表2.通過TAG測定法、Immulite測定法或RIA測定方法檢測臨床血清樣品中的hCG，其中hCG在樣品中的濃度范圍是從低到高hCG濃度。

表3.通過TAG測定法、Immulite測定法或RIA測定方法檢測臨床血清樣品中的hCG，其中hCG在樣品中的濃度范圍是從中等到高hCG濃度。

圖5-8表明了通過TAG測定法檢測并測量臨床血清樣品中的hCG濃度與已知的Immulite和RIA測定法強烈相關(guān)，在所有情況下的R²值都大于0.9。由于hCG靶表位的抗體識別的差異，所以分析方法之間存在一些變型，然而所有測定法都能夠準確地檢測臨床血清中的hCG。

此外，進一步的臨床研究表明TAG測定法的重要的有益效果是其特別地以良好的靈敏度報告。已經(jīng)看出，在已知的RIA和Immulite測定法能夠這樣做之前，TAG測定法能夠檢測非常低水平的hCG并且檢測患者樣品中的升高，這對于監(jiān)測正在接受治療的患者是很可貴的，特別是當hCG的水平非常低時。除TAG測定法比已知的測定法方法更出色的靈敏度之外，TAG測定法是基于實驗室的并且能夠在比使用簡單的實驗設(shè)施和設(shè)備的已知的測定法更短的時間周期(4小時)內(nèi)完成。