一種中緬樹鼩脂肪細(xì)胞的流式細(xì)胞樣品制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及細(xì)胞樣本制作領(lǐng)域，具體涉及一種中緬樹鼩脂肪細(xì)胞的流式細(xì)胞樣品制作方法。本發(fā)明方法利用4％多聚甲醛進(jìn)行細(xì)胞固定，0.05％Tween進(jìn)行細(xì)胞打孔，制作中緬樹鼩脂肪細(xì)胞流式樣本。使用本發(fā)明方法，能有效解決一般情況下細(xì)胞通透時(shí)造成的大量脂肪細(xì)胞破碎，以及離心轉(zhuǎn)速對(duì)固定的脂肪細(xì)胞造成的破碎的問題，成功制作出符合流式上機(jī)要求的脂肪細(xì)胞樣品，為細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)提供方法依據(jù)。
【專利說明】
一種中緬樹齣脂肪細(xì)胞的流式細(xì)胞樣品制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞樣本制作領(lǐng)域，具體涉及一種中緬樹駒脂肪細(xì)胞的流式細(xì)胞樣品制作方法。
【背景技術(shù)】
[0002]流式細(xì)胞術(shù)自20世紀(jì)60年代開始發(fā)展起來，主要應(yīng)用于生命科學(xué)的基礎(chǔ)研究，尤其是細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)，是細(xì)胞與分子生物學(xué)、單克隆抗體技術(shù)、生物技術(shù)、熒光化學(xué)、激光技術(shù)、光電子物理、流體力學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)等多學(xué)科領(lǐng)域共同發(fā)展的結(jié)晶。它不僅能夠快速定量分析細(xì)胞群的物理化學(xué)特征，還能通過這些特征精確分選細(xì)胞，主要分為流式細(xì)胞分析和流式細(xì)胞分選兩部分。80年代后期開始應(yīng)用于臨床，并通過對(duì)外周血CD4+T細(xì)胞的檢測(cè)來監(jiān)測(cè)HIV患者疾病的進(jìn)展，開啟了用于臨床醫(yī)學(xué)的新紀(jì)元?，F(xiàn)在，流式細(xì)胞術(shù)不僅能夠輔助多種疾病的判斷，同時(shí)為生物學(xué)發(fā)展提供了新技術(shù)。
[0003]細(xì)胞因子是由非免疫細(xì)胞或免疫細(xì)胞合成和分泌的小分子多肽，在調(diào)節(jié)機(jī)體多種細(xì)胞的分化、生長和功能，調(diào)節(jié)正常與病理狀態(tài)下的免疫應(yīng)答起著十分重要的作用。檢測(cè)細(xì)胞因子對(duì)于闡明機(jī)體免疫應(yīng)答機(jī)制的發(fā)生、發(fā)展和臨床治療具有重要意義。隨著研究進(jìn)展，僅僅對(duì)細(xì)胞進(jìn)行活性的檢測(cè)和定量已不能滿足需要。目前，在單細(xì)胞水平上研究細(xì)胞因子的表達(dá)能力越來越受到重視。應(yīng)用流式細(xì)胞儀結(jié)合間接免疫熒光法，可在單細(xì)胞水平上正確、客觀地檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)多個(gè)細(xì)胞因子，進(jìn)行多參數(shù)相關(guān)分析，是一種有效地在單細(xì)胞水平研究細(xì)胞因子的方法(Pala P,H us sell J,0 penshaw P J.Flow cytomety measure-mentof intracellular cytoki nes[J].Tmmu noI M ethods，2000，243(1-2):107-124)。
[0004]自流式細(xì)胞術(shù)發(fā)展以來多應(yīng)用于免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、血液、細(xì)胞凋亡、細(xì)菌學(xué)，而實(shí)驗(yàn)動(dòng)物也多為小鼠等嚙齒類動(dòng)物?，F(xiàn)有技術(shù)方案對(duì)于脂肪細(xì)胞的研究也多數(shù)集中于前體脂肪細(xì)胞的分化機(jī)制及特異性分子標(biāo)記物，而缺少流式細(xì)胞術(shù)對(duì)于成熟脂肪細(xì)胞的分析、分選。
[0005]此外，現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)方案一般利用0.1%Triton-100進(jìn)行細(xì)胞通透，但由于脂肪細(xì)胞的細(xì)胞膜較易破碎，利用0.1 %Triton-100進(jìn)行細(xì)胞通透時(shí)會(huì)使樣品中的大量脂肪細(xì)胞破碎，從而影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不適合脂肪細(xì)胞的流式細(xì)胞樣品制作，不能得到理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。且現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)方案中離心速度一般在1000-1500rpm，1min，這一轉(zhuǎn)速對(duì)脂肪細(xì)胞來說轉(zhuǎn)速過大，特別是對(duì)已固定后的細(xì)胞來說轉(zhuǎn)速過大，會(huì)使細(xì)胞大量破碎，影響實(shí)驗(yàn)操作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是在于提供一種中緬樹駒脂肪細(xì)胞的流式細(xì)胞樣品制作方法，有效解決一般實(shí)驗(yàn)方案中0.1 %Triton-100進(jìn)行細(xì)胞通透時(shí)造成的大量脂肪細(xì)胞破碎，以及離心轉(zhuǎn)速對(duì)固定的脂肪細(xì)胞造成的破碎的問題，成功制作出符合流式上機(jī)要求的脂肪細(xì)胞樣品。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案予以解決:
[0008]—種中緬樹駒脂肪細(xì)胞的流式細(xì)胞樣品制作方法，其特征在于，包含以下步驟:
[0009](I)動(dòng)物斷頸處死后，分別取下樹駒肩胛、耳后、腋下褐色脂肪組織，與腹部大網(wǎng)膜、腹股溝白色脂肪組織，隨后泡在磷酸緩沖液(phosphate buffer solut1n，PBS)中，將組織上沾著的毛洗掉；
[0010](2)將組織置于2mL的離心管中，加ImL 0.25%不含EDTA的胰酶，用平剪將組織剪碎，約Imm3大小，將剪碎的組織塊轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，胰酶補(bǔ)至4mL，放入37°C水浴鍋中溫浴，每隔1min搖晃一次，顯微鏡下觀察組織塊消化成單細(xì)胞的程度，共50-70分鐘;若樣品較為粘稠，100rpm離心1min仍不能離下沉淀，則補(bǔ)PBS至1mL離心，1500rpm，lOmin，棄上清液，保留沉淀；
[0011](3)將步驟(2)中留取的沉淀用1mL PBS重懸一下，將大的組織塊剔除，離心100rpm, 1min，棄上清液，留少量I3BS將松散的沉淀吹散，吸出至新的2mL離心管中，血細(xì)胞經(jīng)過離心后貼壁較牢，因此可將血細(xì)胞剔除，重復(fù)用PBS洗一次；
[0012](4)4%預(yù)冷的多聚甲醛將細(xì)胞重懸，4°C固定過夜，并將固定過夜的細(xì)胞用移液槍重懸起來，剔除大的組織塊，離心100rpm，1min，4°C，棄上清液，保留沉淀；
[0013](5)將步驟(4)留取的沉淀用ImL PBS重懸，離心，lOOOrpm，1min，4°C，棄上清液，保留沉淀；
[0014](6)在步驟(5)留取的沉淀中加Im L含0.05%的Tween細(xì)胞打孔劑，將細(xì)胞重懸，打孔30min;
[0015](7)離心800rpm，10min，棄上清液，保留沉淀，并用I3BS洗一遍細(xì)胞，加50-100yL的PBS混勻細(xì)胞，加入適量的UCPl—抗，室溫孵育40min;
[0016](8)加 PBS 至 ImL 混勾，離心 800rpm，lOmin，加 PBS 洗一遍；
[0017](9)按1:2000的比例加入二抗，避光，室溫孵育40min，PBS洗一遍，加PBS至ImL，即可。
[0018]本發(fā)明方法避免了傳統(tǒng)技術(shù)方案中會(huì)對(duì)脂肪細(xì)胞造成大量損傷，使脂肪細(xì)胞大量破碎，而無法制作出合格的流式樣品。本發(fā)明方法制作的中緬樹駒脂肪組織流式樣品效果較好，且對(duì)冷馴化下中緬樹駒脂肪細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比分析，為細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)提供方法依據(jù)。
【附圖說明】
[0019]以下結(jié)合附圖與【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0020]圖1為70%酒精固定對(duì)細(xì)胞散射光的影響，其中:A-0.1 % Tri ton-100通透，B-0.05% Tween 通透；
[0021 ] 圖2為4 %多聚甲醛固定對(duì)細(xì)胞散射光的影響，其中:A-0.I % Triton-100通透，B-0.05% Tween 通透；
[0022]圖3為冷馴化Od中緬樹駒脂肪細(xì)胞“典型”WAT流式分析圖；
[0023]圖4為冷馴化28d中緬樹駒脂肪細(xì)胞“典型”WAT流式分析圖；
[0024]圖5為冷馴化49d中緬樹駒脂肪細(xì)胞“典型”WAT流式分析圖；
[0025]圖6為冷馴化49d中緬樹駒脂肪細(xì)胞“典型”BAT流式分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明不限于該實(shí)施例。
[0027]為順利制備中緬樹駒脂肪細(xì)胞流式樣品，首先選擇具有UCPl表達(dá)的褐色脂肪細(xì)胞進(jìn)行樣本分析，并選取固定劑為70%酒精或4%多聚甲醛，打孔劑為0.1%Triton-100或0.05%Tween，進(jìn)彳丁組合探討最佳方案。其中利用70%酒精進(jìn)彳丁細(xì)胞固定后，再用0.1%Tri ton-100或0.05 % Tween進(jìn)行細(xì)胞打孔，發(fā)現(xiàn)染色效果不好，基本沒有細(xì)胞被染上(參照?qǐng)D1)。而利用4%多聚甲醛進(jìn)行固定后，再用0.05%Tween進(jìn)行打孔，發(fā)現(xiàn)其染色效果較好，約有70.40%的細(xì)胞被染色(參照?qǐng)D2)。因此本發(fā)明方法利用4%多聚甲醛進(jìn)行細(xì)胞固定，
0.05% Tween進(jìn)行細(xì)胞打孔，制作中緬樹駆]脂肪細(xì)胞流式樣本。
[0028]實(shí)施例
[0029]實(shí)施例1白色脂肪細(xì)胞的流式分析
[0030]對(duì)照組中緬樹駒腹部大網(wǎng)膜、腹股溝等“典型”WAT顯示出單一的Rl群，且沒有UCPl表達(dá)(參照?qǐng)D3)。冷馴化4周后，中緬樹駒腹部大網(wǎng)膜、腹股溝等“典型”WAT顯示出單一的Rl群，用UCPI抗體標(biāo)記后，有5.70 %的細(xì)胞顯示為陽性。冷馴化使WAT中出現(xiàn)UCPI表達(dá)陽性的細(xì)胞群(參照?qǐng)D4)。冷馴化7周后，樹駒腹部大網(wǎng)膜、腹股溝“典型” WAT中出現(xiàn)了新的細(xì)胞群R2群。其中Rl群用UCPl抗體標(biāo)記后，有69.64%的細(xì)胞顯示為陽性。冷馴化使WAT Rl中出現(xiàn)UCPl表達(dá)陽性的細(xì)胞群。冷馴化新生成的R2群用UCPl抗體標(biāo)記后，有95.28%的細(xì)胞顯示為陽性。冷馴化使WAT中出現(xiàn)UCPl表達(dá)陽性的細(xì)胞群(參照?qǐng)D5)。
[0031 ]實(shí)施例2褐色脂肪細(xì)胞的流式分析
[0032 ] 冷馴化7周后，樹駒肩胛、耳后、腋下BAT中Rl群用UCPI抗體標(biāo)記后，有67.82 %的細(xì)胞顯示為陽性。R2群用UCPl抗體標(biāo)記后，有94.99%的細(xì)胞顯示為陽性。這說明冷馴化增加了樹駒BAT中UCPI的表達(dá)，BAT產(chǎn)熱活性增強(qiáng)(參照?qǐng)D6)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種中緬樹駒脂肪細(xì)胞的流式細(xì)胞樣品制作方法，其特征在于，包含以下步驟: (1)動(dòng)物斷頸處死后，分別取下樹駒肩胛、耳后、腋下褐色脂肪組織，與腹部大網(wǎng)膜、腹股溝白色脂肪組織，隨后將其泡在PBS中，并將組織上沾著的毛洗掉； (2)將上述組織置于2mL的離心管中，加ImL0.25%不含EDTA的胰酶，用平剪將組織剪碎，約Imm3大小，將剪碎的組織塊轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，加入胰酶補(bǔ)至4mL，放入37 °C水浴鍋中溫浴，每隔1min搖晃一次，顯微鏡下觀察組織塊消化成單細(xì)胞的程度，共50-70分鐘;若樣品較為粘稠，100rpm離心1min仍不能離下沉淀，則補(bǔ)PBS至1mL離心，1500rpm，1min，棄上清液，保留沉淀； (3)將步驟(2)中留取的沉淀用1mLPBS重懸一下，將大的組織塊剔除，離心100rpm，1min，棄上清液，留少量PBS將松散的沉淀吹散，吸出至新的2mL離心管中，將血細(xì)胞剔除，重復(fù)用PBS洗一次； (4)用4%預(yù)冷的多聚甲醛將上述細(xì)胞重懸，4°C固定過夜，并將固定過夜的細(xì)胞用移液槍重懸起來，剔除大的組織塊，離心100rpm，1min，4°C，棄上清液，保留沉淀； (5)將步驟(4)留取的沉淀用ImLPBS重懸，離心，100rpm，1min，4°C，棄上清液，保留沉淀； (6)在步驟(5)留取的沉淀中加ImL含0.05%的Tween細(xì)胞打孔劑，將細(xì)胞重懸，打孔30min； (7)離心800rpm，1min，棄上清液，保留沉淀，并用PBS洗一遍細(xì)胞，加50_100yL的PBS混勻細(xì)胞，加入適量的UCPl—抗，室溫孵育40min; (8)加PBS至ImL混勾，離心800rpm，1min，加PBS洗一遍； (9)按1:2000的比例加入二抗，避光，室溫孵育40min，PBS洗一遍，加PBS至ImL，即可。
【文檔編號(hào)】G01N15/14GK105890942SQ201610189049
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年3月30日
【發(fā)明人】王政昆, 朱萬龍, 孫舒然, 高文榮
【申請(qǐng)人】云南師范大學(xué)