一種用于篩選和評價艾滋病治療藥物的毒株試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種用于篩選和評價艾滋病治療藥物的毒株試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 人免疫缺陷病毒（Humanimmunodeficiencyvirus,HIV)是引起人類獲得性免疫 缺陷綜合征（Acquiredimmunodeficiencysyn化ome，AID巧的病原體。自1981年美國首 次診斷出艾滋病W來，艾滋病在全球范圍內(nèi)迅速傳播。2014年7月UNAIDS的最新報告顯 示，全球HIV感染人數(shù)已達(dá)3500萬，2013年，中國新診斷HIV感染者63498例，估計中國目 前有存活的HIV感染者78萬人。
[0003]HIV-1蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶，由兩個長度均為99個氨基酸的同質(zhì)二聚體組 成。HIV-1蛋白酶主要作用于病毒翻譯之后，對gag和gag-pol蛋白多聚體進(jìn)行剪切，產(chǎn)生 結(jié)構(gòu)蛋白和一些酶類物質(zhì)。蛋白酶的疏水性底物結(jié)合位點可W識別并裂解9種不同的多 膚，從而形成成熟的衣殼、病毒顆粒W及來源于gag蛋白多聚體的p6蛋白和來源于gag-pol 蛋白多聚體的蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶。像其他天冬氨酸蛋白酶一樣，HIV-1蛋白酶活性 位點含有保守的S個氨基酸組成的S聯(lián)體（Asp-T虹-Gly，第25至27位氨基酸）。一旦底 物與第46至56位氨基酸殘基結(jié)合，蛋白酶活性位點上方的柔性發(fā)卡結(jié)構(gòu)（flaps)就呈閉 合狀態(tài)。
[0004] 在HIV-1的整個生命周期中，病毒前體蛋白的裂解是感染性病毒顆粒包裝成熟的 關(guān)鍵一步。蛋白酶抑制劑阻斷蛋白酶所介導(dǎo)的病毒顆粒的成熟過程，祀點是野生蛋白酶。蛋 白酶抑制劑是截至目前最有潛力的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒抑制劑，也是唯一一類單一藥物治療效果 也優(yōu)于聯(lián)合治療效果的抗HIV-1藥物。
[0005] 目前共有9種蛋白酶抑制劑通過美國食品藥品監(jiān)督管理局（Foodand化ug a血inistration，抑A)批準(zhǔn)；沙奎那韋（saquinavir,SQV)、巧地那韋（indinavir, IDV)、利托那韋（ritonavir,RTV)、奈非那韋（nelfinavirmes}date，NFV)、福司安普那 (FosamprenavirCalcium,F0S-APV)、安扎那韋（atazanavirsulfate,ATV)、替派那韋 (tipranavir，TPV)、達(dá)如那韋（darunavir，DRV)和克立芝（lopinavir/ritonavir，LPV/ RTV)。
[0006] 目前納入我國抗HIV免費治療名錄的藥物約有9種（克力芝是唯一一種免費蛋白 酶抑制劑），其中大多為專利過期的仿制藥物，品種少，且毒副作用大，無法滿足臨床需求。 因此，立足自主創(chuàng)新，研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的治療艾滋病等重大疾病的原創(chuàng)性藥物，為國 民提供安全有效和廉價的藥物，成為了重中之重。鑒于W上提到的蛋白酶抑制劑的特點，國 內(nèi)蛋白酶抑制劑的研發(fā)也成為國內(nèi)眾多生物制藥公司的熱點。新藥研發(fā)是個漫長的過程， 而臨床前藥效學(xué)研究是新藥研發(fā)的基礎(chǔ)，也是判斷候選藥物是否具有研發(fā)前景W及確定下 一步研究方向的重要依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種用于篩選和評價艾滋病治療藥物的毒株試劑盒。
[0008] 本發(fā)明提供了一種試劑盒，包括如下7個重組HIV病毒；HIV-M46I病毒株、 HIV-I54V病毒株、HIV-V82A病毒株、HIV-M46I/N88S病毒株、HIV-G48V/I54V病毒株、 HIV-M46I/V82T/I84V病毒株和HIV-G48V/I54V/V82A病毒株；
[0009]HIV-M46I病毒株，是將野生型HIV病毒的基因組中編碼蛋白酶自N末端第46位氨 基酸殘基的密碼子由甲硫氨酸的密碼子突變?yōu)楫惲涟彼岬拿艽a子，得到的重組HIV病毒；
[0010]HIV-I54V病毒株，是將野生型HIV病毒的基因組中編碼蛋白酶自N末端第54位氨 基酸殘基的密碼子由異亮氨酸的密碼子突變?yōu)猷l(xiāng)氨酸的密碼子，得到的重組HIV病毒；
[0011]HIV-V82A病毒株，是將野生型HIV病毒的基因組中編碼蛋白酶自N末端第82位氨 基酸殘基的密碼子由鄉(xiāng)氨酸的密碼子突變?yōu)楸彼岬拿艽a子，得到的重組HIV病毒；
[0012] HIV-M46I/N88S病毒株，是將野生型HIV病毒的基因組中編碼蛋白酶自N末端第 46位氨基酸殘基的密碼子由甲硫氨酸的密碼子突變?yōu)楫惲涟彼岬拿艽a子、第88位氨基酸 殘基的密碼子由天冬酷胺的密碼子突變?yōu)榻z氨酸的密碼子，得到的重組HIV病毒；
[0013]HIV-G48V/I54V病毒株，是將野生型HIV病毒的基因組中編碼蛋白酶自N末端第 48位氨基酸殘基的密碼子由甘氨酸的密碼子突變?yōu)猷l(xiāng)氨酸的密碼子、第54位氨基酸殘基 的密碼子由異亮氨酸的密碼子突變?yōu)猷l(xiāng)氨酸的密碼子，得到的重組HIV病毒；
[0014] HIV-M46I/V82T/I84V病毒株，是將野生型HIV病毒的基因組中編碼蛋白酶自N末 端第46位氨基酸殘基的密碼子由甲硫氨酸的密碼子突變?yōu)楫惲涟彼岬拿艽a子、第82位氨 基酸殘基的密碼子由鄉(xiāng)氨酸的密碼子突變?yōu)樘K氨酸的密碼子、第84位氨基酸殘基的密碼 子由異亮氨酸的密碼子突變?yōu)猷l(xiāng)氨酸的密碼子，得到的重組HIV病毒；
[0015] HIV-G48V/I54V/V82A病毒株，是將野生型HIV病毒的基因組中編碼蛋白酶自N末 端第48位氨基酸殘基的密碼子由甘氨酸的密碼子突變?yōu)猷l(xiāng)氨酸的密碼子、第54位氨基酸 殘基的密碼子由異亮氨酸的密碼子突變?yōu)猷l(xiāng)氨酸的密碼子、第82位氨基酸殘基的密碼子 由鄉(xiāng)氨酸的密碼子突變?yōu)楸彼岬拿艽a子，得到的重組HIV病毒。
[0016] 所述野生型HIV病毒為HIV-1B亞型抑L4. 3野生株。所述HIV-1B亞型抑L4. 3野 生株的基因組DNA如序列表的序列1所示。
[0017] 所述HIV-M46I病毒株是將重組質(zhì)粒M46I導(dǎo)入離體的哺乳動物細(xì)胞并培養(yǎng)哺乳動 物細(xì)胞得到的；所述重組質(zhì)粒M46I為將如下DNA分子插入表達(dá)載體的多克隆位點得到的重 組質(zhì)粒：將野生型HIV病毒的基因組中編碼蛋白酶自N末端第46位氨基酸殘基的密碼子由 甲硫氨酸的密碼子突變?yōu)楫惲涟彼岬拿艽a子。所述重組質(zhì)粒M46I具體可為實施例中的重 組質(zhì)粒抑L4. 3-M46I。
[0018] 所述HIV-I54V病毒株是將重組質(zhì)粒I54V導(dǎo)入離體的哺乳動物細(xì)胞并培養(yǎng)哺乳動 物細(xì)胞得到的；所述重組質(zhì)粒I54V為將如下DNA分子插入表達(dá)載體的多克隆位點得到的重 組質(zhì)粒：將野生型HIV病毒的基因組中編碼蛋白酶自N末端第54位氨基酸殘基的密碼子由 異亮氨酸的密碼子突變?yōu)猷l(xiāng)氨酸的密碼子。所述重組質(zhì)粒I54V具體可為實施例中的重組 質(zhì)粒抑L4. 3-I54V。
[0019] 所述HIV-V82A病毒株是將重組質(zhì)粒V82A導(dǎo)入離體的哺乳動物細(xì)胞并培養(yǎng)哺乳動 物細(xì)胞得到的；所述重組質(zhì)粒V82A為將如下DNA分子插入表達(dá)載體的多克隆位點得到的重 組質(zhì)粒：將野生型HIV病毒的基因組中編碼蛋白酶自N末端第82位氨基酸殘基的密碼子由 鄉(xiāng)氨酸的密碼子突變?yōu)楸彼岬拿艽a子。所述重組質(zhì)粒V82A具體可為實施例中的重組質(zhì) 粒抑L4. 3-V82A。
[0020] 所述HIV-M46I/N88S病毒株是將重組質(zhì)粒M46I/N88S導(dǎo)入離體的哺乳動物細(xì)胞并 培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞得到的；所述重組質(zhì)粒M46I/N88S為將如下DNA分子插入表達(dá)載體的多 克隆位點得到的重組質(zhì)粒；將野生型HIV病毒的基因組中編碼蛋白酶自N末端第46位氨基 酸殘基的密碼子由甲硫氨酸的密碼子突變?yōu)楫惲涟彼岬拿艽a子、第88位氨基酸殘基的密 碼子由天冬酷胺的密碼子突變?yōu)榻z氨酸的密碼子。所述重組質(zhì)粒M46I/N88S具體可為實施 例中的重組質(zhì)粒抑L4. 3-M46I/N88S。
[0021] 所述HIV-G48V/I54V病毒株是將重組質(zhì)粒G48VI54V導(dǎo)入離體的哺乳動物細(xì)胞并 培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞得到的；所述重組質(zhì)粒G48V/I54V為將如下DNA分子插入表達(dá)載體的多 克隆位點得到的重組質(zhì)粒；將野生型HIV病毒的基因組中編碼蛋白酶自N末端第48位氨基 酸殘基的密碼子由甘氨酸的密碼子突變?yōu)猷l(xiāng)氨酸的密碼子、第54位氨基酸殘基的密碼子 由異亮氨酸的密碼子突變?yōu)猷l(xiāng)氨酸的密碼子。所述重組質(zhì)粒G48V/I54V具體可為實施例中 的重組質(zhì)粒抑L4. 3-G48V/I54V。
[0022] 所述HIV-M46I/V82T/I84V病毒株是將重組質(zhì)粒M46I/V82T/I84V導(dǎo)入離體的哺乳 動物細(xì)胞并培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞得到的；所述重組質(zhì)粒M46I/V82T/I84V為將如下DNA分子插 入表達(dá)載體的多克隆位點得到的重組質(zhì)粒：將野生型HIV病毒的基因組中編碼蛋白酶自N 末端第46位氨基酸殘基的密碼子由甲硫氨酸的密碼子突變?yōu)楫惲涟彼岬拿艽a子、第82位 氨基酸殘基的密碼子由鄉(xiāng)氨酸的密碼子突變?yōu)樘K氨酸的密碼子、第84位氨基酸殘基的密 碼子由異亮氨酸的密碼子突變?yōu)猷l(xiāng)氨酸的密碼子。所述重組質(zhì)粒M46I/V82T/I84V具體可 為實施例中的重組質(zhì)粒抑L4. 3-M46I/V82T/I84V。
[0023] 所述HI