血清中甘油三酯的循環(huán)酶測定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種血清中甘油三酯的循環(huán)酶測定方法，屬于利用可見光，通過測試反應(yīng)的結(jié)果產(chǎn)生顏色變化來測試材料的方法。技術(shù)方案是：試劑I中含有甘油激酶、3-磷酸甘油脫氫酶、磷酸甘油氧化酶、過氧化物酶、三磷酸腺苷、NADH、4-氨基安替比林、2，4-二氯酚等有效成分；試劑II僅有脂蛋白脂肪酶有效成分。血清游離甘油在試劑I中甘油激酶，3-磷酸甘油脫氫酶，磷酸甘油氧化酶，過氧化物酶催化下與三磷酸腺苷、NADH、氧氣、4-氨基安替比林、2，4-二氯酚等循環(huán)反應(yīng)生成醌亞胺，加入試劑II后，甘油三酯水解生成甘油，再進行循環(huán)反應(yīng)，儀器以試劑I反應(yīng)產(chǎn)生的醌亞胺為空白，由試劑II反應(yīng)產(chǎn)生的醌亞胺計算出甘油三酯的含量。
【專利說明】血清中甘油三酯的循環(huán)酶測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于一種包含酶的測定方法；或是利用可見光，通過測試反應(yīng)的結(jié)果產(chǎn)生顏色變化來測試材料的方法，特別是涉及一種用生化分析儀檢測血清中甘油三酯的循環(huán)酶測定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]血清中甘油三脂(TG)的測定方法一般可分為化學(xué)法、酶法和色譜法3大類。本發(fā)明介紹一種循環(huán)酶法測定血清中的甘油三酯，甘油三酯(TG)在脂蛋白脂肪酶(LPL)催化下生成甘油和脂肪酸，甘油和ATP在甘油激酶(GK)催化下生成甘油-3-磷酸(G-3P)，被帶入循環(huán)反應(yīng)中，通過磷酸甘油氧化酶(GPO)氧化為磷酸二羥丙酮(DHAP)，DHAP被甘油-3磷酸脫氫酶(G-3TOH)又還原為G-3P，同時伴有NADH向NAD+的轉(zhuǎn)化，在反復(fù)循環(huán)中G-3P和DHAP的量不變，而產(chǎn)物H2O2累積的量決定于反應(yīng)時間和每分鐘循環(huán)次數(shù)，因此，其靈敏度大大超過一般的酶法分析，檢測產(chǎn)物H2O2可偶聯(lián)過氧化物酶(POD),可通過Trinder反應(yīng)比色測定。
[0003]其理論推導(dǎo)如下:
[0004]測定反應(yīng)如圖2。
[0005]
[0006]設(shè)SV = 1.5 μ I, R1 = 200 μ I, R2 = 50 μ I, h = 3min, t2 = 5min,甘油三酯線性范圍11.00mmol/L，血清中游離甘油病理高值為0.60mmol/L。
[0007]根據(jù)公式推導(dǎo):
【權(quán)利要求】
1.一種血清中甘油三酯的循環(huán)酶測定方法，其特征在于循環(huán)酶及底物同在試劑I中，試劑II僅含有脂蛋白脂肪酶有效成分；其測定方法為:血清先與試劑I于37°C溫浴3~5分鐘，血清中游離甘油與試劑I進行循環(huán)反應(yīng)生成醌亞胺，加入試劑II后于37°C溫浴4~7分鐘，甘油三酯水解后產(chǎn)生甘油再經(jīng)循環(huán)反應(yīng)生成醌亞胺；反應(yīng)達到一定時間后，儀器在500~520nm波長處檢測，以試劑I反應(yīng)產(chǎn)生的醌亞胺為空白，由試劑II反應(yīng)產(chǎn)生的醌亞胺計算出甘油三酯的含量，計算公式為:
ODtg = OD2-OD1X [ (SV+RJi) / (SY+R1Y,+R2Y2)] 甘油三酯濃度=FXODtg 其中ODtc是甘油三酯產(chǎn)生的吸光度，OD1是樣品加入試劑I反應(yīng)后測得的吸光度，OD2是樣品加入試劑II反應(yīng)后測得的吸光度，SV是血清的體積，R1V1是試劑I的體積，R2V2是試劑II的體積，F(xiàn)是校正因數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血清中甘油三酯的循環(huán)酶測定方法，其特征在于第一步和第二步反應(yīng)均采用循環(huán)酶法測定甘油，生成紅色醌亞胺進行測定。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血清中甘油三酯的循環(huán)酶測定方法，其特征在于試劑I每升 Tris-HCl 緩沖液內(nèi)含 TrislOOmmol ~300mmol、2,4_ 二氯酌.1.0mmol ~3.0mmoI>MgS049.0mmol ~15.0mmol、膽酸納 3.0mmol ~5.0mmol、三憐酸腺昔 1.SmmoI ~2.Smmol.甘油激酶IOOU~160U、磷酸甘油氧化酶1200U~2000U、過氧化物酶1000U~1400U、4_氨基安替比林1.BmmoI~2.Smmol.甘油-3-憐酸脫氧酶1200U~2000U、NADH0.8mmol~1.2mmol、Proclin-300 防 腐劑 100 μ I ~300 μ I ;試劑 II 每升 Tris-HCl 緩沖液內(nèi)含TrislOOmmol ~300mmol、脂蛋白脂肪酶 1800U ~2100U、Triton X-1000.08g ~0.16g、Proclin-300 防腐劑 100μ I ~300μ I。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的血清中甘油三酯的循環(huán)酶測定方法，其特征在于試劑I和試劑II中Tris-HCl緩沖液的pH值為7.6±0.2。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的血清中甘油三酯的循環(huán)酶測定方法，其特征在于測定的體積比為:樣品:試劑1:試劑11 = 3: 300~500: 30~70。
【文檔編號】G01N30/06GK103913581SQ201310601423
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2013年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月20日
【發(fā)明者】李立和, 鄭寶永, 王彥平, 李錚, 劉果艷 申請人:天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院