專利名稱：利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和化學模糊識別研究中藥復雜成分配伍相互作用的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥復雜成分的研究方法，具體涉及一種利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和化學模糊識別研究中藥復雜成分配伍相互作用的方法。
背景技術(shù)：
中醫(yī)藥是中華民族的瑰寶，經(jīng)過幾千年的臨床實踐檢驗，為中華民族的繁榮昌盛作出了巨大貢獻，至今仍發(fā)揮著重要作用，并逐步被世界人民所接受，中藥配伍是方劑中各藥味的內(nèi)在關(guān)系，而配伍相互作用規(guī)律是理、法、方、藥的核心內(nèi)容，是治病的重要理論和核心內(nèi)容，對它的理解和發(fā)展直接決定方藥的有效性與組方設(shè)計的合理性，更有助于提高臨床療效及中藥創(chuàng)新藥物水平。各種藥物單獨作用于人體，可產(chǎn)生各自的藥理效應(yīng)。當多種藥物組合應(yīng)用時，由于它們的相互作用，藥物之間或藥物與機體間的相互影響和干擾，改變了其中一種藥物的原有理化性質(zhì)、體內(nèi)過程(吸收、分布、生物轉(zhuǎn)化和排泄)或是組織對該藥物的敏感性，從而改變了藥物的藥理效應(yīng)和毒理效應(yīng)，可使藥效加強或副作用減輕，也可使藥效減弱或出現(xiàn)不應(yīng)有的毒副作用，甚至可出現(xiàn)一些奇特的不良反應(yīng)，危害服藥者。與多數(shù)化學藥物相比，中藥的多組分、多靶點特性決定了藥物相互作用及其機制更為復雜?；瘜W成分相互作用是揭示中藥配伍機理的重要內(nèi)容，配伍前后化學成分變化的定性定量分析是我們研究的首要任務(wù)。然而中藥所含成分的復雜性使得化學成分的準確與完整鑒定成為研究工作者的一個挑戰(zhàn)。雖然許多學者通過與對照品和文獻數(shù)據(jù)比較分析鑒定了一些中藥及其制劑的化學成分，對照品的難以獲得及中藥許多成分仍不清楚卻是一個不爭的事實。前期報道采用LC/MS分析與能量中性丟失、特征離子過濾等分析策略鑒定了更多的目標或非目標成分，但是沒有足夠的對照化合物，這些方法和策略都還不能準確鑒定中藥的復雜成分，尤其是一些同分異構(gòu)化合物?；诂F(xiàn)有技術(shù)的不足，很有必要在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)之上，設(shè)計開發(fā)一種操作方便，可有效研究中藥復雜成分配伍相互作用變化規(guī)律的研究方法。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的:本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種靈敏、精確，檢測效率高，適用范圍廣泛的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-PDA-MS)技術(shù)和“化學模糊識另IJ”方法，該方法可以克服現(xiàn)有技術(shù)中藥復雜成分鑒定中鑒定步驟復雜、對照品稀缺、難以全面而準確鑒定結(jié)構(gòu)等缺點，同時又能滿足中藥復雜成分配伍相互作用變化規(guī)律研究的要求。技術(shù)方案:為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案為:一種中藥復雜成分配伍相互作用的研究方法，利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和化學模糊識別方法；
首先建立包括化合物名稱、結(jié)構(gòu)式、分子量、分子式、質(zhì)譜和紫外信息的中藥成分化學物質(zhì)庫，并經(jīng)過對照品峰的質(zhì)譜信息，包括碎片離子或裂解規(guī)律分析，建立中藥中主要類別化合物質(zhì)譜信號網(wǎng)絡(luò)，并通過質(zhì)譜信號網(wǎng)絡(luò)將所研究中藥中的不同成分進行快速鑒別與歸類，對已歸類的化學物質(zhì)進行定量分析，繪制已歸類的化學物質(zhì)的配比-溶出變化曲線，進而分析中藥復雜成分配伍相互作用變化規(guī)律及特點。作為優(yōu)選方案，以上所述的中藥復雜成分配伍相互作用研究方法，所述的定量分析方法為采用超高效液相色譜與三重四級桿質(zhì)譜及PDA紫外檢測技術(shù)聯(lián)用對樣品中成分進行定量分析。作為優(yōu)選方案，以上所述的中藥復雜成分配伍相互作用研究方法，所述的主要類別化合物包括三萜類、黃酮類、苯丙素類、蒽醌類、香豆素類、木質(zhì)素類、有機酸或生物堿類
坐寸O本發(fā)明提供的利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和化學模糊識別方法對甘遂-甘草配伍相互作用的研究方法，它包括以下步驟:(I)對照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的對照品適量，加甲醇制成濃度分別為0.147 μ g/mL的KansuininA70.117 μ g/mL 的 3-0-(2' E，4' Z-癸二烯酰基)-20-0-乙?；薮箨拼迹?br> 0.175 μ g/mL 的 kansenone, 202 μ g/mL 的大戟醇，1.25 μ g/mL 的甘草素，5.08 μ g/mL 的異甘草苷和13.31 μ g/mL的甘草酸的混合對照品儲備液，以此作為I號混合對照品溶液；精密吸取I號混合對照品溶液5mL置IOmL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻得2號混合對照品溶液，同法采用逐級稀釋法制得3 8號混合對照品溶液，各對照品溶液在進樣前經(jīng)13000r/min離心IOmin,并經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜濾過；(2)供試液的制備:精密稱取重量比例為10:1，5:1，3:1，3:2，3:3，3:4.5，3:9，3:15,3:30,的甘遂-甘草藥材及甘遂、甘草單味藥各1.0g，分別置于50mL具塞錐形瓶中，力口20mL甲醇，回流提取2h,然后取上清液,經(jīng)13000r/min離心IOmin,再經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，各供試品溶液平行制備6份，各供試品溶液進樣前再分別用甲醇稀釋40倍；(3)色譜條件=ThermoC18柱，流動相為=A相:0.1%甲酸水和B相:乙腈；梯度洗脫條件:0-8min:10-55%B ;8_16min:55-80%B ;16_24min:80-100%B ;24_31min:100%B ；31-32min:100-10%B ;32_37min:10%B ;流速為 0.4mL/min，柱溫 35°C，進樣量為 2μ L ；(4)質(zhì)譜條件與紫外條件TQ-MS掃描方式為ESI土，掃描范圍為m/zl00-1000，毛細管電壓為3kV，離子源溫度為150°C，去溶劑化溫度為550°C，錐孔氣流速度為50L/h，去溶劑化氣流速度為1000L/h，定量檢測與分析所用采集方式為多反應(yīng)監(jiān)測；紫外檢測采用PDA檢測器，檢測波長范圍為190_400nm ；(5)化學模糊識別方法化學模糊識別包括四個步驟:分別建立甘遂和甘草中化學物質(zhì)的化合物名稱、結(jié)構(gòu)式、分子量、分子式、質(zhì)譜和紫外信息的化學物質(zhì)庫；選擇甘遂和甘草藥材中不同類型化合物中含量較高的已知化合物作為對照品，SP步驟(I)制備的對照品溶液，然后選擇步驟(2)甘遂、甘草單味藥及甘遂與甘草配伍藥材的供試品液進樣，在全掃描圖譜中根據(jù)保留時間、質(zhì)譜和紫外信息找到對照品峰，這些對照品的碎片信息和裂解途徑將為其它化合物的歸類提供依據(jù)；根據(jù)所建立的甘遂、甘草化學物質(zhì)庫，在全掃描圖譜中查找響應(yīng)化合物的分子量，通過質(zhì)譜信息和紫外信息比較，可將化合物的基本母核結(jié)構(gòu)確定，不同母核化合物歸為不同組，這些首先被選擇并歸類為不同組的化合物成為先驅(qū)化合物，根據(jù)這些先驅(qū)化合物的質(zhì)譜信息和裂解途徑的研究，選擇至少被三個先驅(qū)化合物所共有的質(zhì)譜碎片信息或裂解途徑作為判斷這類母核化合物的依據(jù)，并建立相應(yīng)不同母核化合物組的網(wǎng)絡(luò)用于其它含有相同母核的化合物的歸類，最后，根據(jù)相應(yīng)化合物組網(wǎng)絡(luò)，將還未歸類的化合物依據(jù)其質(zhì)譜信息進行歸類；(6)定量分析對所測樣品中化合物的定量分析選擇三重四級桿質(zhì)譜技術(shù)中的多離子反應(yīng)監(jiān)測檢測模式及PDA聯(lián)用方法，對于有質(zhì)譜響應(yīng)的化合物，采用多離子反應(yīng)監(jiān)測定量分析；沒有質(zhì)譜響應(yīng)但有紫外相應(yīng)的化合物采用PDA紫外定量分析，以相應(yīng)類型化合物對照品做標準曲線，同一類型化合物的定量均用同一個標準品的標準曲線進行定量分析。UPLC在中藥等復雜體系的分離分析上具有明顯優(yōu)勢，具有超高壓、超高靈敏度、超高分離度等特點。三重四級桿質(zhì)譜(TQ/MS)技術(shù)具有選擇性高、靈敏度高等優(yōu)點，超高效液相色譜與三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-TQ/MS)是目前科研中應(yīng)用較好的樣品成分分析方法，也是目前分析中藥復雜物質(zhì)組分的最有力工具之一。本實驗中，運用UPLC-TQ/MS技術(shù)分析鑒定甘遂-甘草中6大類化學成分。其中甘遂中巨大戟烷型二萜、假白欖酮型二萜、以kansenone為代表的三萜和甘草中苯丙素苷元及苷類化合物在ESI+檢測模式下質(zhì)譜響應(yīng)均較好，甘草中三萜皂苷類化合物在ES1-檢測模式下響應(yīng)較好；而以大戟醇為代表的三萜在ESI+和ES1-模式下均無質(zhì)譜響應(yīng)，但有UV信號。因此，為了同時分析這些成分，包括大戟醇，本發(fā)明采用TQ/MS與PDA檢測器聯(lián)用的技術(shù)。作為優(yōu)選方案，以上所述的利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和化學模糊識別方法對甘遂-甘草配伍相互作用的研究方法，甘草中歸類的先驅(qū)化合物包括三萜皂苷類、苯丙素苷及苷元類；甘遂中歸類的先驅(qū)化合物包括巨大戟烷型二萜、假白欖酮型二萜及大戟烷型三萜。本發(fā)明提供的利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和化學模糊識別方法對甘遂-甘草配伍相互作用的研究方法，可以研究包含有甘遂或甘草的其它臨床使用的中藥復方的配伍規(guī)律研究。并且本發(fā)明提供的研究方法不僅可用于中藥復雜成分相互作用研究，而且在環(huán)境、農(nóng)業(yè)和生物樣品的復雜體系中比較化學和化學變化規(guī)律的研究也可得到廣泛應(yīng)用。有益效果:本發(fā)明提供的利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和化學模糊識別研究中藥復雜成分配伍相互作用的方法和現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點:本發(fā)明提供的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-PDA-MS)技術(shù)和“化學模糊識別”方法，具有靈敏、精確、穩(wěn)定可靠、檢測效率高、適用范圍廣泛、自動化程度高、可操作性強等優(yōu)點，該方法可以克服現(xiàn)有技術(shù)中藥復雜成分鑒定中鑒定步驟復雜、對照品稀缺、難以全面而準確鑒定結(jié)構(gòu)等缺點，同時又能滿足中藥復雜成分配伍相互作用變化規(guī)律研究的要求。
另外本發(fā)明提供的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-PDA-MS)技術(shù)和“化學模糊識別”方法，通過色譜條件與質(zhì)譜條件、TQ-MS和PDA檢測條件的等進行了系統(tǒng)優(yōu)化，確定了最佳的檢測方法，方法學檢測結(jié)果表明該方法具有靈敏度高，精密度和準確度高，重復性好，穩(wěn)定可靠的優(yōu)點。


圖1為甘遂和甘草樣品的總離子流圖及紫外吸收圖譜。圖2為苯丙素苷元類網(wǎng)絡(luò)圖。圖3為巨大戟烷型二萜類網(wǎng)絡(luò)圖。圖4為甘遂-甘草樣品中選擇測試化合物的MRM圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明的各種等價形式的修改均落于本申請所附權(quán)利要求所限定的范圍。本發(fā)明采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和化學模糊識別方法對甘遂-甘草配伍相互作用的研究方法，它包括以下步驟:一、試驗方法1.1儀器和材料Acquity UPLC 系統(tǒng)-PDA 檢測器(Waters 公司)；Xevo TQ 質(zhì)譜儀(Waters 公司)；BT125電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司);EPED超純水系統(tǒng)(南京易普達易科技發(fā)展有限公司)。乙腈、甲醇(色譜純,Fisher Scientific公司)；甲酸(分析純,Merck公司);超純水(自制)。大戟醇，甘草酸，異甘草苷，甘草素，甘遂職酯A, kansenone,3-0-(2' E, 4' Z-癸二烯?；?-20-0-乙酰基巨大戟二萜醇對照品為實驗室自制，其結(jié)構(gòu)通過1H-NMR及MS鑒定。以上各對照品經(jīng)歸一化法測定純度均大于98%。1.2對照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的對照品適量，加甲醇制成濃度分別為KansuininA (EK_1，
0.147μ g/mL)，3-0-(2 ' E，4 ' Z-癸二 烯?；?-20-0-乙酰基巨大戟 二萜醇(EK-2，
0.117 μ g/mL), kansenone (EK-3,0.175 μ g/mL),大戟醇(EK-4, 202 μ g/mL),甘草素(GU-1，
1.25 μ g/mL),異甘草苷(⑶-2，5.08 μ g/mL)和甘草酸(⑶_3，13.31 μ g/mL)的混合對照品儲備液，以此作為I號混合對照品溶液。精密吸取I號混合對照品溶液5mL置IOmL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻得2號混合對照品溶液，同法采用逐級稀釋法制得3 8號混合對照品溶液。各對照品溶液在進樣前經(jīng)13000r/min離心IOmin,并經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜濾過。所有的對照品溶液均在4° C條件下儲藏。1.3供試品溶液的制備精密稱取不同重量比例甘遂-甘草藥材(10:1，5:1，3:1，3:2，3:3，3:4.5,3:9,3:15,3:30,3:60, 3:120, g/g)及甘遂、甘草單味藥的干燥粉末(過40目篩)各1.0g置于50mL具塞錐形瓶中，加20mL甲醇，回流提取2h。取上清液，經(jīng)13000r/min離心lOmin，再經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。各供試品溶液平行制備6份。各供試品溶液進樣前再分別用甲醇稀釋40倍一起進樣。1.4色譜條件Thermo C18 柱(IOOmmX 2.1mm, 1.7 μ m)，流動相為 0.1% 甲酸水(A)和乙腈(B);梯度洗脫條件:0-8min:10-55%B ;8_16min:55-80%B ;16_24min:80-100%B ;24_31min:100%B ；31-32min:100-10%B ;32_37min:10%B ;流速為 0.4mL/min，柱溫 35°C，進樣量為 2μ L。為了在較短時間內(nèi)使相鄰色譜峰得到較好的分離，本發(fā)明對色譜條件進行了優(yōu)化。首先對色譜柱進行了選擇與優(yōu)化。Acquity HSS T3色譜柱(100mmX2.lmm, 1.8 μ m)和Thermo C18色譜柱(2.1mmX 100mm, 1.7 μ m)經(jīng)過比較,表明后者具有較好的分離能力，且峰型更好。因而實驗中選用了 Thermo C18色譜柱(2.1mmX 100mm, 1.7 μ m)。鑒于所分析成分中有的化合物其紫外吸收為末端吸收，因此為了避免空白溶劑吸收的影響，選擇了乙腈-水作為溶劑系統(tǒng)。當在水中加入一定量甲酸時，峰的分離度更高，沒有拖尾，因此選擇0.1%的甲酸水溶液為水相進行梯度洗脫。柱溫以及流速均進行了考察。結(jié)果顯示，Thermo C18色譜柱、乙腈-0.1%酸水為流動相，柱溫35° C、流速0.4mL/min時，樣品在37min內(nèi)能得到很好的分離。1.5質(zhì)譜條件與紫外條件TQ-MS掃描方式為ESIi，掃描范圍為m/z 100-1000，毛細管電壓為3kV，離子源溫度為150°C，去溶劑化溫度為550°C，錐孔氣流速度為50L/h，去溶劑化氣流速度為1000L/h。定量檢測與分析所用采集方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，每個化合物的檢測條件經(jīng)優(yōu)化選擇合適的錐孔電壓和碰撞電壓。紫外檢測采用PDA檢測器，檢測波長范圍為190-400nm。本發(fā)明樣品溶液先分別在正、負離子檢測模式下進樣，通過比較全離子掃描圖及相應(yīng)強度發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)化合物在正離子模式下具有較好的相應(yīng)強度，而甘草中三萜苷類化合物在負離子檢測模式下響應(yīng)更好。另外，甘遂中的三萜類化合物，有些沒有質(zhì)譜響應(yīng)，例如euphol，但具有紫外響應(yīng)。對于這一類化合物，我們選擇PDA檢測，并優(yōu)化了檢測波長。在190-400nm范圍內(nèi)，euphol的最大吸收波長在205nm。1.6峰的選擇與數(shù)據(jù)處理甘遂、甘草中存在幾種不同類型的化合物。在本發(fā)明中，具有一定響應(yīng)強度的峰被選擇作為檢測對象用來檢測并分析化合物間相互作用。甘草中，被檢測化合物的峰的響應(yīng)強度應(yīng)大于10000000 ;甘遂中，被檢測化合物的峰的響應(yīng)強度應(yīng)大于100000。這些化合物的母離子通過全掃描獲得，子離子由相應(yīng)的子離子掃描獲得。1.7化學模糊識別化學模糊識別包括四個步驟:分別建立甘遂和甘草中化學物質(zhì)的化合物名稱、結(jié)構(gòu)式、分子量、分子式、質(zhì)譜和紫外信息的化學物質(zhì)庫；選擇甘遂和甘草藥材中不同類型化合物中含量較高的已知化合物作為對照品，SP步驟(I)制備的對照品溶液，然后選擇步驟(2)甘遂、甘草單味藥及甘遂與甘草配伍藥材的供試品液進樣，在全掃描圖譜中根據(jù)保留時間、質(zhì)譜和紫外信息找到對照品峰，這些對照品的碎片信息和裂解途徑將為其它化合物的歸類提供依據(jù)；根據(jù)所建立的甘遂、甘草化學物質(zhì)庫，在全掃描圖譜中查找響應(yīng)化合物的分子量，通過質(zhì)譜信息和紫外信息比較，可將化合物的基本母核結(jié)構(gòu)確定，不同母核化合物歸為不同組，這些首先被選擇并歸類為不同組的化合物成為先驅(qū)化合物，根據(jù)這些先驅(qū)化合物的質(zhì)譜信息和裂解途徑的研究，選擇至少被三個先驅(qū)化合物所共有的質(zhì)譜碎片信息或裂解途徑作為判斷這類母核化合物的依據(jù)，并建立相應(yīng)不同母核化合物組的網(wǎng)絡(luò)用于其它含有相同母核的化合物的歸類，最后，根據(jù)相應(yīng)化合物組網(wǎng)絡(luò)，將還未歸類的化合物依據(jù)其質(zhì)譜信息進行歸類。1.8UPLC-PDA-MS定量分析方法優(yōu)化對所測樣品中化合物的定量分析選擇TQ-MS中的MRM檢測模式及PDA聯(lián)用方法。對于有質(zhì)譜響應(yīng)的化合物，在最優(yōu)錐孔電壓、碰撞電壓等條件下采用MRM定量分析；沒有質(zhì)譜響應(yīng)但有紫外相應(yīng)的化合物采用紫外定量分析。以相應(yīng)類型化合物對照品做標準曲線，同一類型化合物的定量均用同一個標準品的標準曲線進行定量分析。1.8.1線性關(guān)系、最低檢測限(LOD)和最低定量限(LOQ)的考察取I號混合對照品溶液，加甲醇分別稀釋成不同濃度的2 8號混合對照品溶液，在上述1.4色譜條件和1.5質(zhì)譜條件下，分別進樣2 μ L，然后采用UPLC-PDA-TQ-MS分析，以峰面積為縱坐標y，對照品溶液濃度(μ g/mL)為橫坐標X，進行線性回歸。最低檢測限LOD和最低定量限LOQ分別在信號對噪音比值為3和10時測定。各對照品在相對較寬的濃度范圍內(nèi)顯示出較好的線性相關(guān)(如表I所示)。表1.線性回歸方程及LOD和LOQ測定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種中藥復雜成分配伍相互作用的研究方法，其特征在于，利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和化學模糊識別方法； 該方法首先建立包括化合物名稱、結(jié)構(gòu)式、分子量、分子式、質(zhì)譜和紫外信息的中藥成分化學物質(zhì)庫，并經(jīng)過對照品峰的質(zhì)譜信息，包括碎片離子或裂解規(guī)律分析，建立中藥中主要類別化合物質(zhì)譜信號網(wǎng)絡(luò)，并通過質(zhì)譜信號網(wǎng)絡(luò)將所研究中藥中的不同成分進行快速鑒別與歸類，對已歸類的化學物質(zhì)進行定量分析，繪制已歸類的化學物質(zhì)的配比-溶出變化曲線，進而分析中藥復雜成分配伍相互作用變化規(guī)律及特點。
2.根據(jù)權(quán)利要求2所述的中藥復雜成分配伍相互作用研究方法，其特征在于，所述的定量分析方法為采用超高效液相色譜與三重四級桿質(zhì)譜及PDA紫外檢測技術(shù)聯(lián)用對樣品中成分進行定量分析。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的中藥復雜成分配伍相互作用研究方法，其特征在于，所述的主要類別化合物包括三萜類、黃酮類、苯丙素類、蒽醌類、香豆素類、木質(zhì)素類、有機酸或生物堿類。
4.利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和化學模糊識別方法對甘遂-甘草配伍相互作用的研究方法，其特征在于，它包括以下步驟: (1)對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的對照品適量，加甲醇制成濃度分另1J 為 0.14 7 M- g / m L 的 Kansuinin A , 0.117 M- g / m L 的 3-0-(2 =4*Ζ -癸二烯?；?-20-0-乙酰基巨大戟二職醇，0.175 Kg/mL 的 kansenone, 202 Pg/mL的大戟醇，1.25 Pg/mL的甘草素,5.08 Pg/mL的異甘草苷和13.31 Pg/mL的甘草酸的混合對照品儲備液，以此作為I號混合對照品溶液； 精密吸取I號混合對照品溶液5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻得2號混合對照品溶液，同法采用逐級稀釋法制得3 8號混合對照品溶液，各對照品溶液在進樣前經(jīng).13000 r/min離心10 min,并經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜濾過； (2)供試液的制備:精密稱取重量比例為10:1，5:1,3:1, 3:2, 3:3, 3:4.5，3:9,3:15, 3:30,的甘遂-甘草藥材及甘遂、甘草單味藥各1.0 g，分別置于50 mL具塞錐形瓶中，加20 mL甲醇，回流提取2 h，然后取上清液，經(jīng)13000 r/min離心10 min，再經(jīng)0.22 μπι微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，各供試品溶液平行制備6份，各供試品溶液進樣前再分別用甲醇稀釋40倍； (3)色譜條件=ThermoC18柱，流動相為:Α相:0.1 %甲酸水和B相:乙腈；梯度洗脫條件:0-8min:10-55% B ;8_16min:55-80% B ;16_24min:80-100% B ;24_31 min:100 % B ；31-32 min:100-10 % B ;32_37 min:10% B ;流速為 0.4 mL/min，柱溫 35 °C，進樣量為 2μ L ； (4)質(zhì)譜條件與紫外條件 TQ-MS掃描方式為ESI 土，掃描范圍為m/z 100-1000，毛細管電壓為3 kV，離子源溫度為150 °C，去溶劑化溫度為550 °C，錐孔氣流速度為50 L/h，去溶劑化氣流速度為1000 L/h，定量檢測與分析 所用采集方式為多反應(yīng)監(jiān)測；紫外檢測采用PDA檢測器，檢測波長范圍為 190-400 nm ； (5)化學模糊識別方法化學模糊識別包括四個步驟: 分別建立甘遂和甘草中化學物質(zhì)的化合物名稱、結(jié)構(gòu)式、分子量、分子式、質(zhì)譜和紫外信息的化學物質(zhì)庫； 選擇甘遂和甘草藥材中不同類型化合物中含量較高的已知化合物作為對照品，然后選擇甘遂、甘草單味藥及配伍藥材提取液進樣，在全掃描圖譜中根據(jù)保留時間、質(zhì)譜和紫外信息找到對照品峰，這些對照品的碎片信息和裂解途徑將為其它化合物的歸類提供依據(jù)； 根據(jù)所建立的甘遂、甘草化學物質(zhì)庫，在全掃描圖譜中查找響應(yīng)化合物的分子量，通過質(zhì)譜信息和紫外信息比較，可將化合物的基本母核結(jié)構(gòu)確定，不同母核化合物歸為不同組，這些首先被選擇并歸類為不同組的化合物成為先驅(qū)化合物，根據(jù)這些先驅(qū)化合物的質(zhì)譜信息和裂解途徑的研究，選擇至少三個先驅(qū)化合物所共有的質(zhì)譜碎片信息或裂解途徑作為判斷這類母核化合物的依據(jù)，并建立相應(yīng)不同母核化合物組的網(wǎng)絡(luò)用于其它含有相同母核的化合物的歸類，最后，根據(jù)相應(yīng)化合物組網(wǎng)絡(luò)，將還未歸類的化合物依據(jù)其質(zhì)譜信息進行歸類； (6)定量分析 對已歸類樣品中化合物的定量分析選擇三重四級桿質(zhì)譜技術(shù)中的多離子反應(yīng)監(jiān)測檢測模式及PDA聯(lián)用方法，對于有質(zhì)譜響應(yīng)的化合物，采用多離子反應(yīng)監(jiān)測定量分析；沒有質(zhì)譜響應(yīng)但有紫外相應(yīng)的化合物采用PDA紫外定量分析，以相應(yīng)結(jié)構(gòu)類型化合物對照品做標準曲線，同一結(jié)構(gòu)類型化合物的定量均用同一個標準品的標準曲線進行定量分析。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和化學模糊識別方法對甘遂-甘草配伍相互作用的研究方法，其特征在于，甘草中歸類的先驅(qū)化合物包括三萜皂苷類、苯丙素苷及苷元類；甘遂中歸類的先驅(qū)化合物包括巨大戟烷型二萜、假白欖酮型二萜及大戟烷型三萜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-PDA-MS)技術(shù)和“化學模糊識別”對中藥復雜成分配伍相互作用進行研究的方法。本發(fā)明通過大量實驗對色譜條件與質(zhì)譜條件、TQ-MS和PDA檢測條件等進行了系統(tǒng)優(yōu)化，確定了最佳的檢測方法，方法學檢測結(jié)果表明該方法具有靈敏度高，精密度和準確度高，重復性好，穩(wěn)定可靠的優(yōu)點法，該方法可以克服中藥復雜成分鑒定中鑒定步驟復雜、對照品稀缺、難以全面而準確鑒定結(jié)構(gòu)等缺點，同時又能滿足中藥復雜成分配伍相互作用變化規(guī)律研究的要求。
文檔編號G01N30/86GK103163267SQ201310091479
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月21日
發(fā)明者唐于平, 段金廒, 沈娟, 陶偉偉 申請人:南京中醫(yī)藥大學