表達(dá)信號(hào)肽替換的呼吸道合胞病毒f蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種表達(dá)信號(hào)肽替換的呼吸道合胞病毒F蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株及制備方法，所述的耐熱疫苗株分類命名為rTS?tF/RSV，于2016年4月19日保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO:V201625。該疫苗株在感染動(dòng)物或細(xì)胞后，可高效表達(dá)呼吸道合胞病毒的截短F蛋白，自帶的tPAs可增強(qiáng)截短F蛋白的分泌表達(dá)及免疫原性。該毒株可用于制備呼吸道合胞病毒亞單位耐熱活疫苗。CCTCC NO: V20162520160419
【專利說明】
表達(dá)信號(hào)化替換的呼吸道合胞病毒F蛋白的重組新城疫耐熱 疫苗株及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種表達(dá)信號(hào)膚替換的呼吸道合胞病毒F 蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 呼吸道合胞病毒（RespiratoiT syn巧tial vi;rus，RSV)是引起嬰幼兒下呼吸道感 染的重要病原，導(dǎo)致支氣管炎和肺炎，嚴(yán)重時(shí)可致患者死亡，給嬰幼兒的健康和生命安全帶 來巨大威脅。接種疫苗是預(yù)防病毒性疾病的有效手段。為了有效預(yù)防RSV感染性疾病，人們 一直在研制RSV疫苗，但是目前仍沒有疫苗獲得許可上市。因此，研發(fā)安全有效的RSV疫苗是 預(yù)防RSV感染的首要任務(wù)。位于RSV病毒粒子表面的糖蛋白--融合蛋白（fusion protein， 巧是其主要的保護(hù)性抗原，也是研制RSV亞單位疫苗的首選組分之一。
[0003] 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，新型基因工程疫苗的研發(fā)不斷取得突破，其中 基于新城疫病毒載體的新型多聯(lián)活疫苗是研發(fā)熱點(diǎn)之一，許多病原的免疫原性基因已經(jīng)在 新城疫載體內(nèi)成功表達(dá)，并取得了較好的免疫保護(hù)效果，如傳染性法氏囊病毒的VP2蛋白、 H5亞型禽流感病毒的HA蛋白、狂犬病毒的G糖蛋白、嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒的CoV蛋白、人 類免疫缺陷病毒的Gag蛋白等。此類疫苗具有可誘導(dǎo)全身性免疫(體液免疫、細(xì)胞免疫和粘 膜免疫）、高雞胚生長特性、生產(chǎn)成本低廉、免疫方式簡便(飲水、氣霧、點(diǎn)眼/滴鼻等方式）、 安全(毒株間發(fā)生重組及毒力返強(qiáng)可能性極小)等優(yōu)點(diǎn)。但現(xiàn)有的新城疫病毒載體疫苗均是 W非耐熱型新城疫病毒為骨架構(gòu)建的。
[0004] 疫苗的免疫原性主要依靠抗原數(shù)量和抗原遞呈效率。理論上來說，定位于細(xì)胞質(zhì) 的抗原能更有效地誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。組織型纖溶酶原激活因子信號(hào)序列(tPAs)是一個(gè)特異的 蛋白分選信號(hào)，它直接把表達(dá)的抗原分選至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。與巧As融合后，日本乙型腦炎病毒和牛 病毒性腹瀉病病毒的包膜蛋白在轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著高于野生型蛋白，且主要 定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，可引發(fā)更強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫。
[0005] 鑒于RSV對(duì)嬰幼兒的高危害性，人們投入了大量的精力來研制RSV疫苗。但是由于 該病毒感染的高危人群是免疫系統(tǒng)發(fā)育還不成熟的嬰兒，再加上易出現(xiàn)疫苗增強(qiáng)性疾病， 所W研發(fā)該病毒疫苗困難重重。雖然如此，人們還是嘗試了多種方案，其中包括減毒活疫 苗，亞單位疫苗，病毒載體疫苗，病毒樣顆粒(Virus L化e ^dicle，VLP)疫苗、DNA疫苗等。
[0006] 因此，如何提供一種具有耐熱、穩(wěn)定性強(qiáng)、冷藏條件要求低的表達(dá)信號(hào)膚替換的呼 吸道合胞病毒F蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株及制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的技 術(shù)問題。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明進(jìn)行了深入研究，提供了一種表達(dá)信號(hào)膚替換的 呼吸道合胞病毒F蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株及制備方法。
[000引本發(fā)明一方面設(shè)及一種表達(dá)信號(hào)膚替換的呼吸道合胞病毒F蛋白的重組新城疫耐 熱疫苗株，其特征在于所述的耐熱疫苗株分類命名為rTS-tF/RSV，于2016年4月19日保藏于 武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，保藏號(hào)為CCTCC N0:V201625。
[0009] 本發(fā)明另一方面還設(shè)及表達(dá)信號(hào)膚替換的呼吸道合胞病毒F蛋白的重組新城疫耐 熱疫苗株的制備方法，其特征在于包括如下步驟：
[0010] 1.1信號(hào)膚替換的豬圓環(huán)病毒2型化P基因的擴(kuò)增
[0011] 將呼吸道合胞病毒Long株在化P-2細(xì)胞上進(jìn)行增殖，接種5天后，反復(fù)凍融收獲細(xì) 胞培養(yǎng)液。將收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行截短F基因的PCR擴(kuò)增，獲得截短的F蛋白；W引物自延 伸的方法擴(kuò)增獲得tPAs序列；將截短F基因序列和巧As序列通過重疊 PCR的方式進(jìn)行連接， 再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為:上游引物5^ -CAGCTATATTAAGGATTAAGAAAAAATACGGGTAGAAAGCT TGCCACCATGGATGC-3'，下游引物5' -GGGGCACTCCGATTCTACCCGTATTTTTTCTTAATTATTATTAATTT GTGGTTG-3/ ;對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收純化后，測(cè)定DNA濃度，待進(jìn)行克隆連接；
[001 ^ 1.2新城疫病毒耐熱載體片段的PCR擴(kuò)增
[0013] W超長片段PCR的方法獲得新城疫病毒載體序列，擴(kuò)增引物為：上游引物5/- GAATCGGAGTGCCCCGATTGTGCCAAGATGGACTCATC-3'，下游引物5' -TCCTTAATATAGCTGAATTGATTG CAGCTGCGCGATC-3/ ;擴(kuò)增模板為新城疫病毒耐熱株質(zhì)粒PTS09-C;對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化， 測(cè)定其濃度，待克隆連接；
[0014] 1.3重組質(zhì)粒pTS-tF/RSV的克隆連接
[0015] 采用In-fusion克隆連接技術(shù)，將純化好的截短F基因片段和耐熱載體片段進(jìn)行克 隆連接(連接序列為CAGCTATATTAAGGA和TCGGAGTGCCCCGAT);連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化D冊(cè)α感受態(tài)細(xì) 胞，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在LB平皿上培養(yǎng)16小時(shí)后挑單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，鑒定為陽性的菌液進(jìn) 行質(zhì)粒提取；
[0016] 1.4重組病毒rTS-tF/RSV捶救恢復(fù)
[0017] 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTS-tF/RSV與Ξ個(gè)分別表達(dá)NP、P和L蛋 白的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞;轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，反復(fù)凍融收獲細(xì)胞液，接種9-11日齡SPF 雞胚。接種后5天，收獲雞胚尿囊液，分離得到表達(dá)信號(hào)膚替換的呼吸道合胞病毒F蛋白的重 組新城疫耐熱疫苗株。
[0018] 本發(fā)明還設(shè)及上述表達(dá)信號(hào)膚替換的呼吸道合胞病毒F蛋白的重組新城疫耐熱疫 苗株在制備重組病毒中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明還設(shè)及上述表達(dá)信號(hào)膚替換的呼吸道合胞病毒F蛋白的重組新城疫耐熱疫 苗株在制備呼吸道合胞病毒亞單位耐熱活疫苗中的應(yīng)用。
[0020] 本申請(qǐng)公開了一種表達(dá)信號(hào)膚替換的呼吸道合胞病毒F蛋白的重組新城疫耐熱疫 苗株，該疫苗株具有顯著的耐熱特性，可極大降低對(duì)冷鏈系統(tǒng)的依賴，節(jié)省保存運(yùn)輸成本和 提高疫苗熱穩(wěn)定性。該毒株在感染動(dòng)物或細(xì)胞后，可高效表達(dá)呼吸道合胞病毒的截短F蛋 白，自帶的tPAs可增強(qiáng)截短F蛋白的分泌表達(dá)及免疫原性。該毒株可用于制備呼吸道合胞病 毒亞單位耐熱活疫苗。
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發(fā)明表達(dá)信號(hào)膚替換的呼吸道合胞病毒截短F蛋白的重組耐熱新城疫病 毒全長質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。其中dS09-C為親本株的基因組結(jié)構(gòu)，rTS-tF/RSV為在rTS09-C 基因組中插入了信號(hào)膚替換的截短F蛋白后的結(jié)構(gòu)，詳細(xì)標(biāo)注了插入序列的整體序列組成。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，W下所述，僅是對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施 例而已，并非對(duì)本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述掲示 的技術(shù)內(nèi)容加 W變更為同等變化的等效實(shí)施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明 的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)W下實(shí)施例所做的任何簡單修改或等同變化，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0023] 實(shí)施例1
[0024] 第一步、重組全長質(zhì)粒pTS-tF/RSV的構(gòu)建與鑒定
[0025] 1.1信號(hào)膚替換的豬圓環(huán)病毒2型化P基因的擴(kuò)增
[0026] 將呼吸道合胞病毒Long株在化P-2細(xì)胞上進(jìn)行增殖，接種5天后，反復(fù)凍融收獲細(xì) 胞培養(yǎng)液。將收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行截短F基因的PCR擴(kuò)增，獲得截短的F蛋白（刪除信號(hào)膚 和跨膜區(qū)）。W引物自延伸的方法擴(kuò)增獲得巧As序列。將截短F基因序列和巧As序列通過重 疊 PCR的方式進(jìn)行連接，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為:上游引物5/ -CAGCTATATTAAGGATTAAGA AAAAATACGGGTAGAAAGCTTGCCACCATGGATGC-3'，下游引物5' -GGGGCACTCCGATTCTACCCGTATTTT TTCTTAATTATTATTAATTTGTGGTTG-3'(下劃線部分為用于In-fusion克隆連接的互補(bǔ)序列）。 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶約1.化b，與預(yù)期的1681bp相符(刪除自身信號(hào)膚和跨膜區(qū)的 F基因長度為1512bp，分別在F基因前端和后端引入了基因起始序列和基因終止序列，同時(shí) 在F基因前端引入了 Kozak序列和巧As序列）。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收純化后，測(cè)定 DNA濃度，待進(jìn)行克隆連接。
[0027] 1.2新城疫病毒耐熱載體片段的PCR擴(kuò)增
[0028] W超長片段PCR的方法獲得新城疫病毒載體序列，擴(kuò)增引物為：上游引物5/- GAATCGGAGTGCCCCGATTGTGCCAAGATGGACTCATC-3'，下游引物5' -TCCTTAATATAGCTGAATTGATTG CAGCTGCGCGATC-3/ (下劃線部分為用于In-fusion克隆連接的互補(bǔ)序列）。擴(kuò)增模板為新城 疫病毒耐熱株質(zhì)粒PTS09-C。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶約18化，與預(yù)期的17.8化大小相 符。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，測(cè)定其濃度，待克隆連接。
[00巧]1.3重組質(zhì)粒pTS-tF/RSV的克隆連接
[0030] 按照?qǐng)D1所示的方式，采用In-fusion克隆連接技術(shù)，將純化好的截短F基因片段和 耐熱載體片段進(jìn)行克隆連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化D冊(cè)α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在LB平皿上培 養(yǎng)16小時(shí)后挑單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)。對(duì)菌液進(jìn)行截短F基因的PCR鑒定。鑒定為陽性的菌液 進(jìn)行質(zhì)粒提取，待酶切和測(cè)序鑒定。
[0031] 1.4重組質(zhì)粒pTS-tF/RSV的酶切與測(cè)序鑒定
[0032] 分別WBamHI和Mlul內(nèi)切酶對(duì)全長重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，均得到了與預(yù)期相符 的酶切圖譜。將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒pTS-tF/RSV送至測(cè)序公司進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果表 明呼吸道合胞病毒的截短F基因插入到了新城疫病毒耐熱載體的P和Μ基因之間，tPAs序列 成功替換了F蛋白自身的信號(hào)膚序列，且所有序列與預(yù)期完全一致，重組質(zhì)粒pTS-tF/RSV構(gòu) 建成功。
[0033] 第二步、重組病毒rTS-tF/RSV捶救恢復(fù)與鑒定
[0034] 2.1重組病毒rTS-tF/RSV的捶救恢復(fù)
[00巧]采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTS-tF/RSV與Ξ個(gè)分別表達(dá)NP、P和L蛋 白的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染助取-21細(xì)胞(已預(yù)感染表達(dá)T7RNA聚合酶的痘苗病毒）。轉(zhuǎn)染后72小時(shí)， 反復(fù)凍融收獲細(xì)胞液，接種9-11日齡SPF雞胚。接種后5天，收獲雞胚尿囊液，待進(jìn)行新城疫 病毒檢測(cè)。
[0036] 2.2重組病毒的血凝效價(jià)和巧光定量PCR檢測(cè)
[0037] W血凝試驗(yàn)和巧光定量PCR的方法，對(duì)收獲雞胚尿囊液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為新城疫 陽性。初步表明重組病毒rTS-tF/RSV捶救成功。
[003引 2.3重組病毒tF/RSV基因的PCR擴(kuò)增與測(cè)序
[0039] 應(yīng)用呼吸道合胞病毒截短F基因的特異性擴(kuò)增引物，對(duì)重組病毒dS-tF/RSV的截 短F基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定分析，得到1681長的截短F基因序列 (SEQ ID No. 1)，從5/到y(tǒng)端，依次包含了P基因的部分非編碼區(qū)序列化TR)、P基因的基因終 止序列(GE)、中間序列（IG)、截短F基因的基因起始序列(GS)、Kozak序列、tPAs序列、截短F 基因序列（刪除了自身信號(hào)膚和跨膜區(qū)）、截短F基因的雙重終止密碼子、截短F基因的GE序 列、IG序列、Μ基因的GS序列和Μ基因的UTR序列。與預(yù)期序列100 % -致。
[0040] 第Ξ步、信號(hào)膚替換的呼吸道合胞病毒截短F蛋白在重組病中的表 達(dá)驗(yàn)證
[0041] 3.1間接免疫巧光法檢測(cè)信號(hào)膚替換的截短F蛋白的表達(dá)
[0042] 將重組病毒'了5-1。/35￥和巧509-(：(對(duì)照）分別W0.01M0I感染肌Κ-21細(xì)胞，24h后 進(jìn)行間接免疫巧光檢測(cè)，一抗為NDV陽性雞血清或RSV陽性兔血清。檢測(cè)結(jié)果表明，重組病毒 rTS-tF/RSV感染的細(xì)胞內(nèi)，使用NDV陽性雞血清或RSV陽性兔血清作為一抗均能檢測(cè)到綠色 巧光，而巧S09-C株感染的細(xì)胞只在NDV陽性血清作用下檢測(cè)到巧光。
[0043] 3.2Western Blot法檢測(cè)信號(hào)膚替換的截短F蛋白的表達(dá)
[0044] 將重組病毒'了5-1。/35￥和巧509-(：(對(duì)照）分別W0.01M0I感染肌K-21細(xì)胞，24h后 收集細(xì)胞裂解液，W豬圓環(huán)病毒2型陽性血清為一抗進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表 明，在60邸a附近出現(xiàn)一條明顯的目的條帶，與預(yù)期的58.68邸a大小相近。表明信號(hào)膚替換 的截短F蛋白在重組病毒感染的細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)。
[0045] 第四步、重組病毒rTS-tF/RSV的生物學(xué)特性鑒定
[0046] 4.1重組病毒的增殖特性測(cè)定
[0047] 為比較重組病毒rTS-tF/RSV株與親本巧509-(：株的生長增殖情況，將兩株病毒分 別W100TCID5Q接種BHK-21細(xì)胞，接種后24h、4化、7化、9化取上清500μ1，測(cè)定病毒TCIDso，繪 制病毒的生長曲線。結(jié)果表明，重組病毒rTS-tF/RSV株和親本rTS09-C株在BHK-21細(xì)胞的生 長曲線相似，增殖滴度相近，約為107' *^TCID5〇/ml。
[004引 4.2重組病毒的致病性測(cè)定
[0049] 測(cè)定重組病毒對(duì)雞胚的最小致死劑量的平均致死時(shí)間（MDT/MLD)，結(jié)果顯示不同 稀釋度（10-哇1〇-9)的病毒接種雞胚后的12化內(nèi)均不會(huì)對(duì)雞胚致死，重組病毒dS-tF/RSV 的MDT/MLD大于12化，表明重組病毒保持了親本株的低毒特性，外源基因的插入并未改變重 組病毒的致病性。
[(K)加]4.3重組病毒的耐熱特性測(cè)定
[0051 ] 測(cè)定重組病毒在56 °C環(huán)境下的HA耐熱特性，同時(shí)設(shè)置非耐熱株LaSo化株和耐熱株 rTS09-C株為對(duì)照。如表1所示，非耐熱株LaSo化在56°C耐熱處理9min后，HA效價(jià)降為0,親本 株rTS09-C和重組病毒rTS-tF/RSV在56 °C耐熱處理150min后仍具有血凝活性。
[0052] 表明重組病毒rTS-tF/RSV的耐熱特性與親本株一致，均為耐熱株。（該病毒株已經(jīng) 保藏，保藏在武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，保藏號(hào)為CCTCC N0:V201625)。
[0化3] 表1.重組病毒的HA耐熱特性測(cè)定結(jié)果
[0化4]
[0055] a表示病毒具有血凝活性，b表示病毒沒有血凝活性
[0056] W上所述實(shí)施例只是本發(fā)明的較佳實(shí)例，而沒有限制本發(fā)明的實(shí)施范圍。因此，凡 是根據(jù)本
【發(fā)明內(nèi)容】
的實(shí)質(zhì)所作出的等效修改，都應(yīng)屬于在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 表達(dá)信號(hào)肽替換的呼吸道合胞病毒F蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株，其特征在于所 述的耐熱疫苗株分類命名為rTS-tF/RSV，于2016年4月19日保藏于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng) 物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC N0:V201625。2. 表達(dá)信號(hào)肽替換的呼吸道合胞病毒F蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株的制備方法，其 特征在于包括如下步驟： 1.1信號(hào)肽替換的豬圓環(huán)病毒2型Cap基因的擴(kuò)增 將呼吸道合胞病毒Long株在Hep-2細(xì)胞上進(jìn)行增殖，接種5天后，反復(fù)凍融收獲細(xì)胞培 養(yǎng)液。將收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行截短F基因的PCR擴(kuò)增，獲得截短的F蛋白；以引物自延伸的 方法擴(kuò)增獲得tPAs序列；將截短F基因序列和tPAs序列通過重疊 PCR的方式進(jìn)行連接，再進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為:上游引物5' -CAGCTATATTAAGGATTAAGAAAAAATACGGGTAGAAAGCTTGCC ACCATGGATGC-3'，下游引物5' -GGGGCACTCCGATTCTACCCGTATTTTTTCTTAATTATTATTAATTTGTGG TTG-3';對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收純化后，測(cè)定DNA濃度，待進(jìn)行克隆連接； 1.2新城疫病毒耐熱載體片段的PCR擴(kuò)增 以超長片段PCR的方法獲得新城疫病毒載體序列，擴(kuò)增引物為:上游引物5' -GAATCGGAG TGCCCCGATTGTGCCAAGATGGACTCATC-3'，下游引物5' -TCCTTAATATAGCTGAATTGATTGCAGCTGCGC GATC-3';擴(kuò)增模板為新城疫病毒耐熱株質(zhì)粒pTS09-C;對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，測(cè)定其濃 度，待克隆連接； 1.3重組質(zhì)粒pTS-tF/RSV的克隆連接 采用In-fusion克隆連接技術(shù)，將純化好的截短F基因片段和耐熱載體片段進(jìn)行克隆連 接，連接序列為CAGCTATATTAAGGA和TCGGAGTGCCCCGAT;連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化 后的細(xì)胞在LB平皿上培養(yǎng)16小時(shí)后挑單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，鑒定為陽性的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提 ??； 1.4重組病毒rTS-tF/RSV拯救恢復(fù) 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTS-tF/RSV與三個(gè)分別表達(dá)NP、P和L蛋白的 輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞;轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，反復(fù)凍融收獲細(xì)胞液，接種9-11日齡SPF雞胚。 接種后5天，收獲雞胚尿囊液，分離得到表達(dá)信號(hào)肽替換的呼吸道合胞病毒F蛋白的重組新 城疫耐熱疫苗株。3. 權(quán)利要求1所述的表達(dá)信號(hào)肽替換的呼吸道合胞病毒F蛋白的重組新城疫耐熱疫苗 株在制備重組病毒中的應(yīng)用。4. 權(quán)利要求1所述的表達(dá)信號(hào)肽替換的呼吸道合胞病毒F蛋白的重組新城疫耐熱疫苗 株在制備呼吸道合胞病毒亞單位耐熱活疫苗中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N7/01GK106011086SQ201610424910
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月15日
【發(fā)明人】溫國元, 邵華斌, 羅玲, 羅青平, 張媛, 王紅琳, 張騰飛, 汪宏才, 張蓉蓉, 盧琴, 艾地云
【申請(qǐng)人】湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所