本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種多功能的非核糖體蛋白質(zhì)核仁素及用途，具體涉及應(yīng)用核仁素作為人胃癌分子標(biāo)志物及其在制備檢測或診斷人胃癌的制劑或試劑盒以及治療藥物中的用途。

背景技術(shù)：

現(xiàn)有技術(shù)公開了胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，每年新發(fā)的胃癌約100萬，死亡率在全球僅次于肺癌，高居癌癥病死率的第二位。在我國每年死于胃癌的患者居消化道腫瘤死亡原因的首位。研究顯示，胃癌的預(yù)后與疾病的分期密切相關(guān)，早期診斷以及早期治療能夠顯著改善預(yù)后，延長生存期。目前臨床實(shí)踐中，較通行、常規(guī)的檢查為血清血液檢查，血清CEA、CA19-9、CA50、CA125等腫瘤相關(guān)抗原在胃癌患者中可升高，但其敏感性和特異性均不高。同時(shí)大部分胃癌患者早期可無明顯的臨床癥狀，這些都對胃癌的早期診斷造成了一定的困難；因此，尋找胃癌的有效標(biāo)志物，準(zhǔn)確判斷該疾患的的臨床分期和預(yù)后成為本領(lǐng)域研究者的關(guān)注熱點(diǎn)。

核仁素是一種多功能的非核糖體蛋白質(zhì)，其主要分布在細(xì)胞核內(nèi)，也有少量分布在核漿、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上。它參與多個(gè)方面的DNA代謝，也廣泛地參與RNA的調(diào)控過程，如轉(zhuǎn)錄、核糖體裝配、mRNA的翻譯及其穩(wěn)定性的保持和microRNA的加工等。核仁素通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄后靶mRNAs，促進(jìn)細(xì)胞增殖和抗細(xì)胞凋亡，從而在細(xì)胞層面影響疾病的進(jìn)展。特別是在腫瘤和病毒感染中，核仁素通過調(diào)控RNA的功能，密切地參與疾病的病理進(jìn)展過程。

有研究報(bào)道，在細(xì)胞質(zhì)中，核仁素與Bcl-2 mRNA、AKT1 mRNA、CCNI mRNA結(jié)合，增強(qiáng)其穩(wěn)定性，從而增加Bcl-2、AKT1和cyclin I的表達(dá)量，起到抗凋亡和促進(jìn)腫瘤發(fā)生的作用；其可以與TP53 mRNA的非編碼區(qū)5’端結(jié)合，抑制其翻譯，從而減少腫瘤抑制因子P53的表達(dá)。

有研究公開了胃泌素，作為一種在胃腸道惡性腫瘤中高表達(dá)的蛋白，也受到核仁素的調(diào)控，核仁素通過與胃泌素mRNA結(jié)合，增強(qiáng)其穩(wěn)定性，增加胃泌素的表達(dá)量，研究顯示，在癌細(xì)胞中，胃泌素能上調(diào)COX-2的表達(dá)量，增加前列腺素E2的表達(dá)量，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖；核仁素還能與MMP9 mRNA非編碼區(qū)3’端結(jié)合，增強(qiáng)其穩(wěn)定性，增加其翻譯為基質(zhì)金屬蛋白酶的功能；基質(zhì)金屬蛋白酶能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，其在傷口的愈合與血管的生存過程中必不可少，在腫瘤的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展的病理生理過程中起到極為重要的作用；另外，核仁素還能通過調(diào)控促腫瘤生成的miRNA起到促腫瘤發(fā)生的作用，如miR-15a和miR-16等。

還有研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤組織細(xì)胞膜表面存在核仁素的高表達(dá)，通過介導(dǎo)鈣調(diào)節(jié)通路，脂多糖表達(dá)，P選擇素誘導(dǎo)通路等調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展；細(xì)胞膜表面的核仁素可以作為致癌物Tipa的受體，與之結(jié)合后將致癌物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)起到致癌作用。

基于現(xiàn)有技術(shù)的研究現(xiàn)狀，本發(fā)明的申請人擬通過研究、檢測在胃癌患者體內(nèi)核仁素可能存在表達(dá)的異常為胃癌的早期診斷和預(yù)警提供新輔助判斷手段，尤其提供核仁素在制備胃癌診斷試劑及試劑盒和治療藥物中的用途。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中缺乏有效的胃癌診斷血清學(xué)指標(biāo)的現(xiàn)狀，提供核仁素在制備胃癌診斷試劑及試劑盒和治療藥物中的用途。尤其是以核仁素為靶標(biāo)的胃癌診斷試劑及試劑盒和治療藥物。

本發(fā)明通過檢測在胃癌患者體內(nèi)核仁素存在表達(dá)的異常，核仁素作為胃癌診斷的血清學(xué)標(biāo)志物指標(biāo)，為胃癌的早期診斷和預(yù)警提供新的輔助判斷手段。

進(jìn)一步，提供核仁素在制備胃癌診斷試劑及試劑盒中的用途。

更進(jìn)一步，提供以核仁素為靶標(biāo)的治療胃癌的藥物。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明對胃癌患者及正常對照的血漿樣本進(jìn)行核仁素的ELISA檢測：其中包括：

1，試劑：ELISA試劑盒購于Uscn Life Science公司；

2，病人及樣本：

1)隨機(jī)選取確診為胃癌的患者的術(shù)前血標(biāo)本，以健康體檢患者血作為對照；

2)采用雙抗體ELISA法定量測定人血漿中核仁素含量，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行相應(yīng)操作：

3)各標(biāo)準(zhǔn)品及樣本O.D.值扣除空白孔O.D.值后作圖(七點(diǎn)圖)，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)(或?qū)?shù)坐標(biāo))，O.D.值為橫坐標(biāo)(或?qū)?shù)坐標(biāo))，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，本發(fā)明的實(shí)施例中優(yōu)選按回歸方程計(jì)算的R2值，以R2值越趨近于1為佳，根據(jù)樣品O.D.值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與O.D.值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的O.D.值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，得樣品的實(shí)際濃度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：胃癌病人血漿中核仁素水平顯著高于正常對照，P＝0.003(如圖1所示，n＝28)；表明所述的核仁素在胃癌中高表達(dá)并分泌到血液中，因此，核仁素可作為胃癌診斷的無創(chuàng)標(biāo)志物。

本發(fā)明通過檢測在胃癌患者體內(nèi)核仁素存在表達(dá)的異常，表明所述的核仁素可作為胃癌診斷的血清學(xué)標(biāo)志物指標(biāo)，為胃癌的早期診斷和預(yù)警提供新的輔助判斷手段。

本發(fā)明所述的核仁素可用于制備早期診斷和預(yù)警胃癌的試劑及試劑盒。

本發(fā)明所述的試劑盒中包括針對核仁素蛋白的抗體；所述的檢測試劑盒含有核仁素標(biāo)準(zhǔn)品。

進(jìn)一步，本發(fā)明所述的核仁素還可用于制備治療胃癌的藥物的靶標(biāo)。

另一方面，本發(fā)明還提供了一種胃癌標(biāo)志物核仁素的檢測方法，其包括步驟：

(1)分離提取樣本中的基因組DNA或者蛋白；

和/或

(2)檢測(1)所得的基因組DNA或者蛋白中核仁素的表達(dá)水平。

本發(fā)明通過檢測在胃癌患者體內(nèi)核仁素表達(dá)的異常，胃癌病人血漿中核仁素水平顯著高于正常對照，提供了核仁素作為胃癌診斷的血清學(xué)標(biāo)志物指標(biāo)。

說明書附圖

圖1是胃癌病人與正常對照的血漿中核仁素水平表達(dá)，其中顯示了胃癌病人血漿中核仁素水平表達(dá)顯著高于正常對照。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1對胃癌患者及正常對照的血漿樣本進(jìn)行核仁素的ELISA檢測

試劑：ELISA試劑盒購于Uscn Life Science公司。

雙抗體ELISA法定量測定人血漿中核仁素含量：

根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行相應(yīng)操作；

病人及樣本：

隨機(jī)選取2012年12月-2014年12月新確診為胃癌的28例患者的術(shù)前血標(biāo)本，同時(shí)選取28例健康體檢患者血作為對照。所有血標(biāo)本收集方案均經(jīng)過華山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1，標(biāo)本采集與保持

將病人血液標(biāo)本1000×g離心20分鐘，取上清(血漿)置于-20℃或-80℃保存；

2、操作步驟：

1)實(shí)驗(yàn)前標(biāo)準(zhǔn)品、試劑及樣本準(zhǔn)備；

2)加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔、空白孔；設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔7孔，依次加入100μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，空白孔加100μL，余孔加待測樣品100μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃溫育2小時(shí)；

3)棄去液體，甩干，不洗滌；

4)每孔加檢測溶液A工作液100μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃溫育1小時(shí)；

5)棄去孔內(nèi)液體，每孔用350μL的洗滌液洗滌，浸泡1-2分鐘，吸去或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，鋪墊紙吸或拍動(dòng)將孔內(nèi)液體拍干，重復(fù)洗板3次；最后一次，洗滌后，將孔內(nèi)的洗滌液完全甩干；

6)每孔加檢測溶液B工作液100μL，加上覆膜，37℃溫育30分鐘；

7)棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟4；

8)每孔加底物溶液90μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃避光顯色，反應(yīng)時(shí)間控制在15-25分鐘，不要超過30分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯時(shí)，即可終止；

9)每孔加終止溶液50μL，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色；終止液的加入順序應(yīng)與底物溶液的加入順序相同，如出現(xiàn)顏色不勻一，晃動(dòng)酶標(biāo)板以使溶液混合均 勻；

10)酶標(biāo)板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，用酶標(biāo)儀在450nm波長測量各孔的光密度(O.D.值)。

3、計(jì)算

各標(biāo)準(zhǔn)品及樣本O.D.值扣除空白孔O.D.值后作圖(七點(diǎn)圖)，如設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取其平均值計(jì)算；以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)(或?qū)?shù)坐標(biāo))，O.D.值為橫坐標(biāo)(或?qū)?shù)坐標(biāo))，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，本實(shí)施例中，依回歸方程計(jì)算的R2值確定，以R2值越趨近于1為佳；使用專業(yè)制作曲線軟件(curve expert 1.30)進(jìn)行分析，根據(jù)樣品O.D.值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與O.D.值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的O.D.值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在腸癌病人血漿中核仁素水平顯著高于正常對照，P＝0.003(如圖1所示，n＝28)，表明核仁素在腸癌中高表達(dá)并分泌到血液中，因此，所述的核仁素可作為腸癌診斷的無創(chuàng)標(biāo)志物。