一種犬細(xì)小病毒化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】一種犬細(xì)小病毒化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，涉及檢測(cè)犬細(xì)小病毒的試劑盒，包括盒體，盒體內(nèi)設(shè)有包被有濃度為10ug/mL的犬細(xì)小病毒包被抗體的聚苯乙烯96孔微孔板、犬細(xì)小病毒抗原質(zhì)控對(duì)照品、辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體溶液、犬細(xì)小病毒標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品稀釋液、濃縮洗滌液和化學(xué)發(fā)光液。本發(fā)明試劑盒靈敏度高可達(dá)3ng/mL，并且具有高特異性、寬檢測(cè)范圍、操作方法簡(jiǎn)單、反應(yīng)結(jié)果易于觀察等特點(diǎn)，不僅提高了檢測(cè)效率，而且保證了檢測(cè)的精確度，可用于出口檢驗(yàn)、食品安全檢驗(yàn)及動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。
【專利說明】一種犬細(xì)小病毒化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體的說涉及一種犬細(xì)小病毒化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]犬細(xì)小病毒(CPV)是美國(guó)Eugster于1978年從患處血性腸炎的犬糞便中發(fā)現(xiàn)的病毒，該病毒為細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬，單股線狀DNA病毒。犬細(xì)小病毒以導(dǎo)致犬發(fā)病率高，傳染性強(qiáng)、死亡率高等特點(diǎn)已成為犬科動(dòng)物臨床發(fā)病的重要致病病毒。犬細(xì)小病毒已成為我國(guó)養(yǎng)犬業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一，該病既影響著家養(yǎng)寵物的生命健康，又危害著我國(guó)養(yǎng)犬業(yè)、毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)及野生動(dòng)物保護(hù)業(yè)的發(fā)展。
[0003]目前，犬細(xì)小病毒的傳統(tǒng)檢測(cè)方法有血清學(xué)檢測(cè)方法和病原學(xué)檢測(cè)方法。血清學(xué)檢測(cè)方法主要為血凝試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和免疫膠體金檢測(cè)方法，但靈敏度不高、特異性不強(qiáng)。病原學(xué)檢測(cè)方法目前常用F81、MDCK等傳代細(xì)胞系分離培養(yǎng)病毒，病毒分離方法雖然在理論上可以檢出一個(gè)感染性的病毒粒子，確診犬細(xì)小病毒的感染，但也因分離病毒的操作繁瑣、代價(jià)高及確診緩慢等因素沒有投入臨床和滿足基層使用。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，目前已有多種PCR方法用于犬細(xì)小病毒的檢測(cè)，雖在靈敏度方面有所改進(jìn)，但由于需要精密儀器的配套使用，同樣也無法滿足現(xiàn)有檢測(cè)的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種具有高靈敏、高特異性、操作方法簡(jiǎn)單、反應(yīng)結(jié)果易于觀察，非常適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)犬細(xì)小病毒的化學(xué)發(fā)光試劑盒。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:一種犬細(xì)小病毒化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，包括盒體，盒體內(nèi)設(shè)有包被有濃度為10ug/mL的犬細(xì)小病毒包被抗體的聚苯乙烯96孔微孔板、犬細(xì)小病毒抗原質(zhì)控對(duì)照品、辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體溶液、犬細(xì)小病毒標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品稀釋液、濃縮洗滌液和化學(xué)發(fā)光液。
[0006]所述犬細(xì)小病毒抗原質(zhì)控對(duì)照品包括30-80IU/L的低質(zhì)控對(duì)照品和200-350IU/L的聞質(zhì)控對(duì)照品。
[0007]所述犬細(xì)小病毒標(biāo)準(zhǔn)溶液有6種,濃度分別為:16ng/mL、22ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、55ng/mL和 65ng/mL。
[0008]所述樣品稀釋液是將8g NaCU0.2g KH2PO4,22.9g Na2HPO4.12Η20、0.2g KCl 和酪蛋白溶于IOOOmL蒸餾水中制備而成，其中酪蛋白濃度為1%。
[0009]所述濃縮洗滌液是將80g NaCl,2.0g KH2PO4,229.0g Na2HPO4.12Η20、2.0g KCl 和吐溫-20溶于IOOOmL蒸餾水中制備而成，其中吐溫_20的濃度為5%。
[0010]所述化學(xué)發(fā)光液分為化學(xué)發(fā)光底物液A和化學(xué)發(fā)光底物液B兩種液體,化學(xué)發(fā)光底物液A為用Tris緩沖液配制的含2mmol/L魯米諾和0.2mmol/L對(duì)碘苯酹的混合液,化學(xué)發(fā)光底物液B為用Tris緩沖液配制的含7.5mmol/L雙氧水的混合液。[0011]所述辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體溶液為辣根過氧化酶-羊抗鼠IgG原液。
[0012]所述犬細(xì)小病毒包被抗體的包被過程是將犬細(xì)小病毒單克隆抗體溶于0.lmol/L的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液中形成10ug/mL的溶液，將上述溶液加入到聚苯乙烯96孔微孔板的各孔中，并在4°C下靜置12h，然后傾去上述溶液，用洗滌液洗滌各孔3次、拍干，然后向各孔加入150ul/孔的封閉液，并在37°C下孵育2h，傾去孔內(nèi)液體，洗滌液洗滌3次，拍干，最后將微孔板用鋁箔袋真空密封，并在4°C下保存。其中，所述的犬細(xì)小病毒單克隆抗體與0.lmol/L的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液的稀釋度為1:800，所述封閉液是由IOg BSA溶于IOOml水中，再加入5%的脫脂奶粉、1%的明膠、0.05%的NaN3制成的。
[0013]有益效果:本發(fā)明試劑盒靈敏度高可達(dá)3ng/mL，并且具有高特異性、寬檢測(cè)范圍、操作方法簡(jiǎn)單、反應(yīng)結(jié)果易于觀察等特點(diǎn)，不僅提高了檢測(cè)效率，而且保證了檢測(cè)的精確度，可用于出口檢驗(yàn)、食品安全檢驗(yàn)及動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0014]一種犬細(xì)小病毒化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，包括盒體，盒體內(nèi)設(shè)有包被有濃度為IOug/HiL的犬細(xì)小病毒包被抗體的聚苯乙烯96孔微孔板、犬細(xì)小病毒抗原質(zhì)控對(duì)照品、辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體溶液、犬細(xì)小病毒標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品稀釋液、濃縮洗滌液和化學(xué)發(fā)光液。
[0015]所述犬細(xì)小病毒抗原質(zhì)控對(duì)照品包括30-80IU/L的低質(zhì)控對(duì)照品和200-350IU/L的聞質(zhì)控對(duì)照品。
[0016]所述犬細(xì)小病毒標(biāo)準(zhǔn)溶液有6種,濃度分別為:16ng/mL、22ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、55ng/mL和 65ng/mL。
[0017]所述樣品稀釋液是將8g NaCU0.2g KH2PO4,22.9g Na2HPO4.12Η20、0.2g KCl 和酪蛋白溶于IOOOmL蒸餾水中制備而成，其中酪蛋白濃度為1%。
[0018]所述濃縮洗滌液是將80g NaCl,2.0g KH2PO4,229.0g Na2HPO4.12Η20、2.0g KCl 和吐溫-20溶于IOOOmL蒸餾水中制備而成，其中吐溫_20的濃度為5%。
[0019]所述化學(xué)發(fā)光液分為化學(xué)發(fā)光底物液A和化學(xué)發(fā)光底物液B兩種,化學(xué)發(fā)光底物液A為用Tris緩沖液配制的含2mmol/L魯米諾和0.2mmol/L對(duì)碘苯酹的混合液,化學(xué)發(fā)光底物液B為用Tris緩沖液配制的含7.5mmol/L雙氧水的混合液。
[0020]所述辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體溶液為辣根過氧化酶-羊抗鼠IgG原液。
[0021]所述犬細(xì)小病毒包被抗體的包被過程是將犬細(xì)小病毒單克隆抗體溶于0.lmol/L的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液中形成10ug/mL的溶液，將上述溶液加入到聚苯乙烯96孔微孔板的各孔中，并在4°C下靜置12h，然后傾去上述溶液，用洗滌液洗滌各孔3次、拍干，然后向各孔加入150ul/孔的封閉液，并在37°C下孵育2h，傾去孔內(nèi)液體，洗滌液洗滌3次，拍干，最后將微孔板用鋁箔袋真空密封，并在4°C下保存。其中，所述的犬細(xì)小病毒單克隆抗體與0.lmol/L的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液的稀釋度為1:800，所述封閉液是由IOg BSA溶于IOOml水中，再加入5%的脫脂奶粉、1%的明膠、0.05%的NaN3制成的。
[0022]應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)犬細(xì)小病毒的方法包括如下步驟:
(O配洗液:將濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋20倍，制成工作濃度的洗滌液；
(2)編號(hào):在所述包被過犬細(xì)小病毒包被抗體的聚苯乙烯96孔微孔板上設(shè)高質(zhì)控對(duì)照品孔、低質(zhì)控對(duì)照品孔、犬細(xì)小病毒標(biāo)準(zhǔn)溶液孔以及待檢樣品孔，并編號(hào)；
(3)加樣孔稀釋液:向待檢樣品孔加入樣品稀釋液，每孔90ul；
(4)加樣:分別向聞質(zhì)控對(duì)照品孔和低質(zhì)控對(duì)照品孔加入對(duì)應(yīng)的質(zhì)控對(duì)照品IOOul,向犬細(xì)小病毒標(biāo)準(zhǔn)溶液孔內(nèi)加入各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液IOOul/孔,并向各待檢樣品孔加入待檢樣品IOul,然后在37±2°C下溫育30分鐘；
(5)洗滌:傾出各孔中的液體，然后向各孔加入步驟(1)的洗滌液250yL，洗滌3次，拍
干;
(6)加酶標(biāo)羊抗鼠抗體溶液:將辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體溶液與步驟(1)的洗滌液配制成1:2500工作濃度的稀釋液，然后向各孔加入100 μ L上述稀釋液，再在37±2°C下溫育30分鐘；
(7)洗滌:傾出各孔中的液體，每孔加入步驟(1)的洗滌液250μ L，洗滌3次，拍干；
(8)加化學(xué)發(fā)光液:向各孔均先后加入化學(xué)發(fā)光底物液A和化學(xué)發(fā)光底物液B各50 μ L ；
(9)檢測(cè):用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定各孔的發(fā)光強(qiáng)度；
(10)結(jié)果判斷:以犬細(xì)小病毒標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度對(duì)數(shù)做橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的發(fā)光值對(duì)數(shù)做縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)每一個(gè)待檢樣品的發(fā)光值可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待檢樣品的濃度。
[0023]本發(fā)明試劑盒的特異性、靈敏度和精密度的檢測(cè)結(jié)果如下:
1、特異性試驗(yàn)結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種犬細(xì)小病毒化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，包括盒體，其特征在于:盒體內(nèi)設(shè)有包被有濃度為10ug/mL的犬細(xì)小病毒包被抗體的聚苯乙烯96孔微孔板、犬細(xì)小病毒抗原質(zhì)控對(duì)照品、辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體溶液、犬細(xì)小病毒標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品稀釋液、濃縮洗滌液和化學(xué)發(fā)光液； 所述犬細(xì)小病毒標(biāo)準(zhǔn)溶液有6種，濃度分別為:16ng/mL、22ng/mL、35ng/mL、40ng/mL、55ng/mL 和 65ng/mL ； 所述樣品稀釋液是將 8g NaCU0.2g KH2PO4,22.9g Na2HPO4.12H20、0.2g KCl 和酪蛋白溶于IOOOmL蒸餾水中制備而成，其中酪蛋白濃度為1%; 所述濃縮洗滌液是將 80g NaCl,2.0g KH2PO4,229.0g Na2HPO4.12Η20、2.0g KCl 和吐溫-20溶于IOOOmL蒸餾水中制備而成，其中吐溫_20的濃度為5% ； 所述化學(xué)發(fā)光液分為化學(xué)發(fā)光底物液A和化學(xué)發(fā)光底物液B兩種液體,化學(xué)發(fā)光底物液A為用Tris緩沖液配制的含2mmol/L魯米諾和0.2mmol/L對(duì)碘苯酹的混合液,化學(xué)發(fā)光底物液B為用Tris緩沖液配制的含7.5mmol/L雙氧水的混合液。
【文檔編號(hào)】G01N33/569GK103630688SQ201310556137
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月11日
【發(fā)明者】王善普, 李秀梅, 李長(zhǎng)印, 王會(huì)會(huì), 張莎莎 申請(qǐng)人:洛陽萊普生信息科技有限公司