呼吸道合胞病毒檢測(cè)試劑盒及使用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種呼吸道合胞病毒試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于酶免疫分析【技術(shù)領(lǐng)域】，本發(fā)明試劑盒采用咽拭子擦拭患兒咽部，通過(guò)鹽酸氨溴索藥物使咽拭子鼻咽分泌物溶解，經(jīng)高速離心后，沉淀物鼻咽上皮細(xì)胞加入到2.0ml含1.0％(V/V)Triton?X-100的磷酸鹽緩沖液中，靜置30min，劇烈震蕩，使呼吸道合胞病毒從咽上皮細(xì)胞脫落出來(lái)，取溶解液加入到呼吸道合胞病毒檢測(cè)酶標(biāo)板上，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)呼吸道合胞病毒，經(jīng)溫浴、洗滌、加生物素化抗呼吸道合胞病毒抗體，鏈霉親和素偶聯(lián)過(guò)氧化物酶復(fù)合物，再加入底物液，讀取結(jié)果。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏、準(zhǔn)確、廉價(jià)的檢測(cè)方法，適用于檢測(cè)鼻咽部上皮細(xì)胞感染呼吸道合胞病毒，可以作為兒童感染呼吸道合胞病毒的重要檢查指標(biāo)。
【專利說(shuō)明】呼吸道合胞病毒檢測(cè)試劑盒及使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]一種呼吸道合胞病毒檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于酶免疫分析【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]目前國(guó)內(nèi)檢測(cè)呼吸道合胞病毒(RSV)感染方法有電鏡檢測(cè)、培養(yǎng)鑒定法、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、凝集法、熒光免疫特異性抗體檢測(cè)法等，文獻(xiàn)指出在各種方法中，抗原較抗體檢測(cè)更敏感。臨床實(shí)驗(yàn)室常用間接免疫熒光法檢測(cè)RSV，其次還有病毒分離培養(yǎng)法，PCR法，病毒細(xì)胞培養(yǎng)需要的時(shí)間長(zhǎng)、費(fèi)用高，有時(shí)甚至幾周才能出結(jié)果，不適合臨床檢驗(yàn)，間接免疫熒光法操作簡(jiǎn)單，方便，適合于臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)RSV，以德國(guó)歐蒙公司為代表的試劑盒應(yīng)用最普遍，該方法為用RSV感染的細(xì)胞作為抗原，人體內(nèi)產(chǎn)生的RSV抗體與受RSV感染的細(xì)胞反應(yīng)，加入標(biāo)記異硫氰酸熒光素的羊抗人IgM，實(shí)驗(yàn)前需用驢抗人IgG抗體吸附抗呼吸道合胞病毒IgG抗體，此法的最大缺點(diǎn)是體內(nèi)IgG抗體的非特異性結(jié)合，造成假陽(yáng)性，結(jié)果不易判讀。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種樣品前處理簡(jiǎn)單，快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)呼吸道合胞病毒的方法。
[0004]本發(fā)明試劑盒主要由盒體(1)，酶標(biāo)板(2)中設(shè)有反應(yīng)孔(3)的板條，A試劑瓶(分泌物前處理液)(4)，B試劑瓶(生物素化抗呼吸道合胞病毒抗體)(5)，C試劑瓶(含TritonX-100的磷酸鹽緩沖液)(6)，D試劑瓶(鏈霉親和素偶聯(lián)過(guò)氧化物酶復(fù)合物)(7)，E試劑瓶(鄰苯二胺OPD試劑)(8)，F(xiàn)試劑瓶(H2O2) (9)，G試劑瓶(硫酸溶液)(10)，塑料托架(11)及酶標(biāo)板(2)均安放在盒體(1)內(nèi)。
[0005]本發(fā)明用咽拭子擦拭患兒咽部，加入到2ml含有30g/L鹽酸氨溴索磷酸鹽緩沖液中劇烈震蕩，靜至60min，高速離心(10000G，IOmin)，取沉淀物加入到2.0ml含1.0% (V/V)Triton X-100的磷酸鹽緩沖液中，靜置30min，劇烈震蕩，使呼吸道合胞病毒從咽上皮細(xì)胞脫落出來(lái)，取50 μ I上清液加入到呼吸道合胞病毒ELISA反應(yīng)板中，37°C水浴箱水浴30min，洗滌5次；加入50 μ I生物素化抗呼吸道合胞病毒抗體，37°C水浴箱水浴30min，洗滌5次；加入鏈霉親和素偶聯(lián)過(guò)氧化物酶復(fù)合物，37°C水浴箱水浴30min，洗滌5次；加入試劑E、F各50 μ 1，至37°C水浴箱水浴lOmin，加I滴終止液酶標(biāo)儀測(cè)定A49tlnm值。
[0006]在本發(fā)明中，該試劑盒檢測(cè)的標(biāo)本是鼻咽分泌物中上皮細(xì)胞，其中，鹽酸氨溴索藥物為粘液溶解劑，臨床上常用于呼吸科病人降低痰液的粘稠度而易于排出，本品的巰基(-SH)結(jié)構(gòu)可使粘蛋白的雙硫(-S-S-)結(jié)構(gòu)斷裂，降低痰粘度，在本發(fā)明中，經(jīng)鹽酸氨溴索作用使咽部上皮細(xì)胞從粘液中分離開。Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)是一種非離子型表面活性劑，分子量為646.86 (分子式為C34H62O11)，它能溶解脂質(zhì)，增加對(duì)細(xì)胞膜的通透性，RSV寄生于口腔咽部活體細(xì)胞內(nèi)，Triton X-100作用于細(xì)胞膜使RSV病毒從細(xì)胞中脫離出來(lái)，在鏈霉親和素-生物素偶聯(lián)ELISA法檢測(cè)中，鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)是一種具有高親和力、靈敏度高、特異性強(qiáng)和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)的信號(hào)放大標(biāo)記技術(shù)，研究證明鏈霉親和素-生物素依靠接觸表面均一的多層膜來(lái)維持其穩(wěn)定的結(jié)合，鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物形成時(shí)，一個(gè)標(biāo)記了生物素的抗體可通過(guò)其生物素連接多個(gè)鏈霉親和素分子，一個(gè)鏈霉親和素分子又可橋聯(lián)多個(gè)酶分子，由于此法能結(jié)合更多酶標(biāo)記物，放大了檢測(cè)信號(hào)，使檢測(cè)靈敏度放大1000倍，因此，能檢測(cè)病毒載量低的咽部上皮細(xì)胞，特別適合呼吸道合胞病毒早期感染。
[0007]本文采用將生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)引入ELISA檢測(cè)系統(tǒng)，經(jīng)特殊處理咽部上皮細(xì)胞，利用該系統(tǒng)的放大效應(yīng)和鏈霉親和素-酶復(fù)合物具有高靈敏度、高特異性、高穩(wěn)定性和適用性強(qiáng)等特點(diǎn)，提高了檢測(cè)靈敏度，特別適合早期感染的診治，具有重要臨床價(jià)值，并可應(yīng)用該技術(shù)平臺(tái)檢測(cè)SARS病毒，H7N9病毒等其它病毒檢測(cè)，具有重要意義。
【具體實(shí)施方式】
[0008]一、呼吸道合胞病毒酶標(biāo)板的制備
[0009]將抗呼吸道合胞病毒抗體用包被液稀釋成1: 200倍，加入100 μ I包被微孔反應(yīng)板的微孔，加入含1%小牛血清白蛋白磷酸鹽緩沖液350μ I/每孔，室溫封閉2小時(shí)，4°C過(guò)夜。甩盡孔內(nèi)液體后，用洗滌液洗3次，每次3分鐘。二、生物素化抗體的制備
[0010]生物素化抗體的制備用0.lmmol/L NaHCO3溶液將羊抗人IgM呼吸道合胞病毒抗體稀釋成lmg/L，每毫升抗體溶液中加二甲基甲酰胺溶解的生物素N羥基丁二酰亞胺酯，加入NaHB40.1ml混勻，4°C 2小時(shí)后對(duì)0.01mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液透析，4°C過(guò)夜。加入適量中性甘油后小量分裝。
[0011]三、鏈霉親和素偶聯(lián)過(guò)氧化物酶標(biāo)記物的制備
[0012]鏈霉親和素偶聯(lián)過(guò)氧化物酶標(biāo)記物辣根過(guò)氧化物酶5mg溶于蒸餾水0.5ml中，力口A60mmol/L NaOI4 0.5ml，置 4。。20min后加入 0.16mol/L 乙二醇 0.5ml，再置 4°C 30 分鐘。加入鏈霉親和素5mg，用0.05mol/L碳酸鹽緩沖液透析，4°C過(guò)夜，加KBH4 (5mg/ml) 0.3ml，置4°C 3小時(shí)，加等容積飽和磷酸銨，4°C 30分鐘后4000r/min離心15min。沉淀物用PH7.40.02mol/L磷酸鹽緩沖液0.5ml溶解，用磷酸鹽緩沖液透析除銨。
[0013]四、磷酸鹽緩沖液(0.15M pH7.4 PBS)配置=KH2PO4 0.2 克，Na2HPO4.12H20 2.9克，NaCl 8.0 克，KCl 0.2 克，Tween-200.5ml，加蒸餾水至 1000ml。
[0014]五、A試劑前處理液的配置:在IL洗滌液中加入鹽酸氨溴索30g，即為前處理液。
[0015]六、C試劑在IL洗滌液中加入IOml Triton X-100，即為C試劑。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1呼吸道合胞病毒檢測(cè)試劑盒示意圖。
[0017]圖2酶標(biāo)板示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施例1
[0019]1.樣品處理用咽拭子擦拭患兒咽部，加入到2ml含有30g/L鹽酸氨溴索磷酸鹽緩沖液中劇烈震蕩，靜至60min,高速離心(10000G, IOmin),取沉淀物加入到2.0ml磷酸鹽-吐溫緩沖液(含1.0% (V/V)Triton X-100)中，靜置30min。
[0020]2.檢測(cè)方法取50 μ I上清液加入到呼吸道合胞病毒ELISA反應(yīng)板中，37°C水浴箱水浴30min，洗滌5次；加入50 μ I生物素化抗呼吸道合胞病毒抗體，37°C水浴30min，洗滌5次；加入鏈霉親和素偶聯(lián)過(guò)氧化物酶復(fù)合物，37°C水浴30min，洗滌5次；加入試劑E、F各50 μ 1，至37°C水浴lOmin，加I滴終止液酶標(biāo)儀測(cè)定A49tol值。
[0021]3.結(jié)果判定:可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果:反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺，也可測(cè)OD值，在ELISA檢測(cè)儀上，于490nm處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。
[0022]實(shí)施效果
[0023]1.兩種檢測(cè)呼吸道合胞病毒檢測(cè)方法陽(yáng)性率比較見表1:
[0024]表1本發(fā)明方法和間接免疫熒光法檢測(cè)呼吸道合胞病毒的陽(yáng)性率比較:
I測(cè)方法例數(shù)陽(yáng)性數(shù)陰性數(shù)陽(yáng)性率(％)
【權(quán)利要求】
1.一種呼吸道合胞病毒酶免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于由盒體(1)，酶標(biāo)板(2)中設(shè)有反應(yīng)孔(3)的板條，A試劑瓶(分泌物前處理液)(4)，B試劑瓶(生物素化抗呼吸道合胞病毒抗體)(5)，C試劑瓶(含Triton X-100的磷酸鹽緩沖液)(6)，D試劑瓶(鏈霉親和素偶聯(lián)過(guò)氧化物酶復(fù)合物)(7), E試劑瓶(鄰苯二胺OPD試劑)⑶，F(xiàn)試劑瓶(H2O2) (9)，G試劑瓶(硫酸溶液)(10)，塑料托架(11)及酶標(biāo)板(2)均安放在盒體(1)內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呼吸道合胞病毒酶免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的塑料托架(11)上制有孔和凹槽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呼吸道合胞病毒酶免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的酶標(biāo)板(2)有塑料支架和各自分開的帶孔穴的塑料條組成均放在盒體(1)內(nèi)。
4.一種 呼吸道合胞病毒酶免疫檢測(cè)方法，其特征在于用咽拭子擦拭患兒咽部，加入到2ml含有30g/L鹽酸氨溴索磷酸鹽緩沖液中劇烈震蕩，靜至60min，高速離心(10000G，IOmin)，取沉淀物加入到2.0ml含1.0 % (V/V) Triton X-100的磷酸緩沖液鹽中，靜置30min，劇烈震蕩，使呼吸道合胞病毒從咽上皮細(xì)胞脫落出來(lái)，取50 μ I上清液加入到呼吸道合胞病毒ELISA反應(yīng)板中，37°C水浴箱水浴30min，洗滌5次；加入50 μ I生物素化抗呼吸道合胞病毒抗體，37°C水浴箱水浴30min，洗滌5次；加入鏈霉親和素偶聯(lián)過(guò)氧化物酶復(fù)合物，37°C水浴箱水浴30min，洗滌5次；加入試劑E、F各50 μ 1，至37°C水浴箱水浴lOmin，加I滴終止液酶標(biāo)儀測(cè)定A49tol值。
5.按照權(quán)利要求1所述的呼吸道合胞病毒酶免疫檢測(cè)方法，其特征在于所述的A試劑瓶(分泌物前處理液)為含有30mg/L鹽酸氨溴索磷酸鹽緩沖液。
6.按照權(quán)利要求1所述的呼吸道合胞病毒酶免疫檢測(cè)方法，其特征在于所述的B試劑瓶，為生物素化抗呼吸道合胞病毒抗體。
7.按照權(quán)利要求1所述的呼吸道合胞病毒酶免疫檢測(cè)方法，其特征在于所述的C試劑瓶為含有1.0% (V/V)Triton X-100的磷酸鹽緩沖液。
8.按照權(quán)利要求1所述的呼吸道合胞病毒酶免疫檢測(cè)方法，其特征在于所述的D試劑瓶，為鏈霉親和素偶聯(lián)過(guò)氧化物酶復(fù)合物。
9.按照權(quán)利要求1所述的呼吸道合胞病毒酶免疫檢測(cè)方法，其特征在于所述的酶底物液，E試劑瓶為鄰苯二胺(OPD)試劑，F(xiàn)試劑瓶為H202。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK103604922SQ201310601571
【公開日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月20日
【發(fā)明者】徐向英, 李立和, 齊金龍, 楊帥 申請(qǐng)人:天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院