Psa單克隆抗體及分泌該抗體的雜交瘤細胞株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了兩種前列腺特異性抗原PSA單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株，使用三種抗原免疫得到，一種為直接外購的PSA抗原，第二種和第三種分別為PSA蛋白序列的N端多肽及C端多肽。得到的兩株單抗的最低檢測濃度不大于0.5ng/ml，優(yōu)于現(xiàn)有技術。
【專利說明】PSA單克隆抗體及分泌該抗體的雜交瘤細胞株
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，具體涉及前列腺特異性抗原PSA單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
【背景技術】
[0002]前列腺特異性抗原PSA (Prostate)是一種含有237個氨基酸的單肽鏈糖蛋白，分子量約300kDa。屬于具有組織特異性的具有糜蛋白酶樣作用的絲氨酸蛋白酶族。PSA主要由前列腺的腺上皮細胞產(chǎn)生，在精液中的濃度很高。PSA的主要生理作用是分解精液中的膠狀蛋白，有稀釋精液，增加精子運動能力的作用。最初分泌到前列腺腺管的PSA是一種無活性的酶原(proPSA)，酶原在氨基端裂解掉7個氨基酸后具有絲氨酸蛋白酶活性。少量PSA可進入血循環(huán)，進入血循環(huán)的大部分PSA迅速與蛋白酶抑制素結合而失活，主要與α-1抗糜蛋白酶(ACT)和α-2巨球蛋白結合(MG)，也有少部分被蛋白水解酶滅活后以游離狀態(tài)存在。游離的PSA以及和ACT結合的PSA(PSA-ACT)通過現(xiàn)有免疫學方法可以檢測到。同時檢測游離PSA和PSA-ACT復合物即為目前所說的總PSA檢測。與α -2巨球蛋白結合(MG)的PSA由于蛋白的包裹、遮蔽作用使PSA特異性表位消失，因此用現(xiàn)有免疫學方法無法檢測。血清總PSA含量和前列腺疾病密切相關，良性前列腺增生和惡性的前列腺癌都會引起總PSA升高，游離PSA則較少受前列腺癌生長的影響。PSA具有組織特異性，但并無腫瘤特異性，前列腺炎、良性前列腺增生和前列腺癌均可導致PSA升高。
[0003]前列腺癌已超過皮膚癌成為北美男性最常見的癌癥，因癌致死病例數(shù)排第二位。PSA在大多數(shù)有臨床癥狀的前列腺癌中都會升高，因此監(jiān)測PSA含量對于評估腫瘤治療效果有重要意義。
[0004]目前PSA的檢測方法目前全部采用免疫學方法，由于檢測到總PSA值后還要配合其他的試劑盒計算游離PSA及PSA-ACT的比值來綜合判斷是癌變還是增生，因此在低濃度范圍內檢測的精度對于臨床非常重要，但是現(xiàn)有技術能夠檢測的范圍和精度比較差，嚴重制約了臨床應用。

【發(fā)明內容】

[0005]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提出兩株分泌前列腺特異性抗原PSA單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其產(chǎn)生的單抗利用化學發(fā)光法檢測病人血樣，得以達到最低檢測限不大于
0.5ng/ml，靈敏度和準確度都大大高于目前的水平。
[0006]本實驗使用外購天然PSA抗原作為免疫，以獲得針對PSA不同構象表位的抗體；同時由于蛋白氨基酸序列的N端、C端比較容易暴露出線性表位，所以分別合成N端多肽、C端多肽，以獲得針對線性表位的抗體。
[0007]分別用三種抗原免疫小鼠,免疫后進行小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞的融合。采用公知的檢測方法對單克隆抗體進行檢測，將得到的陽性細胞進行亞克隆。最后用雙抗夾心ELISA法對抗體進行配對，得到兩株配對的細胞株PSAl (保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏日期2013年11月08日，保藏編號CGMCC N0.8451，分類命名:前列腺單克隆抗體雜交瘤細胞株)和PSMl (保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏日期2013年11月08日，保藏編號CGMCC N0.8452，分類命名:前列腺單克隆抗體雜交瘤細胞株)。
[0008]基于上述目的本發(fā)明提供的分泌前列腺特異性抗原PSA單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其保藏編號為CGMCC N0.8451和CGMCC N0.8452。
[0009]一種前列腺特異性抗原PSA單克隆抗體，由編號為CGMCC N0.8451的雜交瘤細胞株分泌。
[0010]一種前列腺特異性抗原PSA單克隆抗體，由編號為CGMCC N0.8452的雜交瘤細胞株分泌。 [0011 ] 上述兩種抗體可以應用于試劑盒的制備。
[0012]人體血清的總PSA正常值為0-4ng/ml,—旦超過了 4ng/ml,就必須進行進一步的檢測以確定是否患有前列腺癌癥或者炎癥。一般免疫分析檢測報告的血清總PSA (t-PSA)為f-PSA與PSA-ACT的總和。t-PSA或PSA-ACT在前列腺癌患者血清中明顯升高，在部分良性前列腺疾病患者血清中也有輕微升高，特別是在低水平升高的重疊范圍內(4-10ng/ml)。本實驗篩選到的兩株單抗，用雙抗夾心ELISA方法可以檢測的線性范圍為0-100ng/ml，可以為判斷病情提供有力的數(shù)據(jù)證明。同時其抗體可以達到最低檢測限不大于0.5ng/ml，較現(xiàn)有試劑盒的最低檢測濃度lng/ml，本抗體在低值檢測范圍內也有很大的優(yōu)勢。
[0013]本發(fā)明提供的分泌前列腺特異性抗原PSA單克隆抗體的雜交瘤細胞株，能夠穩(wěn)定的分泌抗前列腺特異性抗原PSA的單克隆抗體，兩株單抗的最低檢測濃度不大于0.5ng/ml，優(yōu)于現(xiàn)有技術。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為本發(fā)明得到的兩株單抗雙抗夾心ELISA得到的STD曲線圖。
【具體實施方式】
[0015]為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚明白，以下結合具體實施例，并參照附圖，對本發(fā)明進一步詳細說明。
[0016]I 材料
[0017]I)試劑 PSA Antigen 購自 Biospacific 公司；
[0018]2)合成N端多肽及合成C端多肽，來源于上海楚肽生物科技有限公司(Ap印tideC0., Ltd.)
[0019]3)動物6周齡，雌性，BALB/c小鼠，購自協(xié)和醫(yī)科大學實驗動物中心。
[0020]4) SP2/0骨髓瘤細胞購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所。
[0021]5) HisTrap HP、HiTrap Protein G 柱購自 GE;
[0022]6)弗氏佐劑、50%聚乙二醇(PEG) 1450溶液、HAT、HT以及辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗小鼠IgG、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、孕酮(Progesterone)純度>90%均為Sigma產(chǎn)品；
[0023]7 ) DMEM培養(yǎng)基為Gibco產(chǎn)品；[0024]8)新生牛血清購于杭州四季清生物工程有限公司。
[0025]2 方法
[0026]2.1PSA免疫抗原的準備
[0027]PSA免疫抗原采用三種:一種為直接外購自Biospacific公司的PSA Antigen ;第二種和第三種分別為PSA蛋白序列的N端多肽及C端多肽。
[0028]2.2多肽合成
[0029]N 端多妝序列:mwvpvvfltl svtwigaapl ilsrivggwe
[0030]C 端多妝序列:wviliteltm palpmvlhgs lvpwrggv
[0031]按照多肽合成常規(guī)操作，合成來源于上海楚肽生物科技有限公司(Ap印tideC0.，LtcOHPLC檢測純度為95%。多肽C端增加的半胱氨酸殘基用于以其巰基連接于偶聯(lián)劑上。
[0032]2.3合成多肽與載體的偶聯(lián)
[0033]載體蛋白選擇BSA(Roche公司)，用SPDP(PIERCE公司)連接法將合成的多肽與BSA進行偶聯(lián):4.6mgSPDP 溶解于 740ulDMS0，終濃度為 20mM。0.1008gBSA 溶解于 2mlPBS_EDTA溶液中，室溫靜置lh。HiTrap?Deaslting column脫鹽柱洗脫多余的SPDP。4mg多肽加入偶聯(lián)好的BSA-SPDP體系中室溫過夜。
[0034]2.4動物免疫
[0035]三種抗原分別作為免疫抗原免疫小鼠,選用6周齡、雌性BALB/c小鼠。首次免疫，50 μ g/只的抗原加等體積完全福氏佐劑，采用皮下注射；4周后，第二次免疫，用25 μ g/只的抗原加等體積不完全福氏佐劑，`皮下注射，二免后效價為1:50000 ；2周后，第三次免疫，用25yg/只的抗原加等體積不完全福氏佐劑，皮下注射，7-10天后，ELISA檢測免疫鼠血清效價，效價達到1:10W，準備做細胞融合。如果效價比較低，則2周后繼續(xù)進行第四次免疫，免疫劑量及方式同第三次免疫一致，直至尾血效價檢測達到1:10W左右。細胞融合前3天，再用25 μ g抗原腹腔注射以加強免疫。
[0036]2.5細胞融合
[0037]細胞融合可采用公知的方法進行。取免疫小鼠脾臟細胞(I X IO8個細胞)與骨髓瘤細胞株Sp2/0 (IXlO7個細胞％)，在50%PEG1450作用下進行常規(guī)融合。融合細胞用HAT培養(yǎng)基作選擇性培養(yǎng)，7d后改用HT培養(yǎng)基，14d后改用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)(20%小牛血清)。融合板鋪板10板，融合率為90%。
[0038]2.6陽性檢測
[0039]單克隆抗體的檢測采用公知的方法進行，間接ELISA法。用抗原PSA(包被濃度為100ng/ml)包被酶標板，37°C孵育lh，洗板；96孔細胞培養(yǎng)板的每個待檢孔取IOOul加入包被好的酶標板，37°C孵育45min，洗板；加入HRP酶標二抗，37°C，30min,洗板；加入TMB顯色液，37°C避光反應15min后，加人終止液；讀取波長為450nm時的OD值。OD值讀大于0.5以上定義為陽性克隆。三種不同抗原分別做細胞融合，一共得到陽性單株28株。檢測到的陽性細胞再進行亞克隆，經(jīng)過3~5次亞克隆直到達到100%的陽性率。
[0040]2.7抗體純化
[0041]獲得單抗后是否能應用于試劑盒研發(fā)生產(chǎn)的要求，需要將28株穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株制備腹水，純化抗體。在預先I周注射石蠟油(0.5ml/只)致敏的BALB/C小鼠腹腔接種已建株的雜交瘤細胞，細胞數(shù)為106，7~10天后采集腹水并離心得上清。腹水上清按1:10稀釋于PBS中，并以0.5ml/min上樣于經(jīng)PBS平衡的HiTrap Protein G親和層析柱中。用PBS洗雜，再用甘氨酸緩沖液(pH2.7)洗脫，用SDS-PAGE電泳鑒定純度。包被PSA抗原，間接ELISA法測定抗體效價，28株抗體的效價在1: 6W~1:20W之間。
[0042]2.8抗體的標酶及效價檢測
[0043]得到純化抗體后，利用改良過碘酸鈉氧化法進行抗體標酶。首先稱取適量HRP酶，溶于三蒸水中，加人新近配制的過碘酸鈉溶液，混勻后置4°C，30min ;加入乙二醇溶液，室溫，30min ;加入適量純化抗體，混勻，調pH值至9.0，放4°C，過夜；加入硼氫化鈉，混勻，置40C，2h ;將酶標抗體混合液加入等體積飽和硫酸銨溶液，置4°C，30min ;離心后，用pH7.4的磷酸鹽緩沖液透析過夜。包被PSA抗原,直接ELISA法測定酶標抗體效價,酶標抗體的效價在1:500~1:5K之間，酶標抗體的工作濃度為1:200~2Κ之間。2.9雙抗夾心ELISA進行抗體配對及優(yōu)化
[0044]PSA試劑盒大多數(shù)使用的為雙抗夾心法原理，這就需要將獲得的抗體進行酶標和抗體配對試驗。雙抗夾心ELISA檢測方案:用0.01mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液將單克隆抗體稀釋至5μ g/ml包被酶標板，4°C過夜；用PBS/T20洗板3次，每次3min ;用含5%小牛血清的PBS/T20封閉，37°C孵育Ih，洗板；加入倍比稀釋的PSA溶液，37°C孵育45min，洗板；加入HRP-單克隆抗體，370C，30min,洗板；加入TMB顯色液，37°C避光反應15min后，加人終止液；讀取波長為450nm時的OD值,選取配對情況最好的兩株單抗。
[0045]通過雙抗夾心ELISA法對28株單抗進行抗體配對實驗,得到最佳配對的抗體，分別為PSA1、PSM1，其中PSAl為外購自Biospacific公司的PSA Antigen免疫小鼠后獲得的抗體，PSMl為合成的N端多肽免疫小鼠后獲得的抗體。
[0046]表1為PSA1、PSMl雙抗夾心ELISA配對結果，STD曲線圖見附圖1:
[0047]表1
【權利要求】
1.分泌前列腺特異性抗原PSA單克隆抗體的兩株雜交瘤細胞株，其特征在于，其保藏編號為 CGMCC N0.8451 和 CGMCC N0.8452。
2.一種前列腺特異性抗原PSA單克隆抗體，其特征在于，是由權利要求1所述的編號為CGMCC N0.8451的雜交瘤細胞株分泌。
3.一種前列腺特異性抗原PSA單克隆抗體，其特征在于，是由權利要求1所述的編號為CGMCC N0.8452的雜交瘤細胞株分泌。
4.根據(jù)權利要求2或3所述的單克`隆抗體在試劑盒制備中的應用。
【文檔編號】G01N33/573GK103589689SQ201310560689
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月12日 優(yōu)先權日:2013年11月12日
【發(fā)明者】不公告發(fā)明人 申請人:北京利德曼生化股份有限公司