檢測人乳頭狀瘤病毒13種亞型的熒光pcr試劑盒及其方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測人乳頭狀瘤病毒13種亞型的熒光PCR試劑盒及其方法。所述的試劑盒包括：PCR反應(yīng)液，PCR混合液，陽性標(biāo)準(zhǔn)品，內(nèi)參考品和陰性參考品。本發(fā)明采用了獨(dú)特的四重?zé)晒舛縋CR技術(shù)，分別設(shè)計(jì)人乳頭狀瘤病毒的13種亞型的對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增引物和探測探針，分為2管可一次性分型定量檢測人乳頭狀瘤病毒的6種高危亞型，合并分型檢測在中國人群中不常見的7種高危亞型。
【專利說明】檢測人乳頭狀瘤病毒13種亞型的熒光PCR試劑盒及其方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測人乳頭狀瘤病毒13種亞型的熒光PCR試劑盒及其方法，屬于 人乳頭狀瘤病毒亞型的檢測領(lǐng)域。本發(fā)明涉及應(yīng)用多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在兩個(gè)PCR 反應(yīng)管中同時(shí)快速地定型定量檢測6種高危亞型的人乳頭狀瘤病毒（HPV-16,18, 31，33， 52,58)及合并定型檢測7種中國人不常見的高危亞型人乳頭狀瘤病毒（HPV-35, 39,45, 51， 56, 59,68)的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 人乳頭狀瘤病毒（Human Papilloma Virus, HPV)
[0003] 是一種雙鏈DNA病毒，屬于乳頭瘤病毒屬，是一種特異性感染皮膚或粘膜復(fù)層上 皮的病毒。目前，HPV已被發(fā)現(xiàn)的亞型有接近兩百種，其中大部分感染人類后并沒有表現(xiàn)出 明顯的癥狀，少數(shù)部分有病理表現(xiàn)，有些可能會(huì)引起人類疣，如生長在生殖器附近皮膚和粘 膜上的人類尋常疣、尖銳濕疣。一些高危亞型會(huì)引起人類的腫瘤，導(dǎo)致宮頸癌、陰道癌、肛門 癌、陰莖癌等的發(fā)生。其中超過30種HPV亞型的傳播是通過性接觸而引起生殖區(qū)的病變。
[0004] HPV感染是宮頸癌的直接病因，從感染到最終宮頸癌的發(fā)生對(duì)大多數(shù)患者而言有 一個(gè)緩慢的潛伏期。因此，及時(shí)定期對(duì)宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行HPV的檢測在宮頸癌的早期篩查、 輔助診斷和愈后評(píng)估等環(huán)節(jié)中顯得尤為重要。宮頸癌早期癥狀不明顯，篩查預(yù)警對(duì)早期發(fā) 現(xiàn)宮頸癌，降低死亡率極為重要。目前HPV的診斷完全依賴于臨床標(biāo)本中HPV DNA的檢測。 HPV分型與臨床的結(jié)合研究已經(jīng)證實(shí)不同的HPV基因型和不同的病毒載量有著不同的致癌 性，因而HPV DNA的分型定量檢測對(duì)宮頸癌及女性生殖道腫瘤的病因?qū)W和癌前預(yù)報(bào)具有重 要的意義。
[0005] 由于HPV至今尚不能在體外培養(yǎng)，又無合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，因而對(duì)其檢測主要依賴 于形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)檢測技術(shù)。目前HPV檢測方法主要有組織細(xì)胞病理學(xué)檢測、 斑點(diǎn)印跡法、突光原位雜交法、Southern雜交法、多聚合酶鏈反應(yīng)法（Polymerase Chain Reaction，PCR)和雜交捕獲法等。細(xì)胞學(xué)法敏感度和特異度較低，斑點(diǎn)印跡法具有放射性。 敏感度較高的方法有原位雜交與傳統(tǒng)PCR法，但核酶印跡原位雜交法復(fù)雜，傳統(tǒng)PCR法特異 性很低，假陽性率較高，不宜大規(guī)模臨床使用。
[0006] 目前HC-II是一通過食品和藥物管理局（FDA)批準(zhǔn)的可臨床使用的檢測HPVDNA 的技術(shù)，但其不能對(duì)HPV進(jìn)行具體分型，且存在交叉雜交的問題。
[0007] 多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)不僅可以檢測具體型別還可以檢測所有型別，是一個(gè)有較 大發(fā)展前景的方法。針對(duì)現(xiàn)有方法的缺點(diǎn)和不足，我們通過不斷的努力，將各種檢測方法有 機(jī)結(jié)合，取長補(bǔ)短，研發(fā)出簡單、快速、方便、價(jià)廉，且敏感性、特異性很高的HPV檢測方法并 應(yīng)用于宮頸癌的篩查中。
[0008] 以突光標(biāo)記探針為基礎(chǔ)的實(shí)時(shí)突光PCR技術(shù)，在目如國內(nèi)的臨床診斷中應(yīng)用最為 廣泛。在采用探針法的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系中，根據(jù)所檢測病原體的種類，還可以分為單 重或多重實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，反應(yīng)體系中往往包括一對(duì)或多對(duì)特異性PCR引物及探針，通過 研發(fā)過程中的條件摸索，探針及引物只與相對(duì)應(yīng)的模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條 弓丨物之間。探針的5'端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)（Importer，R)，如FAM、VIC、ROX等，3'端標(biāo)記有 熒光淬滅基團(tuán)（Quencher，Q)，如BHQ1、BHQ2、TAMRA等。當(dāng)探針完整的時(shí)候，報(bào)告基團(tuán)所發(fā) 射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測不到信號(hào)。隨著PCR的進(jìn)行，Taq DNA聚合酶在鏈 延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其5' -3'外切核酸酶活性就會(huì)將探針切斷，報(bào)告基 團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號(hào)。所以，每經(jīng)過一個(gè)PCR循環(huán)，熒光信 號(hào)也和目的片段一樣，有一個(gè)同步指數(shù)增長的過程。采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測HPV各亞 型的關(guān)鍵是需要設(shè)計(jì)出能夠特異、靈敏的檢測出各亞型的PCR引物及探針。
[0009] 目前市場上有兩類HPV診斷試劑盒一類是用PCR熒光法和單一熒光染料生產(chǎn)HPV 診斷試劑盒，由于產(chǎn)品中所有的探針分子都使用相同的熒光染料，這種產(chǎn)品不能分辨出HPV 亞型類別，也無法檢測出HPV不同亞型的量。另一類產(chǎn)品是用基因芯片法生產(chǎn)的，這種產(chǎn)品 能分辨出各種不同的HPV亞型類別，但不能檢測出它們的量。此外基因芯片法的試劑盒，操 作復(fù)雜、測試時(shí)間長、成本高、不易推廣。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的主要目的是提供一種能夠一次性檢測人乳頭狀瘤病毒13種亞型熒光 PCR試劑盒及其方法。該發(fā)明用于對(duì)生殖泌尿道分泌物及宮頸脫落細(xì)胞中的6種高危中國 人常見的人乳頭瘤病毒亞型進(jìn)行亞型分辨和定量測定，對(duì)7種高危不常見的病毒亞型進(jìn)行 合并定性檢測。
[0011] 人乳頭狀瘤病毒13種亞型的熒光PCR檢測方法包括如下步驟：
[0012] (1)引物設(shè)計(jì)：在基因庫中檢索獲得13種亞型的人乳頭瘤病毒，即HPV-16，18,31， 33, 35, 39,45, 51，52, 56, 58, 59,68特異性的保守基因，通過網(wǎng)上序列比對(duì)，確定各亞型的高 度保守序列區(qū)，作為待檢靶基因特異性核酸序列設(shè)計(jì)特異引物；
[0013] (2)熒光探針的設(shè)計(jì)：根據(jù)步驟（1)中的13種亞型的待檢測靶基因特異性核酸序 列設(shè)計(jì)熒光探針；
[0014] (3)標(biāo)準(zhǔn)分子的構(gòu)建：根據(jù)步驟⑴中的引物，利用基因克隆技術(shù)構(gòu)建6種分別含 有HPV-16,18, 31，33, 52, 58高度保守序列區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子；
[0015] (4)多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系的組成：使用步驟⑴中的引物和步驟⑵中的探針 及PCR反應(yīng)液、待檢測樣品組成多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系；
[0016] (5)多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系的優(yōu)化及建立：通過調(diào)節(jié)不同濃度的引物和探針的組 合，組成不同的多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系，根據(jù)反應(yīng)效率和曲線確定最終的PCR反應(yīng)體 系；
[0017] (6)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：使用步驟（5)中的多重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系，將已知拷貝數(shù)的含 有目的擴(kuò)增片段的重組質(zhì)粒連續(xù)按10倍的倍比稀釋，作為待檢測樣品加入到熒光定量PCR 反應(yīng)中，綜合分析儀器給出的各項(xiàng)數(shù)據(jù)，設(shè)定合理的閾值（Threshold)和基線（Baseline), 進(jìn)行結(jié)果分析，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0018] (7)臨床標(biāo)本檢測：用已知HPV基因型和病毒載量的臨床標(biāo)本提取的病毒DNA作 為模板，進(jìn)一步用權(quán)力要求中的（4)和（5)方法和條件進(jìn)行多重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增。
[0019] 所述的特異性的保守基因指的是衣殼蛋白編碼區(qū)（LI)基因。
[0020] 所述的待檢測基因特異性核苷酸序列指的是針對(duì)每一種亞型病毒基因所特有的 一段基因序列。
[0021] 所述的特異性熒光定量PCR引物指的是長度為20-30bp的寡核苷酸鏈，與待檢測 靶基因特異性核酸序列完全相同或互補(bǔ)。
[0022] 所述的特異性熒光定量PCR熒光探針，指的是長度為20_30bp的寡核苷酸鏈與待 檢測靶基因特異性核酸序列完全相同或互補(bǔ)，所有探針的5'端和3'端均使用熒光進(jìn)行 記。

【權(quán)利要求】
1. 檢測人乳頭狀瘤病毒13種亞型的熒光PCR試劑盒及其方法，試劑盒包括以下各組 分：PCR反應(yīng)液，PCR混合液，陽性標(biāo)準(zhǔn)品，內(nèi)參考品和陰性參考品；所述的PCR反應(yīng)液包括 丁&9〇嫩聚合酶、81^€61~、1%(：12和(1階1^，所述陽性標(biāo)準(zhǔn)品為含即￥不同亞型高度保守序列 的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子DNA，所述的內(nèi)參考品為含人體基因高度保守序列的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子DNA，所 述陰性參考品為滅菌的超純水，所述的PCR混合液包括13套分別擴(kuò)增HPV13個(gè)亞型的引物 和檢測HPV13個(gè)亞型的探針和1套檢測人體基因的引物和探針，分別介紹如下： 用于檢測人乳頭狀瘤病毒16亞型的正向引物序列為SEQ ID NO :1，反向引物序列為 SEQ ID N0:2,熒光探針序列為SEQ ID N0:3,其中5'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3'標(biāo)記熒 光淬滅基團(tuán)BHQ ;用于檢測人乳頭狀瘤病毒18亞型正向引物序列為SEQ IDN0 :4,反向引物 序列為3￡〇10勵(lì)：5，熒光探針序列為5￡〇10勵(lì)：6，其中5'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)冊(cè)乂，3' 標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)BHQ ;用于檢測人乳頭狀瘤病毒31亞型的正向引物序列為SEQ IDN0 :7， 反向引物序列為SEQ IDN0 :8,熒光探針序列為SEQ ID NO :9,其中5'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán) HEX，3'標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)BHQ;用于檢測人乳頭狀瘤病毒33亞型的正向引物序列為SEQ ID NO :10,反向引物序列為SEQ ID NO :11，熒光探針序列為SEQ ID NO :12,其中5'端標(biāo)記熒 光報(bào)告基團(tuán)R0X，3'標(biāo)記突光淬滅基團(tuán)BHQ;用于檢測人乳頭狀瘤病毒35亞型的正向引物 序列為SEQ ID N0:13,反向引物序列為SEQ ID N0:14,熒光探針序列為SEQ ID N0:15,其 中5'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3'標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)BHQ ;用于檢測人乳頭狀瘤病毒39亞 型的正向引物序列為SEQ ID N0:16,反向引物序列為SEQ ID N0:17,熒光探針序列為SEQ ID NO :18,其中5'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3'標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)BHQ ;用于檢測人乳頭狀 瘤病毒45亞型的正向引物序列為SEQ ID N0:19,反向引物序列為SEQ ID N0:20,熒光探 針序列為SEQ ID NO :21，其中5'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3'標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)BHQ;用 于檢測人乳頭狀瘤病毒51亞型的正向引物序列為SEQ ID NO :22,反向引物序列為SEQ ID NO :23,熒光探針序列為SEQ ID NO :24,其中5'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3'標(biāo)記熒光淬滅 基團(tuán)BHQ;用于檢測人乳頭狀瘤病毒52亞型的正向引物序列為SEQ IDN0 :25，反向引物序列 為SEQ ID NO :26,熒光探針序列為SEQ ID NO :27,其中5'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)CY5,3'標(biāo) 記熒光淬滅基團(tuán)BHQ;用于檢測人乳頭狀瘤病毒56亞型的正向引物序列為SEQ ID NO :28， 反向引物序列為SEQ ID NO :29,熒光探針序列為SEQ ID NO :30,其中5'端標(biāo)記熒光報(bào)告 基團(tuán)CY5, 3'標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)BHQ ;用于檢測人乳頭狀瘤病毒58亞型的正向引物序列為 SEQ ID N0:31，反向引物序列為SEQ ID N0:32,熒光探針序列為SEQ ID N0:33,其中5'端 標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)R0X，3'標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)BHQ;用于檢測人乳頭狀瘤病毒59亞型的正 向引物序列為SEQIDN0:34,反向引物序列為SEQ IDN0:35,熒光探針序列為SEQ ID N0:36， 其中5'端標(biāo)記突光報(bào)告基團(tuán)FAM，3'標(biāo)記突光淬滅基團(tuán)BHQ;用于檢測人乳頭狀瘤病毒68 亞型的正向引物序列為SEQ IDN0 :37,反向引物序列為SEQ IDN0 :38,熒光探針序列為SEQ ID NO :39,其中5'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3'標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)BHQ ;用于內(nèi)參的檢測人 體基因的正向引物序列為SEQ ID N0:40,反向引物序列為SEQ ID N0:41，熒光探針序列為 SEQ ID NO :42,其中5'端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)CY5,3'標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)BHQ。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測人乳頭狀瘤病毒13種亞型的熒光PCR試劑盒及其方法， 其特征在于：所述探針與引物組成的混合液分裝于甲、乙兩管中； 甲管中含有0. 5-1. 5 ill的探針A及其上、下游引物各1. 5-2. 5 iUO. 5-1. 5 ill的探針 B及其上、下游引物各1.5-2. 5iU ;1.0-2.0ia的探針C及其上、下游引物各1.5-2. 5iU ; 0. 7-1. 7 ill的探針D及其上、下游引物各1. 5-2. 5 ill ;以及補(bǔ)滅菌超純水至100 ill ; 乙管中含有0. 4-1. 4iil探針E及其上、下游引物各1. 5-2. 5 ill ;0. 62-1. 62 ill探針 F及其上、下游引物各1.5-2. 5iU ;0. 5-1. 5iU探針G及其上、下游引物各1.5-2. 5iU ; 0. 5-1.5iil探針H及其上、下游引物各1.5-2. 5iU ;0. 3-1.3iil探針I(yè)及其上、下游引 物各 1. 5-2. 5iil;0. 5-1. 5iil 探針 J 及其上、下游引物各 1. 5-2. 5iil ;0. 3-1. 3iil 探針 K及其上、下游引物各0.5-1. 5 ill; 0.7-1. 7 探針L及其上、下游引物各1.5-2. 5 yl ; 0. 5-1. 5iil探針M及其上、下游引物各1. 5-2. 5iil;0. 1-1. liil探針N及其上、下游引物各 0. 7-1. 7 ill ;以及補(bǔ)滅菌超純水到100 ill。
3. -種采用權(quán)利要求1所述的檢測人乳頭狀瘤病毒13種亞型的熒光PCR試劑盒 及其方法，其特征在于：所述的PCR反應(yīng)液儲(chǔ)于丙管中，由6-lOiU的Taq DNA聚合酶、 60-100 ii 1 的 PCR Buffer、80-100 ii 1 的 MgCl2、15-25 ii 1 的 dNTPs 組成。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測人乳頭狀瘤病毒13種亞型的熒光定量PCR試劑盒的使 用方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 配制各反應(yīng)管的溶液：包括PCR混合液5iU，PCR反應(yīng)液5iU，滅菌的超純水8iU， 待測樣品2iU，共20 yl ;其中待測樣品替換為無菌水作為陰性對(duì)照。 (2) 將所配制好的PCR管置于Bior LineGene9600實(shí)時(shí)熒光PCR儀上，設(shè)置反應(yīng)條件 為：第一步，37°C C反應(yīng)5min ;第二步，94°C C反應(yīng)5min ;第三步，94°C°C反應(yīng)15s ;第四步， 50°C反應(yīng)40s ;第三步和第四步循環(huán)42次，在第四步讀取熒光； (3) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：將已知拷貝數(shù)的分別含單一型別的即￥-16，18,31，33,52,58目 的擴(kuò)增片段的重組質(zhì)粒，使用時(shí)連續(xù)10倍比稀釋到濃度在1. 〇 X 10°拷貝/ iil-1. 0 X 109拷 貝/ Ul之間，作為多重?zé)晒舛縋CR的標(biāo)準(zhǔn)品；取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品2 yl作為四重?zé)晒舛?量PCR的模板，同時(shí)用滅菌超純水作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)品，對(duì)各稀釋濃度標(biāo)準(zhǔn)品模板按照確立的 反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件同時(shí)進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增檢測，所有標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)本至少檢測兩次，擴(kuò) 增完成后用儀器自帶的軟件自動(dòng)分析結(jié)果，從而確定該方法的最低檢測量，評(píng)估HPV熒光 定量PCR的檢測靈敏度，及制作標(biāo)準(zhǔn)品校正曲線； ⑷臨床標(biāo)本檢測：用臨床HPV標(biāo)本中提取的DNA作為模板，用上述⑴和⑵的方法 和條件進(jìn)行多重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK104450954SQ201310446102
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2013年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月25日
【發(fā)明者】沈國成 申請(qǐng)人:蘇州納柏基因生化有限公司