一種篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的復(fù)合物及其應(yīng)用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的復(fù)合物及其應(yīng)用方法。利用受體-配體親和反應(yīng)原理，將中草藥樣品與黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子混合孵育，使中草藥樣品中活性成分的混合物與黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子混合，得到活性成分與酶負(fù)載的磁性納米粒子復(fù)合物。通過(guò)外界磁場(chǎng)作用進(jìn)行磁分離，將復(fù)合物采用甲醇-水的混合溶液脫附，收集脫附液，運(yùn)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)得到的活性成分進(jìn)行分離和鑒定。該方法避免了傳統(tǒng)篩選方法篩選時(shí)間較長(zhǎng)且有機(jī)溶劑消耗大的問(wèn)題，其操作簡(jiǎn)便、迅速、酶負(fù)載的磁性納米粒子復(fù)合物可重復(fù)使用，適于快速篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑，為尋找高活性的新型抗痛風(fēng)藥物奠定基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】一種篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的復(fù)合物及其應(yīng)用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于中藥成分篩選領(lǐng)域，涉及一種篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的復(fù)合物及其應(yīng)用方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]痛風(fēng)是由于嘌呤代謝紊亂導(dǎo)致血尿酸水平增高，或尿酸排泄減少而導(dǎo)致尿酸鹽在組織沉積的疾病，為臨床難治性疾病之一。其臨床特點(diǎn)是高尿酸血癥，尿酸鹽沉積所導(dǎo)致反復(fù)發(fā)作的急、慢性關(guān)節(jié)炎和軟組織損傷，尿酸性腎結(jié)石所致的痛風(fēng)性腎病。痛風(fēng)是一種非常古老的疾病，七千多年前出土的埃及木乃尹上就已發(fā)現(xiàn)尿酸鹽性腎結(jié)石。并且隨著現(xiàn)代經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人們生活水平的提高以及生活方式的改變，蛋白類食品成倍增加，痛風(fēng)及高尿酸血癥的患病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)。我國(guó)痛風(fēng)發(fā)病形勢(shì)尤其嚴(yán)峻，以增長(zhǎng)速度快、患者絕對(duì)數(shù)量龐大為特點(diǎn)，己有趨勢(shì)成為擁有世界上最多痛風(fēng)病患者的國(guó)家。
[0003]高尿酸血癥是痛風(fēng)的生化標(biāo)志。尿酸的產(chǎn)生與排出之間的平衡關(guān)系決定了尿酸在細(xì)胞外液的濃度。尿酸生成量超過(guò)其排泄，就會(huì)產(chǎn)生尿酸累積，進(jìn)而出現(xiàn)血尿酸增高。在人體內(nèi)尿酸的生成過(guò)程中黃嘌呤氧化酶起著非常重要的作用。通過(guò)抑制黃嘌呤氧化酶的活性，可降低體內(nèi)的尿酸生成量，從而緩解高尿酸血癥而減少痛風(fēng)的發(fā)生。并且，黃嘌呤氧化酶在催化反應(yīng)過(guò)程中，還會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，對(duì)人體造成更廣泛的損害。為了減少人體內(nèi)尿酸及自由基的形成，可通過(guò)抑制劑對(duì)黃嘌呤氧化酶的活力進(jìn)行抑制來(lái)實(shí)現(xiàn)。目前在臨床上使用的黃嘌呤氧化酶抑制劑只有別嘌醇，但是別嘌醇具有很多的毒副作用。因此發(fā)現(xiàn)和尋找新的黃嘌呤氧化酶抑制劑具有十分重要的意義。
[0004]傳統(tǒng)的從中草藥或天然藥物中篩選活性成分，往往首先通過(guò)柱層析、萃取、制備色譜等各種分離手段對(duì)復(fù)雜體系的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)分離與結(jié)構(gòu)鑒定，再對(duì)得到的單體成分進(jìn)行活性測(cè)試，最終尋找到活性成分。但這種方法在操作過(guò)程中存在操作繁瑣、工作量大、周期長(zhǎng)、目標(biāo)不明確、活性成分在分離過(guò)程中易丟失等不足，且大量的時(shí)間與精力花費(fèi)在已知物質(zhì)的分離鑒定上。隨著對(duì)中草藥的研究越發(fā)深入，對(duì)微量活性成分分析需求的增加，如何從中草藥等復(fù)雜體系中快速、高效地篩選出活性成分，成為現(xiàn)代藥物研究的重要課題之一。
[0005]四氧化三鐵磁性納米粒子不僅具有磁性材料的磁分離效應(yīng)，還具備納米材料的量子尺寸效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)等性質(zhì)，廣泛應(yīng)用于冶金、磁學(xué)和生物學(xué)等領(lǐng)域。磁性納米粒子具有超順磁性，易在外加磁場(chǎng)作用下從反應(yīng)體系中分離和回收，被廣泛用作制備固定化酶的載體材料。相比于游離酶在分離和重復(fù)使用上的不足，磁性材料固定化酶具有快速與反應(yīng)物分離、較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)重復(fù)使用、提高酶的穩(wěn)定性、提高酶的使用效率、降低成本等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明利用四氧化三鐵磁性納米粒子的特點(diǎn)，將其用黃嘌呤氧化酶修飾，制備篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的復(fù)合物，取得了很好的效果。

【發(fā)明內(nèi)容】
:[0006]本發(fā)明的目的是基于現(xiàn)有中草藥中黃嘌呤氧化酶抑制劑的篩選步驟較為繁瑣，時(shí)間較長(zhǎng)且耗費(fèi)有機(jī)溶劑的問(wèn)題，提供一種用于篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的復(fù)合物及其應(yīng)用方法。本發(fā)明以黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子為篩選載體，利用受體-配體親和反應(yīng)原理，從中草藥樣品中篩選到與受體黃嘌呤氧化酶結(jié)合的配體，再經(jīng)過(guò)脫附、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)，能夠?qū)崿F(xiàn)快速篩選鑒定中草藥中的黃嘌呤氧化酶抑制齊?。該復(fù)合物制備過(guò)程簡(jiǎn)單、安全無(wú)毒、成本低廉，可重復(fù)使用。用于篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的方法過(guò)程簡(jiǎn)單、安全可靠、能高效快速的篩選出黃嘌呤氧化酶抑制劑，并能夠?yàn)閷ふ倚滦涂雇达L(fēng)藥物奠定基礎(chǔ)。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:
[0008]一種篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的復(fù)合物，是通過(guò)戊二醛作為交聯(lián)劑，將黃嘌呤氧化酶固定在氨基化的四氧化三鐵納米粒子表面，得到的黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子。
[0009]所述的氨基化是將四氧化三鐵納米粒子分散在乙醇溶液中，通過(guò)3-氨丙基三乙氧基硅烷進(jìn)行表面氣基化處理。
[0010]上述復(fù)合物具體是將粒徑在30~220nm的四氧化三鐵納米粒子分散在乙醇溶液中形成濃度為0.l-2mg/mL的四氧化三鐵納米粒子分散液，取50_200mL分散液，并向溶液中逐滴滴加0.4-8mL3-氨丙基三乙氧基硅烷；室溫下攪拌4_8小時(shí)后過(guò)濾用乙醇溶液洗滌三次，置于50°C真空干燥箱中干燥； l_10mg氨基化的四氧化三鐵納米粒子分散在1-1OmL的5wt%的戊二醛溶液中并攪拌0.5-2小時(shí)，反應(yīng)后通過(guò)磁分離去除上清溶液，將l_4mL濃度為180 μ g/mL的黃嘌呤氧化酶的pH值為7的IOmM的磷酸鹽緩沖液溶液，加入到磁性納米粒子中振蕩反應(yīng)0.5-4小時(shí)；得到的黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子用磷酸鹽緩沖液洗滌后待用。
[0011]所述的篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的復(fù)合物的應(yīng)用方法，
[0012]將黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子與中草藥提取液孵育，再通過(guò)外界磁場(chǎng)進(jìn)行磁分離得到活性成分與黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子復(fù)合物，將復(fù)合物采用甲醇-水的混合溶液脫附，收集脫附液，運(yùn)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)得到的活性成分進(jìn)行分離和鑒定，得到黃嘌呤氧化酶抑制劑。
[0013]所述孵育是將10_40mg黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子復(fù)合物加入到l-4mL中草藥提取液中，在25°C下振蕩0.5-3小時(shí)，之后磁分離收集磁性納米粒子，并用磷酸鹽緩沖液洗滌后，加入l-4mL80%的甲醇溶液并振蕩1-1Omin脫附已結(jié)合的活性成分。
[0014]中藥提取液的制備:將原料按照固液質(zhì)量比為1:10的比例，用95%的乙醇溶液在85°C回流提取3小時(shí)，減壓蒸餾至95%的乙醇溶劑全部蒸除得到浸膏；將上述浸膏按照固液質(zhì)量比為1:100的比例用二次蒸餾水溶解，分別用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃?。环謩e通過(guò)減壓蒸餾蒸除其中的有機(jī)溶劑，得到干膏狀石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位樣品；將各部位樣品按照固液 質(zhì)量比為1:100用100%甲醇溶液溶解，分別過(guò)0.45 μ m濾膜備用。
[0015]所述的中藥提取液選自葛花提取物或甘草提取物。
[0016]在從中草藥樣品葛花提取液中篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑時(shí)，高效液相色譜的檢測(cè)條件為:
[0017]色譜柱:ffatersSunFire? C18色譜柱規(guī)格為 250mmX4.6mm 1.d., 5 μ m ;流動(dòng)相:A相:含0.4%醋酸的水，B相:含0.4%醋酸的乙腈；梯度洗脫程序:t=0?12min，25%B相+75%A相；t = 12 ?15min，25 ?30%B 相 +75 ?70%A 相；t = 15 ?30min，30 ?38%B 相 +70 ?62%A 相；t = 30 ?33min，38 ?75%B 相 +62 ?25%A 相；流速:0.8mL/min ;柱溫:25°C;進(jìn)樣量:20 μ L ;
[0018]在從中草藥樣品甘草提取液中篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑時(shí)，高效液相色譜的檢測(cè)條件為:
[0019]色譜柱:WatersSunFire? C18 色譜柱規(guī)格為 250mmX4.6mm 1.d., 5 μ m ;流動(dòng)相:A相:含0.4%醋酸的水，B相:含0.4%醋酸的乙腈；梯度洗脫程序:t=0?lOmin，25%B相+75%A 相；t = 10 ?20min，25 ?30%B 相 +75 ?70%A 相；t = 20 ?35min，30 ?50%B 相+70 ?50%A 相；t = 35 ?45min, 50%B 相 +50%A 相；t = 45 ?60min, 50 ?80%B 相 +50 ?20%A 相；流速:0.8mL/min ;柱溫:25°C ;進(jìn)樣量:20 μ L。
[0020]所述的篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的復(fù)合物還可以用于制備篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的制劑。
[0021]本發(fā)明的中草藥樣品可以包含天然產(chǎn)物提取物或中藥復(fù)方提取物。
[0022]作為優(yōu)選，孵育條件為在25°C下孵育I小時(shí)。
[0023]作為優(yōu)選，脫附條件為在25°C下反應(yīng)lmin。
[0024]作為優(yōu)選，本發(fā)明中孵育和脫附時(shí)振蕩的條件為50?200轉(zhuǎn)/min。
[0025]進(jìn)一步優(yōu)選的孵育和脫附時(shí)振蕩的條件為100轉(zhuǎn)/min。
[0026]作為優(yōu)選，活性成分與黃嘌呤氧化酶負(fù)載的磁性納米粒子復(fù)合物在孵育后用pH值為7的IOmM的磷酸鹽緩沖液清洗。
[0027]進(jìn)一步優(yōu)選，孵育后，活性成分與黃嘌呤氧化酶負(fù)載的磁性納米粒子復(fù)合物用pH值為7的IOmM的磷酸鹽緩沖液清洗三次，每次用2mL的IOmM的磷酸鹽緩沖液洗去表面非特異性吸附的小分子物質(zhì)。
[0028]從中草藥樣品葛花提取物中篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑時(shí)，質(zhì)譜的檢測(cè)條件為:
[0029]采用負(fù)離子電離模式，流速為0.2mL/min，掃描范圍:m/zl00-1200，實(shí)驗(yàn)前質(zhì)量數(shù)均經(jīng)過(guò)校正。噴霧電壓為3.5kV，金屬加熱毛細(xì)管溫度350°C，金屬毛細(xì)管電壓5V，殼氣流速為300mL/min,輔助氣流速為50mL/min。
[0030]從中草藥樣品甘草提取物中篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑時(shí)，質(zhì)譜的檢測(cè)條件可以為:
[0031]電噴霧負(fù)離子模式，流速為0.2mL/min,噴霧電壓4.0kV,金屬毛細(xì)管電壓5V，金屬毛細(xì)管加熱溫度350°C，殼氣流速為300mL/min，輔助氣流速為50mL/min，掃描范圍m/zlOO ?1000。
[0032]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
[0033]I)本發(fā)明首次制備出黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子的復(fù)合物用于篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑；該復(fù)合物制備過(guò)程簡(jiǎn)單、安全無(wú)毒、成本低廉，可重復(fù)使用；
[0034]2)本發(fā)明打破黃嘌呤氧化酶抑制劑篩選【技術(shù)領(lǐng)域】的常規(guī)思路，首次以黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子為篩選載體，利用受體-配體親和反應(yīng)原理，從中草藥樣品中篩選到與受體黃嘌呤氧化酶結(jié)合的配體，再經(jīng)過(guò)脫附、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)，能夠?qū)崿F(xiàn)快速篩選鑒定中草藥中的黃嘌呤氧化酶抑制劑。該方法過(guò)程簡(jiǎn)單、安全可靠、能高效快速的篩選出黃嘌呤氧化酶抑制劑，并能夠?yàn)閷ふ倚滦涂雇达L(fēng)藥物奠定基礎(chǔ)?？朔藗鹘y(tǒng)篩選方法步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，有機(jī)溶劑耗量大，且工作量大等問(wèn)題；
[0035]3 )此外，本發(fā)明用于篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的復(fù)合物還可以通過(guò)進(jìn)一步研究用于制備出其他多樣化的用于篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的制劑產(chǎn)品，為推廣使用奠定基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
[0036]圖1為實(shí)施例1中葛花提取物的高效液相色譜圖；其中，峰I為鳶尾苷，峰2為葛根素，峰3為大豆苷，峰4為3’ -甲氧基大豆苷，峰5為鳶尾黃素；
[0037]圖2為實(shí)施例1中葛花提取物與黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子孵育、脫附后的脫附液的高效液相色譜圖；其中，峰I為鳶尾苷，峰2為葛根素，峰3為大豆苷，峰4為3’ -甲氧基大豆苷，峰5為鳶尾黃素；
[0038]圖3為實(shí)施例2中甘草提取物的高效液相色譜圖；其中，峰I為異甘草苷，峰2為甘草素，峰3為甘草皂苷G2，峰4為二氫7-羥基-3- (4-羥苯基)-4-苯并吡喃酮，峰5為甘草酸，峰6為甘草香豆素；
[0039]圖4為實(shí)施例2中甘草提取物與黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子孵育、脫附后的脫附液的高效液相色譜圖；其中，峰I為異甘草苷，峰2為甘草素，峰3為甘草阜苷G2,峰4為二氫7-輕基-3-(4-輕苯基)-4-苯并批喃酮,峰5為甘草酸,峰6為甘草香豆素。
【具體實(shí)施方式】:
[0040]以下結(jié)合實(shí)施例旨在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0041]實(shí)施例1:
[0042]IOOmg粒徑在30?220nm的四氧化三鐵納米粒子分散在200mL乙醇溶液中，向溶液中逐滴滴加2mL3-氨丙基三乙氧基硅烷。室溫下攪拌6小時(shí)后用乙醇溶液洗滌三次，至于50°C真空干燥箱中干燥。2mg氨基化的四氧化三鐵納米粒子分散在2mL的戊二醛溶液中(5%w/v)并攪拌I小時(shí)，反應(yīng)后將磁分離得到的磁性納米粒子加入到4mL的黃嘌呤氧化酶溶液中(濃度為180 μ g/mL,并采用pH值為7的IOmM的磷酸鹽緩沖液配制)振蕩反應(yīng)2小時(shí)。得到黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子用磷酸鹽緩沖液洗滌后待用。
[0043]將20mg黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子加入到2mL葛花提取液中，在25°C下振蕩I小時(shí)。磁分離收集磁性納米粒子，并用磷酸鹽緩沖液洗滌三遍后，加入2mL80%的甲醇溶液并振蕩5min脫附已結(jié)合的活性成分，將脫附液收集并進(jìn)行高效液相色譜_質(zhì)譜分析。
[0044]葛花中藥提取液的制備:將原料按照固液質(zhì)量比為1:10的比例，用95%的乙醇溶液在85°C回流提取3小時(shí)，減壓蒸餾至95%的乙醇溶劑全部蒸除得到浸膏；將上述浸膏按照固液質(zhì)量比為1:100的比例用二次蒸餾水溶解，分別用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃??；分別通過(guò)減壓蒸餾蒸除其中的有機(jī)溶劑，得到干膏狀石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位樣品；將乙酸乙酯部位樣品按照固液質(zhì)量比為1:100用100%甲醇溶液溶解，過(guò)0.45 μ m濾膜備用。
[0045]用Dionex UltiMate3000型高效液相色譜儀進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè),條件如下:
[0046]色譜柱:ffatersSunFire? C18色譜柱(250mmX4.6mm 1.d., 5 μ m);流動(dòng)相:水(含
0.4%醋酸，A)和乙腈(含0.4%醋酸，B);梯度洗脫程序:t=0min,25%B(75%A) ;t=0~12min,25%B (75%A) ;t = 12 ~15min，25 ~30%B(75 ~70%A) ;t = 15 ~30min，30 ~38%B(70 ~62%A) ;t = 3O ~33min，38 ~75%B(62 ~25%A);流速:0.8mL/min ;柱溫:25°C ;進(jìn)樣量:20 μ L。
[0047]質(zhì)譜條件如下:
[0048]A Finnigan LCQdeca plus離子肼質(zhì)譜儀,采用負(fù)離子電離模式,流速為0.2mL/min,掃描范圍:m/zl00-1200，實(shí)驗(yàn)前質(zhì)量數(shù)均經(jīng)過(guò)校正。噴霧電壓為3.5kV，金屬加熱毛細(xì)管溫度350°C，金屬毛細(xì)管電壓5V，殼氣流速為300mL/min，輔助氣流速為50mL/min。
[0049]葛花提取物乙酸乙酯部位樣品中黃嘌呤氧化酶抑制劑質(zhì)譜鑒定信息見(jiàn)表1。
[0050]表1葛花提取物乙酸乙酯部位樣品中黃嘌呤氧化酶抑制劑質(zhì)譜鑒定
[0051]
【權(quán)利要求】
1.一種篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的復(fù)合物，其特征在于，是通過(guò)戊二醛作為交聯(lián)劑，將黃嘌呤氧化酶固定在氨基化的四氧化三鐵納米粒子表面，得到的黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的復(fù)合物，其特征在于， 將四氧化三鐵納米粒子分散在乙醇溶液中，通過(guò)3-氨丙基三乙氧基硅烷進(jìn)行表面氨基化處理。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的復(fù)合物，其特征在于， 將粒徑在30~220nm的四氧化三鐵納米粒子分散在乙醇溶液中形成濃度為0.l_2mg/mL的四氧化三鐵納米粒子分散液，取50-200mL分散液，并向溶液中逐滴滴加0.4_8mL3-氨丙基三乙氧基硅烷；室溫下攪拌4-8小時(shí)后過(guò)濾用乙醇溶液洗滌三次，置于50°C真空干燥箱中干燥；1-1Omg氨基化的四氧化三鐵納米粒子分散在1-1OmL的5wt%的戊二醛溶液中并攪拌0.5-2小時(shí)，反應(yīng)后通過(guò)磁分離去除上清溶液，將l_4mL濃度為180 μ g/mL的黃嘌呤氧化酶的pH值為7的IOmM的磷酸鹽緩沖液溶液，加入到磁性納米粒子中振蕩反應(yīng)0.5-4小時(shí)；得到的黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子用磷酸鹽緩沖液洗滌后待用。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的復(fù)合物的應(yīng)用方法，其特征在于， 將黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子與中草藥提取液孵育，再通過(guò)外界磁場(chǎng)進(jìn)行磁分離得到活性成分與黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子復(fù)合物，將復(fù)合物采用甲醇-水的混合溶液脫附，收集脫附液，運(yùn)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)得到的活性成分進(jìn)行分離和鑒定，得到黃嘌呤氧化酶抑制劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用方法，其特征在于，所述孵育是將10-40mg黃嘌呤氧化酶修飾的磁性納米四氧化三鐵粒子復(fù)合物加入到l_4mL中草藥提取液中，在25°C下振蕩0.5-3小時(shí)，之后磁分離收集磁性納米粒子，并用磷酸鹽緩沖液洗滌后，加入l-4mL80%的甲醇溶液并振蕩1-1Omin脫附已結(jié)合的活性成分。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用方法，其特征在于， 中藥提取液的制備:將原料按照固液質(zhì)量比為1:10的比例，用95%的乙醇溶液在85°C回流提取3小時(shí)，減壓蒸餾至95%的乙醇溶劑全部蒸除得到浸膏；將上述浸膏按照固液質(zhì)量比為1:100的比例用二次蒸餾水溶解，分別用等體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃?。环謩e通過(guò)減壓蒸餾蒸除其中的有機(jī)溶劑，得到干膏狀石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位樣品；將各部位樣品按照固液質(zhì)量比為1:100用100%甲醇溶液溶解，分別過(guò)0.45μπι濾膜備用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用方法，其特征在于，中藥提取液選自葛花提取物或甘草提取物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用方法，其特征在于， 在從中草藥樣品葛花提取液中篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑時(shí)，高效液相色譜的檢測(cè)條件為: 色譜柱:Waters SunFire? C18 色譜柱規(guī)格為 250mmX4.6mm 1.d., 5 μ m ;流動(dòng)相:A 相:含0.4%醋酸的水，B相:含0.4%醋酸的乙腈；梯度洗脫程序:t=0~12min，25%B相+75%A相；t = 12 ~15min，25 ~30%B 相 +75 ~70%A 相；t = 15 ~30min，30 ~38%B 相 +70 ~62%A 相；t = 30 ~33min，38 ~75%B 相 +62 ~25%A 相；流速:0.8mL/min ;柱溫:25°C;進(jìn)樣量:20 μ L ; 在從中草藥樣品甘草提取液中篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑時(shí)，高效液相色譜的檢測(cè)條件為: 色譜柱:Waters SunFire? C18 色譜柱規(guī)格為 250mmX4.6mm 1.d., 5 μ m ;流動(dòng)相:A 相:含0.4%醋酸的水，B相:含 0.4%醋酸的乙腈；梯度洗脫程序:t=0~lOmin，25%B相+75%A相；t = 10 ~20min，25 ~30%B 相 +75 ~70%A 相；t = 20 ~35min，30 ~50%B 相 +70 ~50%A 相；t = 35 ~45min，50%B 相 +50%A 相；t = 45 ~60min，50 ~80%B 相 +50 ~20%A 相；流速:0.8mL/min ;柱溫:25°C ;進(jìn)樣量:20 μ L。
9.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的復(fù)合物的應(yīng)用方法，其特征在于，用于制備篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的制劑。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103558306SQ201310529115
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月31日
【發(fā)明者】陳曉青, 劉亮亮, 施樹(shù)云 申請(qǐng)人:中南大學(xué)