一種液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對煙草中類黃酮物質(zhì)進(jìn)行分離鑒定的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對煙草中類黃酮物質(zhì)進(jìn)行分離鑒定的方法。將樣本研磨，干燥，按0.1ml/mg樣本的量加提取劑提取，離心，收集上清液，按0.5ml/ml、1ml/ml上清液的量加入水和氯仿離心，取上清液進(jìn)行分析。以153+、151-為特征離子進(jìn)行掃描，對結(jié)果提取母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，得到的譜圖與譜庫對比確定化學(xué)結(jié)構(gòu)再與標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行驗證。以上述已鑒定物質(zhì)及楊梅素、二氫楊梅素、兒茶素/表兒茶素、黃豆苷元、黃豆黃素及甘草素/異甘草素的分子離子作為特征離子進(jìn)行掃描，將搜尋到的疑似糖基化類黃酮物質(zhì)的分子離子作為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，得到譜圖與譜庫對比確定化學(xué)結(jié)構(gòu)再與標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行驗證。所述方法靈敏準(zhǔn)確適用于微量甚至痕量類黃酮物質(zhì)的分析檢測。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物提取物分離鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對 煙草中類黃酮物質(zhì)進(jìn)行分離鑒定的方法。 一種液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對煙草中類黃酮物質(zhì)進(jìn)行分離鑒 定的方法

【背景技術(shù)】
[0002] 類黃酮物質(zhì)，又稱黃酮類化合物，是指基本母核為2-苯基色原酮類化合物，泛指 兩個具有酚羥基的苯環(huán)通過中央三碳原子相互連接的一系列化合物。類黃酮物質(zhì)是植物重 要的次生代謝物，其對植物本身和人類都有重要作用。在植物抗逆方面，類黃酮物質(zhì)在植物 的抗蟲、抗病毒、抗菌等方面均表現(xiàn)出顯著的作用。在對人類健康的影響方面，已有大量報 道表明類黃酮物質(zhì)具有抗癌、抗衰老以及抗病毒等方面的作用。因此，分離和鑒定植物中的 類黃酮物質(zhì)對于闡明類黃酮物質(zhì)對植物和人類健康的作用機理具有重要的意義。雖然人們 已經(jīng)從植物中分離鑒定了部分類黃酮物質(zhì)，但仍有大量未知的類黃酮物質(zhì)等待我們鑒定。 建立一種簡單、快速、靈敏度高的分離鑒定方法，對于植物中微量甚至痕量類黃酮物質(zhì)的發(fā) 現(xiàn)具有重要的意義。
[0003] 植物中類黃酮物質(zhì)的經(jīng)典分離提取方法包括溶劑萃取、柱色譜、紙色譜等。結(jié)構(gòu)鑒 定則基于類黃酮物質(zhì)特殊的3環(huán)結(jié)構(gòu)，采用紫外光譜、質(zhì)譜、核磁共振等方法進(jìn)行單獨或聯(lián) 合鑒定。隨著色譜和質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，液相色譜-紫外光譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)成為類黃酮物質(zhì) 結(jié)構(gòu)鑒定的主要方法。這種方法通常利用液相色譜對類黃酮物質(zhì)進(jìn)行分類，利用特征紫外 吸收區(qū)分類黃酮物質(zhì)和其它化合物，最后利用質(zhì)譜對發(fā)現(xiàn)的類黃酮物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。但 是，由于紫外檢測器靈敏度有限，只能用于含量較高的類黃酮物質(zhì)的分析檢測，而很多微量 甚至痕量類黃酮物質(zhì)無法通過紫外檢測器被發(fā)現(xiàn)。因此，研發(fā)出一種高靈敏度且對類黃酮 化合物具有特異性的分離鑒定方法將具有非常重要的現(xiàn)實意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對煙草中類黃酮物質(zhì)進(jìn)行分離 鑒定的方法。
[0005] 本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的，所述液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對煙草中類黃酮物質(zhì)進(jìn)行 分離鑒定的方法，包括制樣、儀器分析及分離鑒定工序，具體包括： A、制樣：將采集的煙草植物組織研磨粉碎，冷凍干燥，稱取已干燥樣本，按0. lml/mg樣 本的用量加入提取劑，超聲提取，離心，收集上層清液，按〇. 5ml/ml上層清液的用量加入 水，按lml/ml上層清液的用量加入氯仿進(jìn)行渦旋混勻，離心，再取上層清液作為色譜分析 樣本。
[0006] B、儀器分析：液相色譜分析條件：Waters BEH C18 (15cmX 2· 1_X 1. 7 μ m)色 譜柱；流動相A為水，流動相B為乙腈，兩相均添加0. 1%的甲酸和0. 2 mmol/L的醋酸銨； 流動相梯度洗脫程序如下：〇?lmin，10%B ; 1 ?9min，10%B - 90%B ;9?1 lmin，90%B - 100%B ; 11?11. lmin，100%B -10%Β ;11· 1?13min，10%B ;柱溫30°C，進(jìn)樣量2 μ 1，流速0· 25 mL/min。
[0007] 質(zhì)譜分析條件：離子源為電噴霧離子源；在做母離子掃描時正負(fù)離子同時掃描， 結(jié)果相互驗證；電噴霧電壓±4000 V;簾氣壓力40 psi;離子源溫度700 °C;輔助氣1，60 psi ;輔助氣2,50 psi ;去簇電壓-100 V。
[0008] C、結(jié)構(gòu)鑒定：游離態(tài)類黃酮物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定：以153+、15Γ為特征離子進(jìn)行母離子 全掃描，掃描電壓30v，掃描范圍250~320,搜尋未被糖基取代的游離態(tài)類黃酮；對負(fù)離子模 式下的掃描結(jié)果進(jìn)行離子提取，在正離子模式下在相應(yīng)的保留時間下也能找到對應(yīng)的加氫 離子，選取這些離子作為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，掃描電壓30v，將得到的二級質(zhì)譜與譜 庫對比，確定類黃酮物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，再與標(biāo)準(zhǔn)化合物進(jìn)行保留時間和二級質(zhì)譜驗證。
[0009] 糖基化類黃酮物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定：根據(jù)游離態(tài)類黃酮物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果，以這些 已鑒定物質(zhì)的分子離子為特征離子進(jìn)行母離子掃描，同時將楊梅素、二氫楊梅素、兒茶素/ 表兒茶素、黃豆苷元、黃豆黃素及甘草素/異甘草素的分子離子也作為特征離子進(jìn)行母離 子掃描，掃描電壓30v，掃描范圍25(Γ1500 ;在掃描結(jié)果中搜尋可能的糖基化類黃酮物質(zhì)， 選取這些糖基化類黃酮的分子離子作為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，掃描電壓30ν，將得到的 二級質(zhì)譜與譜庫對比，確定類黃酮物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，再與標(biāo)準(zhǔn)化合物進(jìn)行保留時間和二級 質(zhì)譜驗證。
[0010] 本發(fā)明所述的分離鑒定方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，特別適用于微量甚至痕量類黃 酮物質(zhì)的分析檢測，而且樣品制備簡單快速，有效提高了檢測效率，具有較高的推廣應(yīng)用價 值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1為煙草中主要類黃酮物質(zhì)母核的基本結(jié)構(gòu)； 圖2為煙草游離態(tài)類黃酮物質(zhì)153+、15Γ母離子全掃描色譜圖，掃描范圍25(Γ320 ; 圖3為實際樣品與標(biāo)準(zhǔn)譜庫中異鼠李素的二級質(zhì)譜對比圖（黑點標(biāo)記處為譜圖重合 處）； 圖4為煙草樣品以315_為特征離子的母離子全掃描色譜圖； 圖5為實際樣品與標(biāo)準(zhǔn)譜庫中異鼠李素-3-0-蕓香糖的二級質(zhì)譜對比圖（黑點標(biāo)記處 為譜圖重合處）； 圖6為煙草樣品以30Γ為特征離子的母離子全掃描色譜圖； 圖7為實際樣品與標(biāo)準(zhǔn)譜庫中異槲皮素-3-0-蕓香糖的二級質(zhì)譜對比圖（黑點標(biāo)記處 為譜圖重合處)。

【具體實施方式】
[0012] 下面對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明 教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0013] 本發(fā)明所述的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對煙草中類黃酮物質(zhì)進(jìn)行分離鑒定的方法，其 特征在于包括制樣、儀器分析及分離鑒定工序，具體包括： 所述的制樣是將采集的煙草植物組織研磨粉碎，冷凍干燥，稱取已干燥樣本，按0. lml/ mg樣本的用量加入提取劑，超聲提取，離心，收集上層清液，按0. 5ml/ml上層清液的用量加 入水，按lml/ml上層清液的用量加入氯仿進(jìn)行渦旋混勻，離心，再取上層清液作為色譜分 析樣本。
[0014] 所述的儀器分析包括液相色譜分析與質(zhì)譜分析，所采用的液相色譜分析條件為： Waters BEH C18(15cmX2. lmmX1.7ym)色譜柱；流動相A為水，流動相B為乙腈，兩相均添 加0. 1%的甲酸和0. 2 mmol/L的醋酸銨；流動相梯度洗脫程序如下：(Tlmin，10%B ;l~9min， 10%B-90%B ;9?llmin，90%B-100%B ;11?11. lmin，100%Β-10%Β ;11· 1?13min，10%B ;柱溫 30°C，進(jìn)樣量 2 μ?，流速 0.25mL/min。
[0015] 所采用的質(zhì)譜分析條件為：離子源為電噴霧離子源；在做母離子掃描時正負(fù)離子 同時掃描，結(jié)果相互驗證；電噴霧電壓±4000 V ;簾氣壓力40 psi ;離子源溫度700 °C ;輔 助氣1，60 psi ;輔助氣2,50 psi ;去簇電壓-100 V。
[0016] 所述的結(jié)構(gòu)鑒定包括游離態(tài)類黃酮物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定與糖基化類黃酮物質(zhì)的結(jié)構(gòu) 鑒定。根據(jù)類黃酮物質(zhì)的概念和煙草中已鑒定出的類黃酮物質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征可知，類黃酮物 質(zhì)大多具有圖1所示的結(jié)構(gòu)。
[0017] 山奈酚 Kaempferol R1=H，R2=H，R3=0H 分子量 MW=286 槲皮素 Quercetin R1=0H，R2=H，R3=0H 分子量 MW=302 楊梅素 Myricetin R1=0H，R2=0H，R3=0H 分子量 MW=318 異鼠李素 Isorhamnetin Rl=0Me，R2=H，R3=0H 分子量 MW=316 這種結(jié)構(gòu)使得這些物質(zhì)在質(zhì)譜分析碎片斷裂時會產(chǎn)生153+ (15Γ)的特征離子。
[0018] 所述的游離態(tài)類黃酮物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定是以153+、15Γ為特征離子進(jìn)行母離子全掃 描，掃描電壓30v，掃描范圍250~320,搜尋未被糖基取代的游離態(tài)類黃酮。對負(fù)離子模式 下的掃描結(jié)果進(jìn)行離子提取，在正離子模式下在相應(yīng)的保留時間下也能找到對應(yīng)的加氫離 子，選取這些離子作為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，掃描電壓30v，將得到的二級質(zhì)譜與譜庫 對比，確定類黃酮物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，再與標(biāo)準(zhǔn)化合物進(jìn)行保留時間和二級質(zhì)譜驗證。
[0019] 所述的糖基化類黃酮物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定是根據(jù)游離態(tài)類黃酮物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果， 以這些已鑒定物質(zhì)的分子離子為特征離子進(jìn)行母離子掃描，同時考慮到部分糖基化類黃酮 物質(zhì)可能不存在游離態(tài)的形式，將楊梅素(分子量MW=318)、二氫楊梅素(分子量MW=320)、 兒茶素/表兒茶素(分子量MW=290)、黃?苷兀(分子量MW=254)、黃?黃素(分子量MW=284) 及甘草素/異甘草素(分子量MW=256)等常見的類黃酮苷元的分子離子也作為特征離子進(jìn) 行母離子掃描，掃描電壓30v，掃描范圍250~1500。在掃描結(jié)果中搜尋可能的糖基化類黃酮 物質(zhì)，選取這些糖基化類黃酮的分子離子作為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，掃描電壓30ν，將 得到的二級質(zhì)譜與譜庫對比，確定類黃酮物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，再與標(biāo)準(zhǔn)化合物進(jìn)行保留時間 和二級質(zhì)譜驗證。
[0020] 工序Α所述的制樣，所采用的煙草植物組織優(yōu)選煙株成熟中部葉和/或花瓣。
[0021] 工序A所述的制樣，將煙草植物組織研磨粉碎指的是將煙草植物組織放入研磨 器，加液氮冷凍，再進(jìn)行研磨粉碎。
[0022] 工序A所述的制樣，冷凍干燥后的樣本可置于_80°C進(jìn)行保存。
[0023] 工序A所述的制樣，將已干燥樣本加入提取劑進(jìn)行超聲提取和離心，所采用的提 取工藝參數(shù)為超聲頻率20 KHz，超聲時間30 min，溫度控制在25攝氏度。超聲完以10000 rpm 離心 10 min。
[0024] 工序A所述的制樣，將上層清液加入水和氯仿進(jìn)行渦旋混勻，離心，所采用的工藝 參數(shù)為10000 rpm離心10 min。
[0025] 工序A所述的制樣所采用的提取劑為7(Γ85%的醇系水溶液。
[0026] 工序Α所述的制樣所采用的提取劑為75%的甲醇水溶液。
[0027] 工序C所述的結(jié)構(gòu)鑒定中游離態(tài)類黃酮物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定在負(fù)離子模式下，在保留 時間4·90±0·02 min、5.39±0.02 min、5.83±0.02 min、6.38±0.02 min、6.48±0.02 min 處有明顯的色譜峰，在保留時間5. 77 min、6. 29 min、6. 42 min存在較弱的色譜峰，如圖2 所示。
[0028] 工序C所述的結(jié)構(gòu)鑒定中對負(fù)離子模式下的掃描結(jié)果進(jìn)行離子提取，在保留時 間 4·90±0·02 min、5.39±0.02 min、5.77±0.02 min、5.83±0.02 min、6.29±0.02 min、 6·38±0·02 min、6.42±0.02 min、6.48±0.02 min 處的母離子分別為 303'287'285' 301_、269'27Γ、285'315_。
[0029] 工序C所述的結(jié)構(gòu)鑒定中糖基化類黃酮物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定的掃描結(jié)果顯示，在以槲 皮素、山奈酚/木犀草素、異鼠李素、柚皮素、二氫槲皮素及二氫山奈酚的分子離子為特征 離子的母離子全掃描中搜尋到可能的糖基化類黃酮。
[0030] 工序C所述的將得到的二級質(zhì)譜與譜庫對比，確定類黃酮物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)是將得 到的二級質(zhì)譜上傳到mass bank網(wǎng)站（WWW. massbank. jp)進(jìn)行譜庫比對，初步確定這些類 黃酮物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0031] 實施例1 --煙草中異鼠李素的分離與鑒定 (1)實驗試劑及裝置 乙腈(色譜級)、甲醇(色譜級)、乙醇(色譜級）購買于德國Merck公司。超純水由 皿:1111。(^6純化系統(tǒng)制備。其它標(biāo)準(zhǔn)樣品購買于3181]^-41(11'；[011，4]^3 46831'和百靈威公 司。Waters UPLC液相色譜儀(美國），AB SCIEX 5500三重四極桿質(zhì)譜儀(美國）。SB-50D 超聲波提取儀（寧波新芝生物科技股份有限公司），Waters BEH C18 (15 cmX2.1 mmX 1.7 μπι)反相色譜柱（Waters,美國），MILLI-Q純水機（MILLIP0RE公司），LD5-2A離心機(北京 京立離心機有限公司），渦旋混勻器(荷蘭Breda公司），CP2245分析天平(感量0. OOOlg，德 國 Sartorius 公司）。
[0032] (2)實驗材料 云煙97、紅花大金元、K326的成熟中部葉及花瓣，類黃酮物質(zhì)分離與鑒定所采用的煙 草植物組織是這三個品種煙草的成熟中部葉的等量混合物和花瓣的等量混合物，各5 g。
[0033] (3)實驗方法 將采集的新鮮煙草植物組織放入研缽，加液氮冷凍，并迅速研磨粉碎。磨碎后的樣本放 入-80°C的冰箱保存。稱取400 mg新鮮磨碎樣本，加入4ml 75%的甲醇水溶液，超聲頻率 20 KHZ，超聲時間30 min，溫度控制在25攝氏度。超聲完以10000 rpm離心10 min。收集 2ml上層清液，加入lml水和2ml氯仿進(jìn)行潤旋混勻30 s，以10000 rpm離心10 min,再取 上層清液作為色譜分析樣本，轉(zhuǎn)入色譜進(jìn)樣小瓶待分析。
[0034] 所采用的液相色譜分析條件為：Waters BEH C18 (15cmX 2. ImmX 1. 7 μ m)色譜柱； 流動相A為水，流動相B為乙腈，兩相均添加0. 1%的甲酸和0. 2 mmol/L的醋酸銨；流動相梯 度洗脫程序如下：〇?lmin，10%B ;1?9min，10%B - 90%B ;9?llmin，90%B - 100%B ;11?11. lmin， 100%Β-10%Β ;11· 1 ?13min，10%B ;柱溫 30°C，進(jìn)樣量 2 μ 1，流速 0· 25 mL/min。
[0035] 所采用的質(zhì)譜分析條件為：離子源為電噴霧離子源；在做母離子掃描時正負(fù)離子 同時掃描，結(jié)果相互驗證；電噴霧電壓±4000 V ;簾氣壓力40 psi ;離子源溫度700 °C ;輔 助氣1，60 psi ;輔助氣2,50 psi ;去簇電壓-100 V。
[0036] (4)實驗結(jié)果 在以15Γ為特征離子進(jìn)行母離子掃描時，在色譜保留時間為6. 48 min處有明顯的色 譜峰，其檢測到的母離子為31T。采集6. 48 min處31T離子的二級碎片離子，并將其提交 至mass bank網(wǎng)站（www. massbank. jp)進(jìn)行譜庫比對，如圖3所示（圖中黑點標(biāo)記處為譜圖 重合處)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與譜庫中異鼠李素的二級質(zhì)譜圖很相似，于是初步判斷其為異鼠李 素。購買異鼠李素的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)并與待鑒定化合物進(jìn)行保留時間和二級質(zhì)譜的比對，證實其 為異鼠李素。異鼠李素是一種煙草中以前未見報道的游離型類黃酮物質(zhì)。
[0037] 實施例2 --煙草中異鼠李素-3-0-蕓香糖苷的分離與鑒定 (1)實驗試劑及裝置 同實施例1。
[0038] (2)實驗材料 同實施例1。
[0039] (3)實驗方法 同實施例1。
[0040] (4)實驗結(jié)果 由于在煙草樣品中發(fā)現(xiàn)了異鼠李素，因此假設(shè)煙草中也存在異鼠李素的糖基結(jié)合態(tài)化 合物。以異鼠李素的分子離子（3150作為特征離子進(jìn)行母離子全掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)保留時間 為4. 55 min處有明顯的色譜峰（圖4)，其檢測到的母離子為623-。根據(jù)623-與315-之間 存在308的中性丟失，初步判斷該化合物為異鼠李素-蕓香糖苷。采集4. 55 min處623_離 子的二級碎片離子，并將其提交至mass bank網(wǎng)站（www. massbank. jp)進(jìn)行譜庫比對，結(jié)果 發(fā)現(xiàn)其與譜庫中異鼠李素-3-0-蕓香糖苷的二級質(zhì)譜圖很相似，如圖5所示（圖中黑點標(biāo)記 處為譜圖重合處)，于是判斷其為異鼠李素-3-0-蕓香糖苷。該化合物由于未獲得標(biāo)準(zhǔn)品， 因此未進(jìn)行標(biāo)樣驗證。異鼠李素-3-0-蕓香糖苷是一種煙草中以前未見報道的糖基化類黃 酮物質(zhì)。
[0041] 實施例3 --煙草中槲皮素-3-0蕓香糖苷的分離與鑒定 (1)實驗試劑及裝置 同實施例1。
[0042] (2)實驗材料 同實施例1。
[0043] (3)實驗方法 同實施例1。
[0044] (4)實驗結(jié)果 在以15Γ為特征離子進(jìn)行母離子掃描時，在色譜保留時間為5.80 min處有明顯的色 譜峰，其檢測到的母離子為30Γ。采集5. 80 min處30Γ離子的二級碎片離子，并將其提 交至mass bank網(wǎng)站（www. massbank. jp)進(jìn)行譜庫比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與譜庫中槲皮素的二 級質(zhì)譜圖很相似，購買槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)并與待鑒定化合物進(jìn)行保留時間和二級質(zhì)譜的比 對，證實其為槲皮素。以槲皮素的分子離子30Γ作為特征離子進(jìn)行母離子全掃描，結(jié)果發(fā) 現(xiàn)保留時間為4. 28 min處有明顯的色譜峰（圖6)，其檢測到的母離子為609'根據(jù)609^與 30Γ之間存在308的中性丟失，初步判斷該化合物為槲皮素-蕓香糖苷。采集4. 28 min處 60?Γ離子的二級碎片離子，并將其提交至mass bank網(wǎng)站（www. massbank. jp)進(jìn)行譜庫比 對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與譜庫中槲皮素-3-0-蕓香糖苷的二級質(zhì)譜圖很相似，如圖7所示（圖中黑 點標(biāo)記處為譜圖重合處)，于是初步判斷其為懈皮素 _3_0_蕓香糖苷。購買懈皮素-3-0-蕓 香糖苷的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)并與待鑒定化合物進(jìn)行保留時間和二級質(zhì)譜的比對，證實其為槲皮 素-3-0-蕓香糖苷。槲皮素-3-0-蕓香糖苷是一種煙草中重要的糖基化類黃酮物質(zhì)。
【權(quán)利要求】
1. 一種液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對煙草中類黃酮物質(zhì)進(jìn)行分離鑒定的方法，其特征在于包 括制樣、儀器分析及分離鑒定工序，具體包括： A、 制樣：將采集的煙草植物組織研磨粉碎，冷凍干燥，稱取已干燥樣本，按0. lml/mg樣 本的用量加入提取劑，超聲提取，離心，收集上層清液，按〇. 5ml/ml上層清液的用量加入 水，按lml/ml上層清液的用量加入氯仿進(jìn)行渦旋混勻，離心，再取上層清液作為色譜分析 樣本； B、 儀器分析：液相色譜分析條件：規(guī)格為15cmX2. lmmX1.7ym的Waters BEH C18 色譜柱；流動相A為水，流動相B為乙腈，兩相均添加0. 1%的甲酸和0. 2 mmol/L的醋酸 銨；流動相梯度洗脫程序如下：〇?lmin，10%B ;1 ?9min，10%B - 90%B ;9?llmin，90%B - 100%B ; 11?11. lmin，100%B -10%Β ;11· 1?13min，10%B ;柱溫30°C，進(jìn)樣量2 μ 1，流速0· 25 mL/min ; 質(zhì)譜分析條件：離子源為電噴霧離子源；在做母離子掃描時正負(fù)離子同時掃描，結(jié)果 相互驗證；電噴霧電壓±4000 V ;簾氣壓力40 psi ;離子源溫度700 °C;輔助氣1，60 psi ; 輔助氣2,50 psi ;去簇電壓-100 V ; C、 結(jié)構(gòu)鑒定：游離態(tài)類黃酮物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定：以153+、15Γ為特征離子進(jìn)行母離子全 掃描，掃描電壓30ν，掃描范圍250~320,搜尋未被糖基取代的游離態(tài)類黃酮；對負(fù)離子模式 下的掃描結(jié)果進(jìn)行離子提取，在正離子模式下在相應(yīng)的保留時間下也能找到對應(yīng)的加氫離 子，選取這些離子作為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，掃描電壓30ν，將得到的二級質(zhì)譜與譜庫 對比，確定類黃酮物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，再與標(biāo)準(zhǔn)化合物進(jìn)行保留時間和二級質(zhì)譜驗證； 糖基化類黃酮物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定：根據(jù)游離態(tài)類黃酮物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果，以這些已鑒 定物質(zhì)的分子離子為特征離子進(jìn)行母離子掃描，同時將楊梅素、二氫楊梅素、兒茶素/表兒 茶素、黃豆苷元、黃豆黃素及甘草素/異甘草素的分子離子也作為特征離子進(jìn)行母離子掃 描，掃描電壓30ν，掃描范圍250~1500 ;在掃描結(jié)果中搜尋可能的糖基化類黃酮物質(zhì)，選取 這些糖基化類黃酮的分子離子作為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，掃描電壓30ν，將得到的二級 質(zhì)譜與譜庫對比，確定類黃酮物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，再與標(biāo)準(zhǔn)化合物進(jìn)行保留時間和二級質(zhì)譜 驗證。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離鑒定方法，其特征在于工序Α所述的制樣，將煙草植物組 織研磨粉碎指的是將煙草植物組織放入研磨器，加液氮冷凍，再進(jìn)行研磨粉碎。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離鑒定方法，其特征在于工序A所述的制樣，冷凍干燥后的 樣本可置于-80°C進(jìn)行保存。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離鑒定方法，其特征在于工序A所述的制樣，將已干燥樣本 加入提取劑進(jìn)行超聲提取，離心，所采用的提取工藝參數(shù)為超聲頻率20 KHz，超聲時間30 min,溫度控制在25攝氏度，超聲完以10000 rpm離心10 min。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離鑒定方法，其特征在于工序A所述的制樣所采用的提取 劑為70?85%的醇系水溶液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的分離鑒定方法，其特征在于所述的制樣所采用的提取劑為 75%的甲醇水溶液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離鑒定方法，其特征在于工序C所述的結(jié)構(gòu)鑒定中游 離態(tài)類黃酮物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定在負(fù)離子模式下，在保留時間4. 90±0. 02 min、5. 39±0. 02 min、5. 83±0. 02 min、6. 38±0. 02 min、6. 48±0. 02 min 處有明顯的色譜峰，在保留時間 5. 77±0. 02 min、6. 29±0. 02 min、6. 42±0. 02 min 存在較弱的色譜峰。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離鑒定方法，其特征在于工序C所述的結(jié)構(gòu)鑒定中對 負(fù)離子模式下的掃描結(jié)果進(jìn)行離子提取，在保留時間4. 90±0. 02 min、5. 39±0. 02 min、 5. 77±0. 02 min、5. 83±0. 02 min、6. 29±0. 02 min、6. 38±0. 02 min、6. 42±0. 02 min、 6. 48±0. 02 min 處的母離子分別為 303'287'285'30Γ、269'27Γ、285'315'
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離鑒定方法，其特征在于工序C所述的結(jié)構(gòu)鑒定中糖基化 類黃酮物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定在以槲皮素、山奈酚/木犀草素、異鼠李素、柚皮素、二氫槲皮素及 二氫山奈酚的分子離子為特征離子的母離子全掃描中搜尋到可能的糖基化類黃酮。
【文檔編號】G01N30/88GK104101675SQ201410361980
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月28日
【發(fā)明者】逄濤, 李勇, 盧秀萍, 師君麗, 陳萍 申請人:云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院