專利名稱：一種犬細(xì)小病毒蜂膠滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種犬細(xì)小病毒蜂膠滅活疫苗及其制備方法，屬于獸醫(yī)生物制品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
犬細(xì)小病毒(Canine Parvovirus,CPV)感染是多發(fā)生于犬科動(dòng)物的ー種烈性傳染病。臨床表現(xiàn)以急性出血性腸炎和非化膿性心肌炎為特征。CPV屬細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒屬。CPV對(duì)多種理化因素和常用消毒劑具有較強(qiáng)的抵抗力。犬感染CPV發(fā)病急，死亡率高，常呈暴發(fā)性流行；不同年齡、性別、品種的犬均可感染；本病發(fā)生沒有明顯的季節(jié)性。近年來(lái)，隨著我國(guó)工作犬(軍犬、警犬、導(dǎo)盲犬等)、實(shí)驗(yàn)用犬和寵物犬飼養(yǎng)量的大幅増加，犬細(xì)小病毒感染日趨嚴(yán)重，給養(yǎng)業(yè)犬帶來(lái)了重大的經(jīng)濟(jì)損失，成為危害養(yǎng)犬業(yè)重大 疫病之一。本病發(fā)病迅速，疫苗免疫接種是預(yù)防本病的有效措施。本發(fā)明的目的是制備出ー種安全、有效的犬細(xì)小病毒蜂膠滅活疫苗，并以蜂膠作為佐劑制備ー種犬細(xì)小病毒蜂膠滅活疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用犬細(xì)小病毒株作為生產(chǎn)疫苗的毒株，通過在F81細(xì)胞在進(jìn)行病毒繁殖，經(jīng)過收獲、滅活，并以蜂膠作為佐劑制備一種犬細(xì)小病毒蜂膠滅活疫苗，以制備ー種既能減小犬注射疫苗后的不良反應(yīng)又能增強(qiáng)犬對(duì)該滅活病毒的應(yīng)答反應(yīng)。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的具體技術(shù)方案如下
一種犬細(xì)小病毒蜂膠滅活疫苗，犬細(xì)小滅活病毒以蜂膠為佐劑而制成的犬細(xì)小病毒蜂膠滅活疫苗。上述犬細(xì)小病毒蜂膠滅活疫苗的制備方法，具體步驟如下
(1)犬細(xì)小病毒的培養(yǎng)及滅活將細(xì)小病毒生產(chǎn)用疫苗株接種F81細(xì)胞36°C培養(yǎng)，當(dāng)接毒細(xì)胞有80%出現(xiàn)病變吋，收獲病毒細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)過O. 2%甲醛滅活，180轉(zhuǎn)/分鐘的搖床內(nèi)搖48小吋，以制備病毒滅活液；
(2)蜂膠液制備；
(3)按每ml疫苗含蜂膠干物質(zhì)含量為8 15mg標(biāo)準(zhǔn)添加蜂膠溶液攪拌15 20分鐘，使其充分混合乳化。進(jìn)ー步地，所述的蜂膠液制備由以下步驟完成選取已知純度的蜂膠，經(jīng)破碎后過篩，溶于95%的こ醇溶液，再根據(jù)要求配成適當(dāng)濃度的溶液于4°C下保存?zhèn)溆谩?4)本發(fā)明是以本發(fā)明人于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種室購(gòu)買的一株犬細(xì)小病毒CPVl作為生產(chǎn)疫苗的毒株，犬細(xì)小病毒CPV1，2003. 3. 3，凍干(O. 5ml)，有效期15年。本發(fā)明的犬細(xì)小病毒蜂膠滅活疫苗的用途，主要用于控制犬細(xì)小病毒病。
具體實(shí)施方式
I.細(xì)小病毒滅活原液的制備。(I)將生長(zhǎng)良好的F81細(xì)胞按常規(guī)方法傳代，待細(xì)胞長(zhǎng)成80%單層后，傾去生長(zhǎng)液，換以含1%毒種的維持液(含2%新生牛血清的MEM)，置36°C繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)瓶轉(zhuǎn)速為8 IOr / h。(2)接種后，毎日觀察細(xì)胞病變，當(dāng)細(xì)胞病變(CPE)達(dá)80%左右時(shí)即可收獲，凍融I次，置_15°C以下凍結(jié)保存，待檢備用。(3)按病毒液總量的O. 2%加入甲醛溶液，充分混勻，置36°C下滅活，待溫度升至36°C開始計(jì)吋，180轉(zhuǎn)/分鐘的搖床中不間斷搖動(dòng)，滅活48小吋。2.佐劑原液的制備 選取購(gòu)自山東臨清市清坤蜂蠟巢礎(chǔ)加工廠已知純度的蜂膠，經(jīng)破碎后過篩，溶于95%的こ醇溶液，再根據(jù)要求配成適當(dāng)濃度的溶液于4°C下保存?zhèn)溆谩?.成品的制備
按每ml疫苗含蜂膠干物質(zhì)含量為8 15mg標(biāo)準(zhǔn)添加蜂膠溶液攪拌15 20分鐘，使其充分混合乳化。4.犬細(xì)小病毒蜂膠滅活疫苗的檢驗(yàn)方法
(I)性狀本品靜置后，上層為粉紅色液體，下層為淡粉紅色沉淀，振搖后呈均勻混懸液。(2)無(wú)菌檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行檢驗(yàn),應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。(3)安全檢驗(yàn)用2 10月齡健康易感犬5只，各皮下注射疫苗3ml，連續(xù)觀察10日，應(yīng)全部健活。(4)效カ檢驗(yàn)用2 10月齡健康易感犬5只，各皮下注射疫苗Iml，同時(shí)設(shè)不接種對(duì)照犬5只。免疫后14日采血，分離血清，分別測(cè)定抗MEV HI抗體，免疫犬抗MEVHI抗體均應(yīng)彡I :32，對(duì)照犬抗MEV HI抗體均應(yīng)彡I :4。5.甲醛和汞類防腐劑殘留量測(cè)定按《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)符合獸用生物制品通則的規(guī)定。6.犬細(xì)小病毒蜂膠滅活疫苗安全性試驗(yàn)
(I)最小使用日齡犬一次單劑量接種疫苗的安全性試驗(yàn)取49日齡健康易感犬20只，隨機(jī)分成4組，5只/組。前3組分別皮下接種本發(fā)明人按本發(fā)明提供的方法制備的3個(gè)批次的疫苗(第I批、第2批和第3批)，Iml/只；第4組不接種作為對(duì)照。相同條件下飼養(yǎng)，觀察10日，每日觀察犬精神、飲食、糞便是否正常，注射部位及全身有無(wú)不良反應(yīng)。經(jīng)皮下途徑一次單劑量接種犬后，犬精神狀態(tài)、飲食、糞便均正常，注射部位及全身未見不良反應(yīng)，所有犬均健活。(2)單劑量重復(fù)接種疫苗的安全性試驗(yàn)取49日齡健康易感犬20只，隨機(jī)分成4組，5只/組。前3組分別皮下接種以上本發(fā)明人制備的3個(gè)批次的疫苗，Iml/只，14日后加強(qiáng)免疫一次，Iml/只；第4組不接種作為對(duì)照。相同條件下飼養(yǎng)，觀察10日，每日觀察犬精神、飲食、糞便是否正常，注射部位及全身有無(wú)不良反應(yīng)。經(jīng)皮下途徑重復(fù)接種疫苗后，犬精神狀態(tài)、飲食、糞便均正常，注射部位及全身未見不良反應(yīng)，所有犬均健活。(3)-次超劑量接種疫苗的安全性試驗(yàn)取49日齡健康易感犬20只，隨機(jī)分成4組，5只/組。前3組分別皮下接種3個(gè)批次疫苗，3ml /只；第4組不接種作為對(duì)照。相同條件下飼養(yǎng)，觀察10日，每日觀察犬精神、飲食、糞便是否正常，注射部位及全身有無(wú)不良反應(yīng)。(4)疫苗對(duì)懷孕母犬的安全性試驗(yàn)取懷孕母犬10只，隨機(jī)分成2組，5只/組。第I組于產(chǎn)前20日皮下接種疫苗，3ml /只；第2組不接種作為對(duì)照。相同條件下飼養(yǎng)，觀察10日，每日觀察犬精神、飲食、糞便是否正常，注射部位及全身有無(wú)不良反應(yīng)，并跟蹤觀察其產(chǎn)仔情況。懷孕母犬于產(chǎn)前20日經(jīng)皮下超劑量接種后，母犬精神狀態(tài)、飲食、糞便均正常，注射部位及全身末見不良反應(yīng)，所有犬均健活，且產(chǎn)仔正常。(5)結(jié)論用3批犬細(xì)小病毒蜂膠滅活疫苗進(jìn)行了一次單劑量接種的安全試驗(yàn)、單劑量重復(fù)接種的安全性試驗(yàn)、一次超劑量接種的安全試驗(yàn)及對(duì)懷孕母犬一次超劑量接種的安全性試驗(yàn)，結(jié)果均是安全的。表明該疫苗用于免疫接種犬是安全的。7.犬細(xì)小病毒蜂膠滅活疫苗效カ試驗(yàn)
取以上本發(fā)明人制備的3批犬細(xì)小病毒蜂膠滅活疫苗，使用前將疫苗分別用水稀釋至一定劑量。取健康易感犬20只，隨機(jī)分為4組，5只/組。1、2、3組犬分別皮下免疫3批疫苗
I.Oml/只，對(duì)照組不進(jìn)行免疫。3個(gè)免疫組和對(duì)照組在免疫后14日ロ服細(xì)胞培養(yǎng)株強(qiáng)毒液15ml (含15X107 TCID50)攻毒，觀察10日，記錄發(fā)病情況。3批疫苗試驗(yàn)結(jié)果無(wú)明顯差異。疫苗免疫后14日，對(duì)犬腸炎病毒株強(qiáng)毒的攻毒保護(hù)率均為100%。8.本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明是利用細(xì)小病毒CPVl株作為生產(chǎn)疫苗的病毒株，通過在F81細(xì)胞上進(jìn)行病毒繁殖，經(jīng)過收獲、滅活制得細(xì)小病毒滅活原液。并以蜂膠作為佐劑，以加強(qiáng)滅活苗的作用，井能減小注射疫苗后的不良反應(yīng)，因此是安全、有效的犬細(xì)小病毒蜂膠滅活疫苗。權(quán)利要求
1.一種犬細(xì)小病毒蜂膠滅活疫苗，其特征在于犬細(xì)小病毒株在F81細(xì)胞上進(jìn)行病毒繁殖，經(jīng)過收獲、滅活，并以蜂膠作為佐劑混合制成滅活苗。
2.權(quán)利要求I所述的滅活疫苗的制備方法，主要包括如下步驟 1)細(xì)小病毒滅活原液的制備； 2)蜂膠溶液的制備； 3)成品疫苗制備按每ml疫苗含蜂膠干物質(zhì)含量為8 15mg標(biāo)準(zhǔn)添加蜂膠溶液攪拌15 20分鐘，使其充分混合乳化。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的犬細(xì)小病毒滅活原液的制備步驟包括將生長(zhǎng)良好的F81細(xì)胞按常規(guī)方法傳代，待細(xì)胞長(zhǎng)成80%單層后，傾去生長(zhǎng)液，換以含1%毒種的維持液(含2%新生牛血清的MEM)，置36°C繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)瓶轉(zhuǎn)速為8 IOr / h ;接種后，每日觀察細(xì)胞病變，當(dāng)細(xì)胞病變(CPE)達(dá)80%左右時(shí)即可收獲，凍融I次，置_15°C以下凍結(jié)保存，待檢備用；按病毒液總量的O. 2%加入甲醛溶液，充分混勻，置36°C下滅活，待溫度升至36°C開始計(jì)吋，180轉(zhuǎn)/分鐘的搖床中不間斷搖動(dòng)，滅活48小吋。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，蜂膠液制備由以下步驟完成選取已知純度的蜂膠，經(jīng)破碎后過篩，溶于95%的こ醇溶液，再根據(jù)要求配成適當(dāng)濃度的溶液于4°C下保存?zhèn)溆谩?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求2-3任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，成品疫苗為黃褐色混懸液，密封保存于4-8°C中。
6.權(quán)利要求I所述的犬細(xì)小病毒蜂膠滅活疫苗的用途，主要是用于犬細(xì)小病毒病的免疫。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種犬細(xì)小病毒蜂膠滅活苗及其制備方法。本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容是將犬細(xì)小病毒株在F81細(xì)胞上進(jìn)行病毒繁殖，經(jīng)過收獲、滅活，并以蜂膠作為佐劑制備一種犬細(xì)小病毒蜂膠滅活疫苗。本疫苗能夠有效預(yù)防犬源細(xì)小病毒病的發(fā)生，并能顯著減少注射疫苗后的不良反應(yīng)，為寵物疾病的控制創(chuàng)造條件。
文檔編號(hào)C12N7/02GK102657860SQ20121013088
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年5月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月1日
發(fā)明者單虎, 張傳美, 楊瑞梅, 秦曉冰, 韓先杰, 黃娟 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)