液相色譜質譜聯(lián)用測定青風藤中生物堿方法以及索氏提取、微波法提取青風藤中生物堿方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種液相色譜質譜聯(lián)用測定青風藤中生物堿方法以及索氏提取、微波法提取青風藤中生物堿方法,液相色譜質譜聯(lián)用測定青風藤中生物堿的方法，它包括以下步驟:樣品溶液的制備；樣品的分析；質譜條件；其中所述的樣品溶液為對照品溶液、將青風藤進行索氏提取后所得到的溶液或者將青風藤進行微波提取后所得到的溶液；本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明的色譜條件能夠使各生物堿均得到很好的保留；本發(fā)明的液相色譜質譜聯(lián)用測定青風藤中生物堿的方法不僅為青風藤的分析提供了一種新的方法，而且為青風藤中藥品質的鑒定和應用提供參考；本發(fā)明的微波法提取青風藤中生物堿的方法，提取時間短、節(jié)約溶劑、提取高效。
【專利說明】
液相色譜質譜聯(lián)用測定青風藤中生物堿方法以及索氏提取、 微波法提取青風藤中生物堿方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種液相色譜質譜聯(lián)用測定青風藤中生物堿方法以及索氏提取、微波 法提取青風藤中生物堿方法。
【背景技術】
[0002] 中藥一直都是中華民族的瑰寶，而在中藥的質量控制、中藥對照品的制備、新的活 性物質發(fā)現(xiàn)等方面，液相色譜都發(fā)揮著重要的作用。中藥的成分復雜，一種中藥可能含有上 萬個化合物，因此對中藥的質量控制等工作也提出了巨大的挑戰(zhàn)。液相色譜-質譜聯(lián)用技術 (HPLC-MS)是以液相色譜作為分離手段，以質譜作為鑒定工具的一種新型的分離分析技術。 中藥中化學成分比較復雜，其中某些成分穩(wěn)定性比較差，因而采用常規(guī)的分離檢測技術難 度較大。在使用HPLC-MS聯(lián)用技術進行中藥化學成分的分析時，不僅可以得到目標物質的保 留時間、在線紫外光譜的信息，而且還可以同時得到分子量及特征結構碎片等豐富的信息， 因此在這種聯(lián)用技術在復雜的中藥分析、中藥質量控制、中藥代謝等方面已經(jīng)得到廣泛的 應用。
[0003] 混合樣品通過高效液相色譜自動進樣系統(tǒng)進樣，由于各物質在流動相中的分配系 數(shù)(K)值不同，在色譜柱中得到分離。從色譜儀中流出的組分依次經(jīng)過接口進入質譜儀的離 子源處并被離子化，然后離子在質量分析器中聚焦，根據(jù)各物質的核質比不同而分離，分離 后的離子信號被轉變?yōu)殡娦盘?，傳送至計算機數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，根據(jù)質譜峰的強度和位置對 實際樣品中的成分和結構進行分析。
[0004] 由于中藥的體系比較復雜，物質之間分配系數(shù)(K)相差可能會很大，在液相的分離 過程中需要通過連續(xù)改變流動相中溶劑的比例以改變流動相的極性，進而使各目標成分在 分離過程中都有合適的K值，達到較短的時間內獲得目標物質較好的分離的效果，因此梯度 洗脫的優(yōu)化是復雜體系分離中必不可少的部分。
[0005] 青風藤作為中藥的代表，是一種較為常用的中草藥，性平，味苦、辛，歸肝、脾經(jīng)。具 有祛風濕、通經(jīng)絡、利小便的功效，主要被應用于風濕痹痛，關節(jié)腫脹以及麻痹瘙癢等的治 療。近年來，隨著風濕、類風濕病發(fā)病率的不斷上升，對青風藤的研究逐漸深人，研究表明青 風藤中主要成分是生物堿，此外還含有谷留醇、豆留醇、十六烷酸酯等。文獻報道青風藤 中的生物堿以青藤堿為主，還含有木蘭花堿、綠心樹堿、四氫表小檗堿以及異粉防己堿等， 目前在對青風藤中生物堿的分析方面，研究較多的方法有薄層色譜掃描法、高效液相色譜 法等，但是利用液相色譜質譜聯(lián)用研究青風藤中生物堿進行分析還不常見，另外生物堿極 性大，在色譜柱中不容易保留，需要找合適的方法來使生物堿達到很好的保留效果。在對青 風藤中生物堿提取方面的研究中，研究較多的的方法有回流提取法以及超聲提取法等，但 是這些提取方法的提取效率不夠高，提取操作繁瑣，耗時。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種簡單、準確、快速的液相色譜質譜聯(lián)用測定青風藤中 生物堿的方法以及索氏提取、微波法提取青風藤中生物堿的方法。
[0007] 本發(fā)明的目的通過如下技術方案實現(xiàn):一種液相色譜質譜聯(lián)用測定青風藤中生物 堿的方法，它包括以下步驟：
[0008] (1)樣品溶液的制備；
[0009] (2)樣品的分析：
[0010] 色譜條件：
[0011] 色譜柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mmX250mm，5wii);
[0012] 流動相為:A相：甲醇、B相:4~8mM醋酸銨水溶液；
[0013] 梯度洗脫條件：0-71^11:55-45%8;7-25111111 :45-25%8;25-26111111:25-10%8;26-30min：10%B；30-31min：10-55%B；31-35min：55%B；
[0014] 流速:0.3~0.5mL/min;
[0015] 柱溫：30 ~35°C;
[0016] 進樣量:5 ~10yL;
[0017] ⑶質譜條件：
[0018] 離子源：電噴霧電離源（ESI);掃描方式：正離子掃描；離子掃描的范圍為100~ 700m/z;干燥氣(N2)流速:6~8L/min，溫度為300~350°C;霧化氣(N 2)壓力為35~40psi;毛 細管電壓:3.0~3.5kV;毛細管出口電壓：100V;終板偏置電壓:-500V~-400V;
[0019] 本發(fā)明所述的生物堿主要為青藤堿、木蘭花堿、綠心樹堿、四氫表小檗堿以及異粉 防己堿這5種生物堿
[0020] 步驟(1)中的樣品溶液為對照品溶液，所述的對照品溶液的配制方法如下:將待分 析的青風藤中的生物堿標準品溶解在1.00~1.5mL的無水乙醇中，配置成1 (T3mo 1/L的母液 并置于3~5°C冰箱中保存，分析前用甲醇或高純水將母液稀釋至所需要的濃度。
[0021] 步驟（1)中的樣品溶液為將青風藤進行索氏提取后所得到的溶液，所述的索氏提 取的具體方法為:稱取過50~70目篩的青風藤中藥粉末l.Og，裝于濾紙筒中，將開口端折疊 封住，放于索氏提取筒中，用70~80mL的65~75%的乙醇回流提取8~10h，冷卻后將提取液 傾倒入旋轉蒸發(fā)燒瓶中，殘渣中加入70~80mL的65~75%的乙醇回流提取5~6h，提取液冷 卻后，與第一次提取液合并加入蒸發(fā)燒瓶中，在90~100°C條件下旋轉蒸發(fā)2~3h，得到濃縮 液，待濃縮液冷卻后，用60~70 %的無水乙醇溶液于25mL容量瓶中定容，放于3~5°C冰箱中 保存，分析前，先用高純水稀釋至所需的濃度。
[0022]步驟（1)中的樣品溶液為將青風藤進行微波提取后所得到的溶液，所述的微波提 取的具體方法為:精確稱取過50~70目篩的青風藤粉末l.Og置于150mL的燒瓶中，往燒瓶中 加入料液比為1:30~1:40的65 %~75 %的乙醇溶液，得青風藤乙醇溶液，將青風藤乙醇溶 液在微波功率為450~550W、提取溫度為55~65°C條件下，提取10~20min，冷卻后用真空抽 濾栗抽濾，得濾液，棄去藥渣，然后將濾液轉移至25mL容量瓶中定容，于3~5 °C冰箱保存，分 析前，先用高純水稀釋至所需的濃度。
[0023]在HPLC-MS最佳條件的摸索上本發(fā)明的發(fā)明人進行了以下嘗試：
[0024] 1)色譜柱的選擇:本發(fā)明的發(fā)明人考察了不同長度、內徑、填充材料的色譜柱對五 種生物堿分離效果的影響，包括:Agilent ZORBAX 300SB-C8(4.6X150mm，5_)、Agilent ZORBAX SB-C18(3.0X150mm，5wii)、Agilent ZORBAX SB-C18(3.0X250mm，5_)。在使用 Agilent ZORBAX SB-C18(3.OX 250mm，5_)型號的色譜柱時，五種生物堿的分離效果最好， 因此發(fā)明人選用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0X250mm，5ym)〇
[0025] 2)流動相種類及濃度的優(yōu)化:反相色譜法的流動相極性大于固定相，一般是用甲 醇、乙腈或四氫呋喃等極性的有機溶劑與水組成的二元或者多元體系。在二元流動相體系 中一般使用水作為基礎溶劑，與一定比例的甲醇或乙腈混合而成。發(fā)明人嘗試了甲醇-水和 乙腈水這兩種二元流動相，但是綠心樹堿和異粉防己堿不能很好的保留。
[0026] 為了使五種生物堿均達到很好的保留效果，發(fā)明人嘗試采用了離子抑制色譜法， 在反相色譜中通過調節(jié)流動相的PH，抑制樣品組分的解離，增加樣品在固定相中的溶解度， 以達到分離有機弱酸、弱堿的目的。發(fā)明人嘗試了甲醇_醋酸銨緩沖溶液與乙腈-醋酸銨緩 沖溶液作為流動相，實驗結果如圖1所示:在用甲醇-醋酸銨緩沖溶液作為流動相時能得到 相對較好的分離與響應，同時結果顯示流動相中醋酸銨的濃度為5mM時能得到較好的分離 與響應，因此本發(fā)明采用甲醇-醋酸銨作為流動相，且選擇5mM醋酸銨為最佳濃度，其中圖1 中:A為醋酸銨濃度為15mM時所得的譜圖；B為醋酸銨濃度為10mM時所得的譜圖；C:為醋酸銨 濃度為5mM所得的譜圖；實驗條件：采用Agilent Z0RBAX SB-C18(3.0_X250mm，5wn)色譜 柱，柱溫30 °C，進樣量1 OyL，流動相為甲醇(A)-醋酸銨緩沖(B)，流速0.5ml/min，線性梯度洗 脫程序見表1，5種生物堿的濃度均為10_ 4mol/L;另外圖1中，峰1為Magnoflorine木蘭花堿， 峰2為Sinomenine青藤堿，峰3為Curine綠心樹堿，峰4為Sinactine四氫表小檗堿，峰5為 Isotetrandrine^^l^j
[0027] 3)梯度洗脫的影響：由于本發(fā)明樣品中的五種生物堿的性質差異較大，采用等度 洗脫時，不能得到所有物質的有效保留，因而嘗試采用梯度洗脫以達到滿意的效果。發(fā)明人 嘗試了不同比例的甲醇緩沖溶液作為流動相時對五種生物堿分離的影響，在最佳的比例條 件下，對比了乙腈-緩沖溶液與甲醇緩沖溶液對物質分離的影響。結果發(fā)現(xiàn)在使用甲醇-醋 酸銨(5mM)緩沖溶液作為流動相，見表1的線性梯度洗脫程序進行目標物質的分析時，五種 物質的分離效果最好，在此分離條件下，最佳色譜圖見圖2,其中圖2中：峰1為Magnof lorine 木蘭花堿，峰2為Sinomenine青藤堿，峰3為Curine綠心樹堿，峰4為Sinactine四氫表小檗 喊，峰5為Isotetrandrine異粉防己喊；實驗條件：米用Agilent Z0RBAX SB_C18(3.0mmX 250mm，5wii)色譜柱，柱溫30°C，進樣量10此，流動相為甲醇(A)-5mM醋酸銨緩沖（B)，流速 0.5ml/min，線性梯度洗脫程序見表1，5種生物堿的濃度均為l(T 4m〇l/L。
[0028] 表1線性梯度洗脫程序表
[0030] 4)本發(fā)明的發(fā)明人還進行了作為流動相的緩沖溶液的pH值的優(yōu)化：
[0031]生物堿的分離與流動相的pH值也有很大的關系。對于弱酸，當流動相的pH值小于 它的pKa值時，組分以離子形式存在，容量因子k值變小，保留時間tR減??；反之，當流動相的 pH>pKa值時，組分以分子形式存在，容量因子k值變大，保留時間tR增大；因此，調節(jié)流動相 的pH值可以在較大的范圍內改變分離的選擇性。由于Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mmX 250mm，5wii)使用的pH范圍為2-7.5之間化11>8可能使載體硅膠溶解挪〈2可能使鍵合相的鍵 合基團脫落），發(fā)明人試了各物質在pH為5.5-7.5之間的響應，如圖3所示，在圖3中，曲線1為 Magnof lorine木蘭花堿，曲線2為Sinomenine青藤堿，曲線3為Curine綠心樹堿，曲線4為 Sinactine四氫表小檗堿，曲線5為Isotetrandrine異粉防己堿，實驗條件：采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mm X 250mm，5wn)色譜柱，柱溫30°C，進樣量 10yL，流動相為甲醇(A)-5mM 醋酸銨緩沖(B)，流速0.5ml/min，線性梯度洗脫程序見表1，其中5種生物堿的濃度均為1(T 4mol/L〇
[0032]從圖3可以看出，在pH值為6.5時，各物質的響應最好。實驗中發(fā)現(xiàn)使用5mM的醋酸 銨(pH = 6.4)也能達到以上的分離效果。為了使操作更加簡便，本發(fā)明優(yōu)選采用5mM的醋酸 銨與甲醇配合作為流動相。
[0033] 5)本發(fā)明的發(fā)明人還對柱溫及進樣量的影響，最終優(yōu)選30 °C和1 OyL作為最佳的柱 溫及進樣量，
[0034] 6)質譜條件的優(yōu)化:經(jīng)多次實驗后，選擇的最佳質譜條件為:離子源：電噴霧電離 源（ESI);掃描方式：正離子掃描；離子掃描的范圍為100~700m/z ;干燥氣（N2)流速：8L/ min，溫度為350°C;霧化氣(N2)壓力為35~40psi;毛細管電壓：3.0~3.5kV;毛細管出口電 壓：100V;終板偏置電壓:-500V~-400V;在最佳質譜條件下得到的五種生物堿的離子峰（[M +H] + )見圖4至圖8。
[0035] 一種索氏提取青風藤中生物堿的方法，它包括以下工藝步驟:稱取過50~70目篩 的青風藤中藥粉末l.〇g，裝于濾紙筒中，將開口端折疊封住，放于索氏提取筒中，用70~ 80mL的65~75%乙醇回流提取8~10h，冷卻后將提取液傾倒入旋轉蒸發(fā)燒瓶中，殘渣中加 入70~80mL的65~75 %的乙醇回流提取5~6h，提取液冷卻后，與第一次提取液合并入蒸發(fā) 燒瓶中，在90~100 °C條件下旋轉蒸發(fā)2~3h，得到濃縮液。待濃縮液冷卻后，用60~70 %的 無水乙醇溶液于25mL容量瓶中定容，放于3~5°C冰箱中保存。分析前，先用高純水稀釋至所 需的濃度，然后用0.22或0.45WI1微孔濾膜過濾。
[0036] 一種微波法提取青風藤中生物堿的方法，它包括以下工藝步驟:精確稱取過50~ 70目篩的青風藤粉末1.0g置于150mL的燒瓶中，往燒瓶中加入料液比為1:30~1:40的65% ~75%的乙醇溶液，得青風藤乙醇溶液，將青風藤乙醇溶液在微波功率為450~550W、提取 溫度為55~65°C條件下，提取時間10~20min，冷卻后用真空抽濾栗抽濾，得濾液，棄去藥 渣，然后將濾液轉移至25mL容量瓶中定容，于3~5 °C冰箱保存，分析前，先用高純水稀釋至 所需的濃度，然后用〇. 22或0.45mi微孔濾膜過濾，所得的提取液采用HPLC-MS進行定性與定 量，數(shù)據(jù)顯示這種工藝下，微波提取10~20min的效果與索氏提取16~24h的效果相當。
[0037]微波提取的效率與溶劑、溫度、時間、料液比和功率等因素有關。本發(fā)明的發(fā)明人 為了篩選最佳的提取條件，先采用單因素法選擇最佳的提取溶劑，然后用正交設計優(yōu)化時 間、溫度、功率、料液比微波提取條件，因素及水平見表4。以提取木蘭花堿和青藤堿的總含 量作為指標，對提取條件進行優(yōu)化。精確稱取青風藤粉末l.〇g(過60目樣品篩)于150mL的燒 瓶中，按照正交試驗設計的條件進行提取。冷卻后抽濾，得濾液。然后將濾液轉移至25mL容 量瓶中定容，用高純水稀釋10倍后，用0.22mi微孔濾膜過濾，采用HPLC-MS進行定性與定量， 其中色譜條件為:采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0_X250mm，5wn)色譜柱，柱溫為30°C的 條件下進樣量1〇此，以甲醇(A)-5mM醋酸銨緩沖(B)=55:45(V/V)為流動相，在0.5ml/min的 最佳分離流速進行等度洗脫。質譜條件:采用大氣壓電噴霧離子源，離子阱質量分析器。離 子的檢測模式為正離子模式;離子掃描的范圍為100 -700m/z ;干燥氣(N2)流速:8L/min，溫 度為350°C;霧化氣(N2)壓力為40psi;毛細管電壓:3.5kV;毛細管出口電壓：100V;終板偏置 電壓:-500V。經(jīng)優(yōu)化得到的最佳提取條件為:提取溶劑為70 %乙醇，提取時間15min，溫度60 。(：，料液比為1:35，最佳功率為500W。
[0038] 表4 MAE條件正交優(yōu)化表1^(45)
[0040] 提取溶劑的選擇：
[0041] 在微波提取的過程中，提取溶劑的極性對提取的效果有很大的影響。由于微波是 一種能量形式，在其傳輸過程中可以對提取液中的極性物質產(chǎn)生作用，使提取液中的極性 物質瞬間極化，并產(chǎn)生大量的熱量。在提取過程中為了保證微波的提取效率和在較低的溫 度下使目標成分擴散到提取液中，一般使用的提取溶劑不僅要有較小的介電常數(shù)，而且溶 劑對目標成分要有較大的溶解能力。為了達到最佳的提取效果，發(fā)明人對提取溶液的類型 進行了選擇，如30%的乙醇、50%的乙醇、70%的乙醇、100%的乙醇、水、30%的甲醇、50% 的乙甲醇、70%的甲醇、100 %的甲醇，發(fā)現(xiàn)使用不同的提取溶劑（30%-100%無水乙醇、 30%-100%甲醇、水)進行微波提取的效率不同，其中70%的乙醇體取效率最好。
[0042]其他微波提取條件優(yōu)化：
[0043]在通常情況下，微波提取效率會隨著提取溫度的提高而提高，但是在較高的溫度 下，可能會使會導致目標化合物的分解或者其他種類的化合物被提取出來，降低提取的選 擇性，因此在微波提取時應選擇合適的提取溫度。
[0044]本發(fā)明的發(fā)明人選擇L16(45)的正交設計表，進行正交試驗。表4中對微波的時間、 溫度、功率、料液比進行了正交設計，以考察這4個因素對微波輔助提取的影響。由于青風藤 中藥中木蘭花堿和青藤堿的含量較高，因此以木蘭花堿和青藤堿的總量作為衡量指標，經(jīng) HPLC測定其提取總量，見表5。
[0045]表5微波提取條件L16(45)正交試驗分析結果

[0048]為了消除試驗中由于掌握不勻所帶來的干擾以及外界條件所引起的系統(tǒng)誤差，發(fā) 明人并沒有按照表5中的試驗順序進行試驗，而是采取隨機打亂的辦法完成了表5中所有的 組合。
[0049]表5中，Kij =第j列上水平號為i的各因素試驗之和。kij = Kij/s，其中S為第j列上水 平號i出現(xiàn)的次數(shù)，在本實驗中數(shù)值為tku表示第j列上的因素取水平i時，進行試驗所得的 試驗結果的平均值。
[0050] R偽第j列的極差或者其所在因素的極差心zmaHkd-mirUk^}。一般來說各列的 極差是不一樣的，這也就表明各因素的水平改變對實驗的結果影響不同。極差越大，說明這 個因素的水平改變對試驗的影響越大。極差最大的那一列的因素也就是最主要的因素。從 表5中可以看出:R0ROR0R4，即因素主次順序為:溫度〉時間〉功率〉料液比。
[0051] 空白列的極差體現(xiàn)的是除溫度、時間、功率和料液比之外的其他因素對試驗的影 響。如果空白列的極差比其他列都要高就說明因素之間存在不可忽視的交互作用或者其他 對實驗有重要影響的因素。在本實驗中空白列的極差值比較小，說明所選因素合適。在實驗 中，因素水平對應的指標越大越好，因此本試驗的最佳方案為:微波時間15min，功率500W， 提取溫度為60°C，料液比為1:35。在最佳的微波提取條件下，經(jīng)高效液相色譜測定木蘭花堿 和青藤堿的含量分別為:3.46mg/g、6.52mg/g。本試驗的因素與指標的關系見圖9，圖9中，正 交試驗A、B、C、D各因素及水平見表4。
[0052] 較之現(xiàn)有技術而言，本發(fā)明的優(yōu)點在于：因為生物堿的極性大，在色譜柱中不容易 保留，利用本發(fā)明的色譜條件能夠使各生物堿均得到很好的保留。另外，該液相色譜質譜聯(lián) 用測定青風藤中生物堿的方法，利用梯度洗脫，縮短了分析時間。青藤堿、木蘭花堿、綠心樹 堿、四氫表小檗堿以及異粉防己堿在30min內完全分離，本發(fā)明的液相色譜質譜聯(lián)用測定青 風藤中生物堿的方法不僅為青風藤的分析提供了 一種新的方法，而且為青風藤中藥品質的 鑒定和應用提供參考;本發(fā)明的微波法提取青風藤中生物堿的方法，提取時間短、節(jié)約溶 劑、提取尚效。
【附圖說明】
[0053] 圖1是本發(fā)明進行流動相種類及濃度的優(yōu)化時所得的譜圖。
[0054]圖2是本發(fā)明探究梯度洗脫程序時所得的譜圖。
[0055]圖3是本發(fā)明進行作為流動相的緩沖溶液的pH值優(yōu)化時所得的譜圖。
[0056]圖4是木蘭花堿的離子峰。
[0057]圖5是青藤堿的離子峰。
[0058] 圖6是綠心樹堿的離子峰。
[0059]圖7是四氫表小檗堿的離子峰。
[0060]圖8是異粉防己堿的離子峰。
[0061 ]圖9是本發(fā)明進行微波提取條件優(yōu)化時正交試驗因素與指標的關系圖。
【具體實施方式】
[0062]下面結合說明書附圖和實施例對本
【發(fā)明內容】
進行詳細說明：
[0063] 實施例一：
[0064] -種液相色譜質譜聯(lián)用測定青風藤中生物堿的方法，它包括以下步驟：
[0065] (1)樣品溶液的制備：所述的樣品溶液為對照品溶液，對照品溶液的配制方法如 下：分別將適量的五種生物堿標準品溶解在1.50mL的無水乙醇中，配置成l(T3m〇l/L的母液 并置于5°C冰箱中保存；分析前，取一定量的各種母液，用甲醇將各母液分別稀釋至8.0 X l(T5m〇l/L，然后混合這5種稀釋后的溶液得5種生物堿的標準混合液，5種生物堿的標準混合 液采用HPLC-MS進行定性與定量分析；
[0066] (2)樣品的分析：
[0067] 色譜條件：
[0068] 色譜柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mmX250mm，5wii);
[0069] 流動相為:A相：甲醇、B相:4mM醋酸銨水溶液；
[0070] 梯度洗脫條件見表1:
[0071] 表1線性梯度洗脫程序表
[0073] 流速:流速 0.3mL/min;
[0074] 柱溫：35 °C;
[0075] 進樣量:5yL;
[0076] (3)質譜條件：
[0077]離子源：電噴霧電離源（ESI);掃描方式：正離子掃描；離子掃描的范圍為100~ 700m/z;干燥氣（N2)流速：6L/min，溫度為300°C;霧化氣（N2)壓力為35psi;毛細管電壓： 3.0KV;毛細管出口電壓：100V;終板偏置電壓:-400V。
[0078] 實施例二：
[0079] -種液相色譜質譜聯(lián)用測定青風藤中生物堿的方法，它包括以下步驟：
[0080] (1)樣品溶液的制備：所述的樣品溶液為對照品溶液，對照品溶液的配制方法如 下:分別將適量的五種生物堿標準品溶解在l.OOmL的無水乙醇中，配置成l(T 3m〇l/L的母液 并置于4°C冰箱中保存;分析前，取一定量的各種母液，用甲醇將各母液分別稀釋至l(T 4m〇l/ L，然后混合這5種稀釋后的溶液得5種生物堿的標準混合液;5種生物堿的標準混合液采用 HPLC-MS進行定性與定量分析；
[0081] (2)樣品的分析：
[0082] 色譜條件：
[0083] 色譜柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mmX250mm，5wii);
[0084] 流動相為:A相：甲醇、B相:5mM醋酸銨水溶液；
[0085]梯度洗脫條件見表1:
[0086]表1線性梯度洗脫程序表
[0088] 流速:流速 0.5mL/min;
[0089] 柱溫：30。(：；
[0090] 進樣量：10yL;
[0091] (3)質譜條件：
[0092]離子源：電噴霧電離源（ESI);掃描方式：正離子掃描；離子掃描的范圍為100~ 700m/z;干燥氣（N2)流速：8L/min，溫度為350°C;霧化氣（N2)壓力為40psi;毛細管電壓： 3.5kV;毛細管出口電壓：100V;終板偏置電壓:-500V。
[0093] 實施例三：
[0094] -種液相色譜質譜聯(lián)用測定青風藤中生物堿的方法，它包括以下步驟：
[0095] (1)樣品溶液的制備：所述的樣品溶液為對照品溶液，對照品溶液的配制方法如 下：分別將適量的五種生物堿標準品溶解在1.25mL的無水乙醇中，配置成l(T 3m〇l/L的母液 并置于3°C冰箱中保存；分析前，取一定量的各種母液，用甲醇將各母液分別稀釋至1.2 X l(T4m〇l/L，然后混合這5種稀釋后的溶液得5種生物堿的標準混合液，5種生物堿的標準混合 液采用HPLC-MS進行定性與定量分析；
[0096] (2)樣品的分析：
[0097] 色譜條件：
[0098]色譜柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mmX250mm，5wii);
[0099] 流動相為:A相：甲醇、B相:8mM醋酸銨水溶液；
[0100]梯度洗脫條件見表1:
[0101]表1線性梯度洗脫程序表
[0103]流速:流速 0.4mL/min;
[0104] 柱溫:32°C;
[0105] 進樣量:8yL;
[0106] (3)質譜條件：
[0107] 離子源：電噴霧電離源（ESI);掃描方式：正離子掃描；離子掃描的范圍為100~ 700m/z;干燥氣（N2)流速：7L/min，溫度為320°C;霧化氣（N 2)壓力為38psi;毛細管電壓： 3.3kV;毛細管出口電壓：100V;終板偏置電壓:-450V。
[0108]在實施例一至實施例三中，其中實施例二的實驗條件為最優(yōu)條件，因此，本發(fā)明的 發(fā)明人將實施例二中的5種生物堿的標準混合液重復進樣5次，并連續(xù)5天對這一濃度的樣 品進行分離，考察檢測方法的重現(xiàn)性。測得迀移時間和峰面積的日內相對標準偏差(RSD)和 日間RSD詳細結果見表2。
[0109] 表2遷移時間和峰面積的重現(xiàn)性實驗(n = 5)
[0112] 實施例四：
[0113] -種液相色譜質譜聯(lián)用測定青風藤中生物堿的方法，它包括以下步驟：
[0114] (1)樣品溶液的制備:所述的樣品溶液為將青風藤進行索氏提取后所得到的溶液， 所述的索氏提取的具體方法為:稱取過70目篩的青風藤中藥粉末l.Og，裝于濾紙筒中，將開 口端折疊封住，放于索氏提取筒中，用70mL的65%的乙醇回流提取10h，冷卻后將提取液傾 倒入旋轉蒸發(fā)燒瓶中，殘渣中加入70mL的65%的乙醇回流提取6h，提取液冷卻后，與第一次 提取液合并加入蒸發(fā)燒瓶中，在l〇〇°C條件下旋轉蒸發(fā)2h，得到濃縮液，待濃縮液冷卻后，用 70%的無水乙醇溶液于25mL容量瓶中定容，放于5°C冰箱中保存；分析前，取青風藤索氏提 取液，先用高純水稀釋10倍后，用0.22M1的有機微孔濾膜對其進行過濾，過濾之后采用 HPLC-MS進行定性與定量分析；
[0115] (2)樣品的分析：
[0116] 色譜條件：
[0117] 色譜柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mmX250mm，5wii);
[0118] 流動相為:A相：甲醇、B相:4mM醋酸銨水溶液；
[0119] 梯度洗脫條件見表1:
[0120] 表1線性梯度洗脫程序表
[0122] 流速:流速 0.3mL/min;
[0123] 柱溫:35°C;
[0124] 進樣量:5yL;
[0125] (3)質譜條件：
[0126] 離子源：電噴霧電離源（ESI);掃描方式：正離子掃描；離子掃描的范圍為100~ 700m/z;干燥氣（N2)流速：6L/min，溫度為300°C;霧化氣（N 2)壓力為35psi;毛細管電壓： 3.0kV;毛細管出口電壓：100V;終板偏置電壓:-400V。
[0127] 實施例五：
[0128] -種液相色譜質譜聯(lián)用測定青風藤中生物堿的方法，它包括以下步驟：
[0129] (1)樣品溶液的制備:所述的樣品溶液為將青風藤進行索氏提取后所得到的溶液， 所述的索氏提取的具體方法為:稱取過60目篩的青風藤中藥粉末l.Og，裝于濾紙筒中，將開 口端折疊封住，放于索氏提取筒中，用80mL的70%的乙醇回流提取8h，冷卻后將提取液傾倒 入旋轉蒸發(fā)燒瓶中，殘渣中加入80mL的70%的乙醇回流提取5h，提取液冷卻后，與第一次提 取液合并加入蒸發(fā)燒瓶中，在90°C條件下旋轉蒸發(fā)3h，得到濃縮液，待濃縮液冷卻后，用 60%的無水乙醇溶液于25mL容量瓶中定容，放于4°C冰箱中保存；分析前，取青風藤索氏提 取液，先用高純水稀釋10倍后，用0.22M1的有機微孔濾膜對其進行過濾，過濾之后采用 HPLC-MS進行定性與定量分析；
[0130] (2)樣品的分析：
[0131] 色譜條件：
[0132] 色譜柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mmX250mm，5wii);
[0133] 流動相為:A相：甲醇、B相:5mM醋酸銨水溶液；
[0134] 梯度洗脫條件見表1:
[0135] 表1線性梯度洗脫程序表
[0137] 流速:流速 0.5mL/min;
[0138] 柱溫：30。(：；
[0139] 進樣量:10yL;
[0140] (3)質譜條件：
[0141] 離子源：電噴霧電離源（ESI);掃描方式：正離子掃描；離子掃描的范圍為100~ 700m/z;干燥氣（N2)流速：8L/min，溫度為350°C;霧化氣（N 2)壓力為40psi;毛細管電壓： 3.5kV;毛細管出口電壓：100V;終板偏置電壓:-500V。
[0142] 實施例六：
[0143] -種液相色譜質譜聯(lián)用測定青風藤中生物堿的方法，它包括以下步驟：
[0144] (1)樣品溶液的制備:所述的樣品溶液為將青風藤進行索氏提取后所得到的溶液， 所述的索氏提取的具體方法為:稱取過50目篩的青風藤中藥粉末l.Og，裝于濾紙筒中，將開 口端折疊封住，放于索氏提取筒中，用75mL的75%的乙醇回流提取9h，冷卻后將提取液傾倒 入旋轉蒸發(fā)燒瓶中，殘渣中加入75mL的75 %的乙醇回流提取5.5h，提取液冷卻后，與第一次 提取液合并加入蒸發(fā)燒瓶中，在95°C條件下旋轉蒸發(fā)2.5h，得到濃縮液，待濃縮液冷卻后， 用65 %的無水乙醇溶液于25mL容量瓶中定容，放于3 °C冰箱中保存；分析前，取青風藤索氏 提取液，先用高純水稀釋10倍后，用0.22wii的有機微孔濾膜對其進行過濾，過濾之后采用 HPLC-MS進行定性與定量分析；
[0145] (2)樣品的分析：
[0146] 色譜條件：
[0147] 色譜柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mmX250mm，5wii);
[0148] 流動相為:A相：甲醇、B相:8mM醋酸銨水溶液；
[0149] 梯度洗脫條件見表1:
[0150] 表1線性梯度洗脫程序表
[0152] 流速:流速 0.4mL/min;
[0153] 柱溫:32°C;
[0154] 進樣量:8此；
[0155] (3)質譜條件：
[0156] 離子源：電噴霧電離源（ESI);掃描方式：正離子掃描；離子掃描的范圍為100~ 700m/z;干燥氣（N2)流速：7L/min，溫度為320°C;霧化氣（N 2)壓力為38psi;毛細管電壓： 3.3kV;毛細管出口電壓：100V;終板偏置電壓:-450V。
[0157] 在實施例四至實施例六中，實施例五的實驗條件為最優(yōu)實驗條件，發(fā)明人利用實 施例五的索氏提取條件，對青風藤進行三次平行索氏提取，并分別測定所得的提取液中的 木蘭花喊和青藤喊的含量，同時測得二次平行實驗的相對標準偏差(RSD)在1.0_3.8 %之 間，詳細見表3。
[0158] 表3木蘭花堿和青藤堿的測定結果和相對標準偏差
[0160] 實施例七：
[0161] -種液相色譜質譜聯(lián)用測定青風藤中生物堿的方法，它包括以下步驟：
[0162] (1)樣品溶液的制備:所述的樣品溶液為將青風藤進行微波提取后所得到的溶液， 所述的微波提取的具體方法為:精確稱取過50目篩的青風藤粉末1.0g置于150mL的燒瓶中， 往燒瓶中加入料液比為1: 30的65 %的乙醇溶液，得青風藤乙醇溶液，將青風藤乙醇溶液在 微波功率為450W、提取溫度為55°C條件下，提取lOmin，冷卻后用真空抽濾栗抽濾，得濾液， 棄去藥渣，然后將濾液轉移至25mL容量瓶中定容，于3 °C冰箱保存。分析前，取青風藤微波提 取液，先用高純水稀釋10倍后，用0.22M1的有機微孔濾膜對其進行過濾，過濾之后采用 HPLC-MS進行定性與定量分析；
[0163] (2)樣品的分析：
[0164] 色譜條件：
[0165] 色譜柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mmX250mm，5wii);
[0166] 流動相為:A相：甲醇、B相:4mM醋酸銨水溶液；
[0167] 梯度洗脫條件見表1:
[0168] 表1線性梯度洗脫程序表
[0170] 流速:流速 0.3mL/min;
[0171] 柱溫：35。(：；
[0172] 進樣量:5yL;
[0173] (3)質譜條件：
[0174] 離子源：電噴霧電離源（ESI);掃描方式：正離子掃描；離子掃描的范圍為100~ 700m/z;干燥氣（N2)流速：6L/min，溫度為300°C;霧化氣（N 2)壓力為35psi;毛細管電壓： 3.0kV;毛細管出口電壓：100V;終板偏置電壓:-400V。
[0175] 實施例八：
[0176] -種液相色譜質譜聯(lián)用測定青風藤中生物堿的方法，它包括以下步驟：
[0177] (1)樣品溶液的制備:所述的樣品溶液為將青風藤進行微波提取后所得到的溶液， 所述的微波提取的具體方法為:精確稱取過60目篩的青風藤粉末1. Og置于150mL的燒瓶中， 往燒瓶中加入料液比為1: 35的70 %的乙醇溶液，得青風藤乙醇溶液，將青風藤乙醇溶液在 微波功率為500W、提取溫度為60°C條件下，提取15min，冷卻后用真空抽濾栗抽濾，得濾液， 棄去藥渣，然后將濾液轉移至25mL容量瓶中定容，于4 °C冰箱保存。分析前，取青風藤微波提 取液，先用高純水稀釋10倍后，用0.22M1的有機微孔濾膜對其進行過濾，過濾之后采用 HPLC-MS進行定性與定量分析；
[0178] (2)樣品的分析：
[0179] 色譜條件：
[0180] 色譜柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mmX250mm，5wii);
[0181] 流動相為:A相：甲醇、B相:5mM醋酸銨水溶液；
[0182] 梯度洗脫條件見表1:
[0183] 表1線性梯度洗脫程序表
[0185] 流速:流速 0.5mL/min;
[0186] 柱溫：30。(：；
[0187] 進樣量：10yL;
[0188] (3)質譜條件：
[0189] 離子源：電噴霧電離源（ESI);掃描方式：正離子掃描；離子掃描的范圍為100~ 700m/z;干燥氣（N2)流速：8L/min，溫度為350°C;霧化氣（N 2)壓力為40psi;毛細管電壓： 3.5kV;毛細管出口電壓：100V;終板偏置電壓:-500V。
[0190] 實施例九：
[0191] -種液相色譜質譜聯(lián)用測定青風藤中生物堿的方法，它包括以下步驟：
[0192] (1)樣品溶液的制備:所述的樣品溶液為將青風藤進行微波提取后所得到的溶液， 所述的微波提取的具體方法為:精確稱取過70目篩的青風藤粉末1.0g置于150mL的燒瓶中， 往燒瓶中加入料液比為1:40的75 %的乙醇溶液，得青風藤乙醇溶液，將青風藤乙醇溶液在 微波功率為550W、提取溫度為65°C條件下，提取20min，冷卻后用真空抽濾栗抽濾，得濾液， 棄去藥渣，然后將濾液轉移至25mL容量瓶中定容，于5 °C冰箱保存。分析前，取青風藤微波提 取液，先用高純水稀釋10倍后，用0.22M1的有機微孔濾膜對其進行過濾，過濾之后采用 HPLC-MS進行定性與定量分析；
[0193] (2)樣品的分析：
[0194] 色譜條件：
[0195] 色譜柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mmX250mm，5wii);
[0196] 流動相為:A相：甲醇、B相:8mM醋酸銨水溶液；
[0197] 梯度洗脫條件見表1:
[0198] 表1線性梯度洗脫程序表
[0200] 流速:流速 0.4mL/min;
[0201] 柱溫：32 °C;
[0202]進樣量:8yL;
[0203] (3)質譜條件：
[0204] 離子源：電噴霧電離源（ESI);掃描方式：正離子掃描；離子掃描的范圍為100~ 700m/z;干燥氣（N2)流速：7L/min，溫度為320°C;霧化氣（N 2)壓力為38psi;毛細管電壓： 3.3kV;毛細管出口電壓：100V;終板偏置電壓:-450V。
[0205] 在實施例七至實施例九中，其中實施例八的實驗條件為最優(yōu)實驗條件，在實施例 八的最佳實驗條件下，測定了微波提取青風藤中木蘭花堿和青藤堿的含量，實驗測得木蘭 花堿、青藤堿的含量分別為:3.46mg/g、6.52mg/g。
[0206] 實施例十：
[0207] -種索氏提取青風藤中生物堿的方法，它包括以下工藝步驟:稱取過70目篩的青 風藤中藥粉末l.〇g，裝于濾紙筒中，將開口端折疊封住，放于索氏提取筒中，用70mL的65% 的乙醇回流提取l〇h，冷卻后將提取液傾倒入旋轉蒸發(fā)燒瓶中，殘渣中加入70mL的65%的乙 醇回流提取6h，提取液冷卻后，與第一次提取液合并加入蒸發(fā)燒瓶中，在100°C條件下旋轉 蒸發(fā)2h，得到濃縮液，待濃縮液冷卻后，用70 %的無水乙醇溶液于25mL容量瓶中定容，放于5 °C冰箱中保存。將所得的青風藤索氏提取液，先用高純水稀釋10倍后，用0.22wii的有機微孔 濾膜對其進行過濾，再經(jīng)高效液相色譜測定，得索氏提取液中木蘭花堿和青藤堿的含量分 別為:3 ? 0 lmg/g、5 ? 98mg/g，其中色譜條件為：
[0208] 色譜柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mmX250mm，5wii);
[0209] 流動相為:A相：甲醇、B相:5mM醋酸銨水溶液；
[0210] 梯度洗脫條件見表1:
[0211] 表1線性梯度洗脫程序表 L0213」流速：流速 〇.5mL/min;
[0214]柱溫：3(TC;
[0215] 進樣量：1〇此；
[0216] 實施例：
[0217] -種索氏提取青風藤中生物堿的方法，它包括以下工藝步驟:稱取過60目篩的青 風藤中藥粉末l.〇g，裝于濾紙筒中，將開口端折疊封住，放于索氏提取筒中，用80mL的70% 的乙醇回流提取8h，冷卻后將提取液傾倒入旋轉蒸發(fā)燒瓶中，殘渣中加入80mL的70%的乙 醇回流提取5h，提取液冷卻后，與第一次提取液合并加入蒸發(fā)燒瓶中，在90°C條件下旋轉蒸 發(fā)3h，得到濃縮液，待濃縮液冷卻后，用60 %的無水乙醇溶液于25mL容量瓶中定容，放于4°C 冰箱中保存。將所得的青風藤索氏提取液，先用高純水稀釋10倍后，用〇.22wii的有機微孔濾 膜對其進行過濾，再經(jīng)高效液相色譜測定，測得木蘭花堿和青藤堿的含量分別為:3.19mg/ g、6.15mg/g，其中色譜條件為：
[0218] 色譜柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mmX250mm，5wii);
[0219] 流動相為:A相：甲醇、B相:5mM醋酸銨水溶液；
[0220] 梯度洗脫條件見表1:
[0221] 表1線性梯度洗脫程序表
[0224]流速:流速 0.5mL/min;
[0225] 柱溫：30°C;
[0226] 進樣量:10yL;
[0227] 實施例十二：
[0228] -種索氏提取青風藤中生物堿的方法，它包括以下工藝步驟:稱取過50目篩的青 風藤中藥粉末l.〇g，裝于濾紙筒中，將開口端折疊封住，放于索氏提取筒中，用75mL的75% 的乙醇回流提取9h，冷卻后將提取液傾倒入旋轉蒸發(fā)燒瓶中，殘渣中加入75mL的75%的乙 醇回流提取5.5h，提取液冷卻后，與第一次提取液合并加入蒸發(fā)燒瓶中，在95°C條件下旋轉 蒸發(fā)2.5h，得到濃縮液，待濃縮液冷卻后，用65 %的無水乙醇溶液于25mL容量瓶中定容，放 于:TC冰箱中保存。將所得的青風藤索氏提取液，先用高純水稀釋10倍后，用0.22wii的有機 微孔濾膜對其進行過濾，再經(jīng)高效液相色譜測定，測得木蘭花堿和青藤堿的含量分別為： 3 ? 08mg/g、6 ? 05mg/g，其中色譜條件為：
[0229] 色譜柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mmX250mm，5wii);
[0230] 流動相為:A相：甲醇、B相:5mM醋酸銨水溶液；
[0231] 梯度洗脫條件見表1:
[0232] 表1線性梯度洗脫程序表
[0234]流速:流速 0.5mL/min;
[0235]柱溫：30°C;
[0236] 進樣量：10yL。
[0237] 實施例十三：
[0238] -種微波法提取青風藤中生物堿的方法，它包括以下工藝步驟:精確稱取過50目 篩的青風藤粉末1 .〇g置于150mL的燒瓶中，往燒瓶中加入料液比為1:30的65%的乙醇溶液， 得青風藤乙醇溶液，將青風藤乙醇溶液在微波功率為450W、提取溫度為55°C條件下，提取 lOmin，冷卻后用真空抽濾栗抽濾，得濾液，棄去藥渣，然后將濾液轉移至25mL容量瓶中定 容，于:TC冰箱保存。將所得的青風藤微波提取液，先用高純水稀釋10倍后，用0.22wii的有機 微孔濾膜對其進行過濾，再經(jīng)高效液相色譜測定，測得木蘭花堿和青藤堿的含量分別為： 3 ? 35mg/g、6 ? 2 lmg/g，其中色譜條件為：
[0239] 色譜柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mmX250mm，5wii);
[0240] 流動相為:A相：甲醇、B相:5mM醋酸銨水溶液；
[0241] 梯度洗脫條件見表1:
[0242] 表1線性梯度洗脫程序表
[0244] 流速:流速 0.5mL/min;
[0245] 柱溫：3(TC;
[0246] 進樣量：10yL。
[0247] 實施例十四：
[0248] 一種微波法提取青風藤中生物堿的方法，它包括以下工藝步驟:精確稱取過60目 篩的青風藤粉末1 .〇g置于150mL的燒瓶中，往燒瓶中加入料液比為1:35的70%的乙醇溶液， 得青風藤乙醇溶液，將青風藤乙醇溶液在微波功率為500W、提取溫度為60°C條件下，提取 15min，冷卻后用真空抽濾栗抽濾，得濾液，棄去藥渣，然后將濾液轉移至25mL容量瓶中定 容，于4°C冰箱保存。將所得的青風藤微波提取液，先用高純水稀釋10倍后，用0.22wii的有機 微孔濾膜對其進行過濾，再經(jīng)高效液相色譜測定，測得木蘭花堿和青藤堿的含量分別為： 3 ? 46mg/g、6 ? 52mg/g，其中色譜條件為：
[0249] 色譜柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mmX250mm，5wii);
[0250] 流動相為:A相：甲醇、B相:5mM醋酸銨水溶液；
[0251] 梯度洗脫條件見表1:
[0252] 表1線性梯度洗脫程序表
[0254] 流速:流速 0.5mL/min;
[0255] 柱溫：3(TC;
[0256] 進樣量：10yL。
[0257] 實施例十五：
[0258] -種微波法提取青風藤中生物堿的方法，它包括以下工藝步驟:精確稱取過70目 篩的青風藤粉末1 .〇g置于150mL的燒瓶中，往燒瓶中加入料液比為1:40的75%的乙醇溶液， 得青風藤乙醇溶液，將青風藤乙醇溶液在微波功率為550W、提取溫度為65°C條件下，提取 20min，冷卻后用真空抽濾栗抽濾，得濾液，棄去藥渣，然后將濾液轉移至25mL容量瓶中定 容，于5°C冰箱保存。將所得的青風藤微波提取液，先用高純水稀釋10倍后，用0.22wii的有機 微孔濾膜對其進行過濾，再經(jīng)高效液相色譜測定，測得木蘭花堿和青藤堿的含量分別為： 3 ? 40mg/g、6 ? 33mg/g，其中色譜條件為：
[0259] 色譜柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mmX250mm，5wii);
[0260] 流動相為:A相：甲醇、B相:5mM醋酸銨水溶液；
[0261] 梯度洗脫條件見表1:
[0262] 表1線性梯度洗脫程序表
[0264]流速:流速 0.5mL/min;
[0265]柱溫：30°C;
[0266] 進樣量:10yL;
[0267] 實施例十六:索氏提取與微波提取提取效率對比試驗：
[0268] 為了對比索氏提取與微波提取的提取效率，發(fā)明人做了實施例十一的平行試驗以 及實施例十四的平行試驗，并對所得索氏提取液以及微波提取液進行HPLC-MS測定，測定結 果見表6。具體操作如下：
[0269] 稱取過60目篩的青風藤中藥粉末l.Og，裝于濾紙筒中，將開口端折疊封住，放于索 氏提取筒中，用80mL的70%的乙醇回流提取8h，冷卻后將提取液傾倒入旋轉蒸發(fā)燒瓶中，殘 渣中加入80mL的70 %的乙醇回流提取5h，提取液冷卻后，與第一次提取液合并加入蒸發(fā)燒 瓶中，在90°C條件下旋轉蒸發(fā)3h，得到濃縮液，待濃縮液冷卻后，用60%的無水乙醇溶液于 25mL容量瓶中定容，放于4 °C冰箱中保存。將所得的青風藤索氏提取液，先用高純水稀釋10 倍后，用0.22mi的有機微孔濾膜對其進行過濾，再經(jīng)HPLC-MS測定；
[0270]精確稱取過60目篩的青風藤粉末1.0g置于150mL的燒瓶中，往燒瓶中加入料液比 為1:35的70%的乙醇溶液，得青風藤乙醇溶液，將青風藤乙醇溶液在微波功率為500W、提取 溫度為60°C條件下，提取時間15min，冷卻后用真空抽濾栗抽濾，得濾液，棄去藥渣，然后將 濾液轉移至25mL容量瓶中定容，于4°C冰箱保存。將所得的青風藤微波提取液，先用高純水 稀釋10倍后，用〇. 22mi的有機微孔濾膜對其進行過濾，再經(jīng)HPLC-MS測定；
[0271]其中色譜條件為：
[0272] 色譜柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mmX250mm，5wii);
[0273] 流動相為:A相：甲醇、B相:5mM醋酸銨水溶液；
[0274] 梯度洗脫條件見表1:
[0275] 表1線性梯度洗脫程序表
[0277]流速:流速 0.5mL/min;
[0278]柱溫：30°C;
[0279] 進樣量:10此；
[0280]質譜條件為：
[0281] 離子源：電噴霧電離源（ESI);掃描方式：正離子掃描；離子掃描的范圍為100~ 700m/z;干燥氣（N2)流速：8L/min，溫度為350°C;霧化氣（N 2)壓力為40psi;毛細管電壓： 3.5kV;毛細管出口電壓：100V;終板偏置電壓:-500V。
[0282] 表6索氏提取與微波提取提取效率對比
[0284]從表中的數(shù)據(jù)可知微波提取15min的效果與16h的索氏提取的效果相當，而且索氏 提取得重復兩次提取(殘渣得重新提取一遍），可見微波提取比索氏提取更加快速、高效，另 外，微波提取還具有溶劑用量少、操作便捷的優(yōu)點。
【主權項】
1. 一種液相色譜質譜聯(lián)用測定青風藤中生物堿的方法，其特征在于:它包括以下步驟： (1) 樣品溶液的制備； (2) 樣品的分析： 色譜條件： 色譜柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mmX250mm，5ym); 流動相為:A相：甲醇、B相:4~8mM醋酸銨水溶液； 梯度洗脫條件：〇_7min: 55-45 %B; 7-25min: 45-25 % B; 25-26min: 25-10 %B; 26-30min: 10%B；30-31min：10-55%B；31-35min：55%B； 流速:流速〇 · 3~0 · 5mL/min; 柱溫：30~35 °C; 進樣量:5~IOyL; (3) 質譜條件： 離子源：電噴霧電離源(ESI);掃描方式:正離子掃描;離子掃描的范圍為100~700m/z; 干燥氣(N2)流速:6-8L/min，溫度為300~350°C;霧化氣(N2)壓力為35~40psi;毛細管電壓： 3.0~3.5kV;毛細管出口電壓：100V;終板偏置電壓:-500V~-400V。2. 根據(jù)權利要求1所述的液相色譜質譜聯(lián)用測定青風藤中生物堿的方法，其特征在于： 步驟(1)中的樣品溶液為對照品溶液，所述的對照品溶液的配制方法如下:將待分析的青風 藤中的生物堿標準品溶解在1.00~1.5mL的無水乙醇中，配置成l(T 3mol/L的母液并置于3~ 5 °C冰箱中保存。3. 根據(jù)權利要求1所述的液相色譜質譜聯(lián)用測定青風藤中生物堿的方法，其特征在于： 步驟(1)中的樣品溶液為將青風藤進行索氏提取后所得到的溶液。4. 根據(jù)權利要求3所述的液相色譜質譜聯(lián)用測定青風藤中生物堿的方法，其特征在于： 所述的索氏提取的具體方法為:稱取過50~70目篩的青風藤中藥粉末l.Og，裝于濾紙筒中， 將開口端折疊封住，放于索氏提取筒中，用70~80mL的65~75%的乙醇回流提取8~IOh，冷 卻后將提取液傾倒入旋轉蒸發(fā)燒瓶中，殘渣中加入70~80mL的65~75%的乙醇回流提取5 ~6h，提取液冷卻后，與第一次提取液合并加入蒸發(fā)燒瓶中，在90~100°C條件下旋轉蒸發(fā) 2_3h，得到濃縮液，待濃縮液冷卻后，用60~70 %的無水乙醇溶液于25mL容量瓶中定容，放 于3~5°C冰箱中保存。5. 根據(jù)權利要求1所述的液相色譜質譜聯(lián)用測定青風藤中生物堿的方法，其特征在于： 步驟(1)中的樣品溶液為將青風藤進行微波提取后所得到的溶液。6. 根據(jù)權利要求5所述的液相色譜質譜聯(lián)用測定青風藤中生物堿的方法，其特征在于： 所述的微波提取的具體方法為： 精確稱取過50~70目篩的青風藤粉末I .Og置于150mL的燒瓶中，往燒瓶中加入料液比 為1:30~1:40的65 %~75 %的乙醇溶液，得青風藤乙醇溶液，將青風藤乙醇溶液在微波功 率為450~550W、提取溫度為55~65°C條件下，提取10~20min，冷卻后用真空抽濾栗抽濾， 得濾液，棄去藥渣，然后將濾液轉移至25mL容量瓶中定容，于3~5 °C冰箱保存。7. -種索氏提取青風藤中生物堿的方法，其特征在于:它包括以下工藝步驟:稱取過50 ~70目篩的青風藤中藥粉末l.Og，裝于濾紙筒中，將開口端折疊封住，放于索氏提取筒中， 用70~80mL的65~75%乙醇回流提取8~10h，冷卻后將提取液傾倒入旋轉蒸發(fā)燒瓶中，殘 渣中加入70~80mL的65~75 %的乙醇回流提取5~6h，提取液冷卻后，與第一次提取液合并 入蒸發(fā)燒瓶中，在90~100 °C條件下旋轉蒸發(fā)2-3h，得到濃縮液。待濃縮液冷卻后，用60~ 70 %的無水乙醇溶液于25mL容量瓶中定容，放于3~5 °C冰箱中保存。8. -種微波法提取青風藤中生物堿的方法，其特征在于:它包括以下工藝步驟:精確稱 取過50~70目篩的青風藤粉末I .Og置于150mL的燒瓶中，往燒瓶中加入料液比為1: 20~1: 40的65 %~75 %的乙醇溶液，得青風藤乙醇溶液，將青風藤乙醇溶液在微波功率為450~ 550W、提取溫度為55~65°C條件下，提取10~20min，冷卻后用真空抽濾栗抽濾，得濾液，棄 去藥渣，然后將濾液轉移至25mL容量瓶中定容，于3~5 °C冰箱保存。
【文檔編號】G01N30/06GK105929069SQ201610264132
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月26日
【發(fā)明人】王麗麗, 劉獻祥, 陳國南, 葉蕻芝, 許惠鳳
【申請人】福建中醫(yī)藥大學