專利名稱：一種穩(wěn)定的hrp酶促化學(xué)發(fā)光底物液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫分析領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及一種以HRP為酶促反應(yīng)的檢測(cè)體系的化學(xué)發(fā)光底物液。
背景技術(shù)：
化學(xué)分析免疫法(chemiluminescence immunoassay, CLIA)是將化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)結(jié)合，以檢測(cè)抗體或抗原，它既具有免疫反應(yīng)的特異性，又具有化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的高靈敏性。其具體過(guò)程是將化學(xué)發(fā)光反應(yīng)試劑(可以是化學(xué)發(fā)光試劑或催化劑等)標(biāo)記抗體或抗原，標(biāo)記后的抗體或抗原與待測(cè)物經(jīng)過(guò)一系列的免疫反應(yīng)和理化步驟，最后以檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度的形式測(cè)定待測(cè)物得含量。它克服了放射性免疫(RIA)因使用放射性同位素而引起的放射性危害及污染問(wèn)題；克服了熒光免疫分析(FIA)中所需儀器復(fù)雜，背景干擾大的缺點(diǎn)。以其高的靈敏度、低的儀器價(jià)格、使用簡(jiǎn)便、安全、無(wú)放射性污染等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，倍受人們的青睞，成為標(biāo)記免疫的一個(gè)重要方向。其中以吖啶酯(AE)，堿性磷酸酶(ALP)和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)為標(biāo)記物的化學(xué)發(fā)光免疫分析為主要發(fā)展趨勢(shì)。魯米諾是人們最早了解的化學(xué)發(fā)光化合物之一，它的發(fā)光機(jī)理與反應(yīng)條件有很大關(guān)系。辣根過(guò)氧化物酶可以催化魯米諾-過(guò)氧化氫反應(yīng)。由于魯米諾體系化學(xué)發(fā)光反應(yīng)有一個(gè)決定性的氧化步驟，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記到抗原或抗體上時(shí)，由于蛋白質(zhì)大分子的空間位阻作用，往往使氧化步驟受到抑制；魯米諾體系化學(xué)發(fā)光反應(yīng)通常需要在強(qiáng)堿性介質(zhì)中進(jìn)行，而強(qiáng)的堿性對(duì)酶的活性會(huì)產(chǎn)生一定的抑制作用，因此利用魯米諾-過(guò)氧化氫-辣根過(guò)氧化物酶直接測(cè)定生物大分子靈敏度低。直至八十年代中后期，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了某些可以大大增強(qiáng)酶催化魯米諾化學(xué)發(fā)光體系發(fā)光強(qiáng)度的物質(zhì)(這些物質(zhì)被稱為增強(qiáng)劑)才使這項(xiàng)技術(shù)迅速地應(yīng)用到基因分析及免疫檢測(cè)領(lǐng)域。在增強(qiáng)劑的存在下，魯米諾的發(fā)光強(qiáng)度可被提高1000倍，而且還可以大大降低氧化劑與發(fā)光劑等單獨(dú)作用時(shí)出現(xiàn)的“本底”發(fā)光。與原來(lái)無(wú)增強(qiáng)劑的體系相比，加入增強(qiáng)劑后組成的魯米諾體系的靈敏度大大提高，同時(shí)可將發(fā)光時(shí)間延長(zhǎng)至幾小時(shí)。使得原來(lái)用發(fā)光儀才能檢測(cè)到的瞬時(shí)發(fā)光變成了可用感光膠片就能檢測(cè)的持續(xù)發(fā)光，這些重大的改進(jìn)使得該體系在基因、免疫分析領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用?，F(xiàn)在市場(chǎng)上的發(fā)光底物穩(wěn)定性差、發(fā)光強(qiáng)度低、本底偏高，這些嚴(yán)重限制了化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)的應(yīng)用，針對(duì)這些問(wèn)題，我們對(duì)其配方進(jìn)行了研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服市場(chǎng)上常規(guī)化學(xué)發(fā)光底物的上述缺陷，獲得一種穩(wěn)定的 HRP酶促化學(xué)發(fā)光底物液。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種穩(wěn)定的HRP酶促化學(xué)發(fā)光底物液，其特征是，主要由發(fā)光劑溶液A和氧化劑溶液B組成，在使用前將發(fā)光劑溶液A和氧化劑溶液B以體積比 2 3 3 2 (最佳體積比為1 1)混合；
所述發(fā)光溶液A含有以下組分
魯米諾或魯米諾衍生物0.5~5mmol/L
對(duì)碘苯酚0.1~lmmol/L
4- (1,2,4-三氮唑-1-基)苯酚 0.5~5mmol/L N，N-ニ甲基甲酰胺0.5-10%(v/v)
乙ニ胺四乙酸ニ鈉鹽l~5mmol/L
苯甲酸鈉0.0レ0.5 mmol/L
氯化鈉l~5mmol/L
O.lmol/L Tris-HCl 緩沖液pH 8.0-9.0；所述氧化劑溶液B含有以下組分
雙氧水0.1~5mmol/L
過(guò)硼酸鈉0.1~5mmol/L
苯甲酸鈉0.0レ0.5 mmol/L
乙ニ胺四乙酸ニ鈉鹽l~5mmol/L
O.lmol/L Tris-HCl 緩沖液pH 8.0~9.0。在上述方案的基礎(chǔ)上，進(jìn)ー步優(yōu)化各組分的濃度，確定最優(yōu)濃度為A液魯米諾或魯米諾衍生物1 .Ommol/L
對(duì)碘苯酚0.5mmol/L
4- (1,2,4-三氮唑-1-基)苯酚l.5mmol/L
N，N-ニ甲基甲酰胺l%(v/v)
乙ニ胺四乙酸ニ鈉鹽5mmol/L
苯甲酸鈉O.lmmol/L
氯化鈉3mmol/L
O.lmol/L Tris-HCl 緩沖液pH 8.4；B液
雙氧水0.5 mmol/L
過(guò)硼酸鈉0.5 mmol/L
苯甲酸鈉0.1 mmol/L
乙ニ胺四乙酸ニ鈉鹽5mmol/L
O.lmol/L Tris-HCl 緩沖液pH 8.4。所述4-(l-H-l，2，4-三氮唑)苯酚(英文名稱:4_ (1，2，4-Triazol-l-yl) phenol ；
CAS 號(hào)為 68337-15-5，結(jié)構(gòu)式
權(quán)利要求
1. 一種穩(wěn)定的HRP酶促化學(xué)發(fā)光底物液，其特征是，主要由發(fā)光劑溶液A和氧化劑溶液 B組成，在使用前將發(fā)光劑溶液A和氧化劑溶液B以體積比2 3 3 2混合； 所述發(fā)光溶液A含有以下組分魯米諾或魯米諾衍生物0.5~5mmol/L對(duì)碘苯酚4- (1,2,4-三氮唑-1-基)苯酚 N，N-二甲基甲酰胺乙二胺四乙酸二鈉鹽苯甲酸鈉氯化鈉0.1mol/L Tris-HCl 緩沖液所述氧化劑溶液B含有以下組分 雙氧水過(guò)硼酸鈉苯甲酸鈉乙二胺四乙酸二鈉鹽 0.1mol/L Tris-HCl 緩沖液0.1-1 mmol/L 0.5~5mmol/L 0.5-10%(v/v) l~5mmol/L 0.01-0.5 mmol/L l~5mmol/L pH 8.0-9.0；0.1-5 mmol/L 0.1-5 mmol/L 0.01-0.5 mmol/L l~5mmol/LpH8.0~9.0t
2.如權(quán)利1所述的一種穩(wěn)定的HRP酶促化學(xué)發(fā)光底物液，其特征是，在使用前將發(fā)光劑溶液A和氧化劑溶液B以體積比11混合。
3.如權(quán)利要求1或2所述的一種穩(wěn)定的HRP酶促化學(xué)發(fā)光底物液，其特征是， 所述發(fā)光溶液A含有以下組分魯米諾或魯米諾衍生物1 .Ommol/L對(duì)碘苯酚0.5mmol/L4- (1,2,4-三氮唑-1-基)苯酚1.5mmol/LN，N-二甲基甲酰胺1%(ν/ν)乙二胺四乙酸二鈉鹽5mmol/L苯甲酸鈉O.lmmol/L氯化鈉3mmol/LO.lmol/L Tris-HCl 緩沖液pH 8.4；所述氧化劑溶液B含有以下組分雙氧水0.5 mmol/L過(guò)硼酸鈉0.5 mmol/L苯甲酸鈉O.lmmol/L乙二胺四乙酸二鈉鹽5mmol/LO.lmol/L Tris-HCl 緩沖液pH 8.4。
4.如權(quán)利要求1或2所述的一種穩(wěn)定的HRP酶促化學(xué)發(fā)光底物液，其特征是，所述魯米諾衍生物為異魯米諾、4-氨基乙基-N-乙基異魯諾或魯米諾單鈉鹽。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種穩(wěn)定的HRP酶促化學(xué)發(fā)光底物液。它主要由發(fā)光劑溶液A和氧化劑溶液B組成，在使用前將發(fā)光劑溶液A和氧化劑溶液B以體積比2∶3～3∶2混合。其中發(fā)光劑溶液A含有發(fā)光劑魯米諾或魯米諾衍生物、增強(qiáng)劑對(duì)碘苯酚和4-(1，2，4-三氮唑-1-基)苯酚等，氧化劑溶液B含有過(guò)硼酸鈉和雙氧水等。本發(fā)明應(yīng)用于HRP酶促反應(yīng)具有反應(yīng)時(shí)間短、檢測(cè)平臺(tái)期長(zhǎng)的特點(diǎn)，在4-8℃可穩(wěn)定保存2年，可廣泛應(yīng)用于各種以HRP為檢測(cè)目標(biāo)的試劑盒中。
文檔編號(hào)G01N33/52GK102435598SQ201110262359
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月6日
發(fā)明者張泓, 王進(jìn), 胡曉飛, 譚柏清 申請(qǐng)人:山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司