用于篩選在pcr測定中使用的試劑的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于篩選在聚合酶鏈式反應(PCR)測定的執(zhí)行中使用的試劑的方法。本發(fā)明用于基因分型、病原體檢測和體外診斷。
【專利說明】
用于篩選在PCR測定中使用的試劑的方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及用于篩選在聚合酶鏈式反應(PCR)測定的執(zhí)行中使用的試劑的方法。 本發(fā)明用于基因分型、病原體檢測和體外診斷。
【背景技術】
[0002] 核酸擴增技術的開發(fā)已經(jīng)徹底改變了遺傳分析和工程科學。例如，聚合酶鏈式反 應(PCR)通常用于使用選擇的引物核酸擴增特定靶核酸，例如，以促進靶核酸的檢測作為診 斷、法醫(yī)或其它應用的組成部分。引物通常成對地起作用，其被設計成向彼此延伸以覆蓋選 擇的靶區(qū)域。一個典型PCR循環(huán)包括高溫(例如，85 °C或更高)變性步驟(其中雙鏈核酸的鏈 彼此分開）、低溫（例如，45-65°C)對合步驟(其中引物與分離的單鏈雜交)和中間溫度（例 如，約72°C)延伸步驟(其中核酸聚合酶延伸引物）。還利用雙溫度熱循環(huán)操作。這些通常包 括高溫變性步驟和低溫對合-延伸步驟。
[0003] 已經(jīng)開發(fā)了多種用于檢測擴增產(chǎn)物的策略，最廣泛地使用的方法之一是5'核酸 酶或TaqMan ?測定。在PCR過程中，5 '核酸酶測定通常利用某些DNA聚合酶的5 '至3 '核酸酶 活性來切割5'核酸酶寡核苷酸探針。該測定允許擴增靶標和釋放標記進行檢測，通常無需 求助于擴增產(chǎn)物的多個操作步驟。5'核酸酶探針通常包括標記部分，諸如熒光報道染料和 淬滅劑染料。當探針是完整的時，報道染料向淬滅劑染料的靠近通常導致報道分子熒光的 抑制。在5'核酸酶反應過程中，探針的切割使報道染料和淬滅劑染料彼此分開，從而導致 來自報道分子的熒光的可檢測的增加。通常通過實時監(jiān)測這種熒光增加來間接地檢測PCR 產(chǎn)物或擴增子的積累。
[0004] 需要許多試劑來執(zhí)行PCR測定，并且試劑諸如DNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸 (dNTP)、寡核苷酸引物、探針和在維持pH的緩沖液(例如Tri s-HCl)中的鹽(鎂、鉀、氯化物） 經(jīng)常預混合在被稱作主混合物的溶液中。還已知某些物質(zhì)諸如明膠、牛血清白蛋白（BSA)、 硫酸銨和非離子型去污劑充當穩(wěn)定劑并改善PCR測定的性能。甘油（15-20%)向PCR混合物中 的添加也可以如下增強PCR反應性能:通過增加 DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性，以及通過降低鏈分 離所需的溫度（參見Cheng, S.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91，5695，1994)〇
[0005] 發(fā)明概述 盡管甘油被用作PCR測定的穩(wěn)定劑且經(jīng)常被包含在主混合物溶液中，但是已經(jīng)觀察到， "壞"甘油樣品在主混合物溶液中的存在可以導致失敗的PCR測定，不會觀察到模板核酸的 擴增。因此，非常有用的是，具有可以檢測"壞"甘油樣品并避免它在主混合物溶液中的使用 的方法。本發(fā)明提供了一種用于篩選甘油樣品的方法，所述甘油樣品適合用在試劑溶液內(nèi) 以執(zhí)行聚合酶鏈式反應(PCR)測定，所述方法包括，提供所述甘油樣品；提供所述試劑溶液； 將所述甘油樣品和所述試劑溶液混合以產(chǎn)生測試混合物;給所述測試混合物提供用熒光染 料標記的寡核苷酸探針;將所述測試混合物在約65°C溫育約16小時；將所述測試混合物加 入液相層析系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)連接至熒光檢測器;通過所述液相層析系統(tǒng)將所述寡核苷 酸探針與所述寡核苷酸探針的降解產(chǎn)物分離;測量來自所述液相層析系統(tǒng)的分離的級分的 熒光信號，其中來自與所述寡核苷酸探針的降解產(chǎn)物對應的級分的熒光信號的檢測指示所 述甘油樣品不適合用于執(zhí)行PCR測定，并且其中來自與所述寡核苷酸探針的降解產(chǎn)物對應 的級分的熒光信號的不存在指示所述甘油樣品適合用于執(zhí)行PCR測定。
[0006] 具體地，使用超效液相層析(UPLC)系統(tǒng)或柱執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的方法應用的分離步 驟。
[0007] 在發(fā)明詳述中和在附圖中更詳細地描述了本發(fā)明的實施方案和優(yōu)點。
【附圖說明】
[0008] 圖1A和1B顯示了在實施例1所述的條件下穿過UPLC柱以后，來自13種測試混合物 的FAM-標記的寡核苷酸探針的熒光峰，每種測試混合物含有不同的甘油樣品。
[0009]圖2顯示了使用在"好"甘油樣品中混合的寡核苷酸探針1(條A-F)、在"壞"甘油樣 品中混合的寡核苷酸探針1(條G)和在"壞"甘油樣品中的寡核苷酸探針2和3(條H和I)，在 0.3-0.8 min區(qū)域觀察到的熒光的條形圖。
[0010] 發(fā)明詳述 定義 除非另外定義，在本文中使用的所有技術和科學術語具有本發(fā)明所屬領域的技術人員 通常理解的含義。下述參考文獻給技術人員提供了在本發(fā)明中使用的許多術語的一般定 義：Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (1994年第2 版）；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker編，1988); The Glossary of Genetics,第5版，R. Rieger等人（編），Springer Verlag (1991);以及 Hale和Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本文中使用的下 述術語具有歸于它們的含義，除非另有說明。
[0011] 術語"核酸"表示核苷酸(例如，核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、核苷酸類似物等）的 聚合物，并且包含脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、DNA-RNA雜交物、寡核苷酸、多核苷 酸、適體、肽核酸(PNA)、PNA-DNA綴合物、PNA-RNA綴合物等，其包含以直鏈或支鏈方式共價 連接在一起的核苷酸。核酸通常是單鏈的或雙鏈的，并且一般含有磷酸二酯鍵，盡管在某些 情況下，包括可以具有替代主鏈的核酸類似物，包括、例如，磷酰胺(Beaucage等人（1993)， Tetrahedron 49(10): 1925);硫代磷酸酯（Mag等人（1991)，Nucleic Acids Res. 19: 1437;和美國專利號 5,644,048)、二硫代磷酸酯（8411等人（1989)，入4111.〇16111.3〇(3. 111:2321)、0_甲基亞磷酰胺鍵（參見Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press (1992))和肽核酸主鏈和鍵（參見， 已811〇1111(1992)，夂4111.〇16111.3〇(3.114 :1895))。其它類似物核酸包括具有帶正電荷主 鏈的類似物核酸（Denpcy等人（1995)，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097);非離子 主鏈（美國專利號 5,386,023、5,637,684、5,602,240、5,216，141和4,469,863)和非核糖主 鏈，包括在美國專利號5,235,033和5,034,506中描述的那些。含有一個或多個碳環(huán)糖的核 酸也被包括在核酸的定義內(nèi)（參見Jenkins等人（1995)，Chem. Soc. Rev.第169-176頁）， 并且類似物也描述在，例如，Rawls，C & E News，1997年6月2日，第35頁?？梢酝瓿珊颂?磷酸主鏈的這些修飾，以促進另外部分(諸如標記）的添加或以改變這樣的分子在生理環(huán)境 中的穩(wěn)定性和半衰期。
[0012] 除了通常在核酸中發(fā)現(xiàn)的天然存在的雜環(huán)堿基(例如，腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、 胞嘧啶和尿嘧啶）以外，核苷酸類似物也可以包括非天然存在的雜環(huán)堿基，諸如在例如 36613等人（1999)，他1￥.〇11111.4(^3 82:1640中描述的那些。在核苷酸類似物中使用的 某些堿基充當解鏈溫度(Tm)改性劑。例如，這些中的一些包括7-脫氮嘌呤(例如，7-脫氮鳥 嘌呤、7-脫氮腺嘌呤等）、吡唑并[3，4-d]嘧啶、丙炔基-dN (例如，丙炔基-dU、丙炔基-dC等） 等。參見，例如，美國專利號5，990，303。其它代表性的雜環(huán)堿基包括，例如，次黃嘌呤、肌苷、 黃嘌呤;2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黃嘌呤、肌苷和黃嘌呤的8-氮 雜衍生物;腺嘌呤、鳥嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黃嘌呤、肌 苷和黃嘌呤的7-脫氮-8-氮雜衍生物;6-氮胞苷;5-氟胞苷;5-氯胞苷;5-碘胞苷;5-溴胞苷； 5-甲基胞苷;5-丙炔基胞苷；5-溴乙烯基尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-氯尿嘧啶；5-碘尿嘧啶；5-溴尿嘧啶;5-三氟甲基尿嘧啶;5-甲氧基甲基尿嘧啶;5-乙炔基尿嘧啶;5-丙炔基尿嘧啶等。
[0013] "核苷"表示包含堿基或堿性基團（其包含至少一個同素環(huán)、至少一個雜環(huán)、至少一 個芳基和/或類似基團）的核酸組分，所述堿基或堿性基團與糖部分（核糖糖或脫氧核糖 糖）、糖部分的衍生物、或糖部分的功能等同物(例如碳環(huán))共價地連接。例如，當核苷包括糖 部分時，堿基通常連接至該糖部分的1'-位置。如上所述，堿基可以是天然存在的堿基或非 天然存在的堿基。示例性的核苷包括核糖核苷、脫氧核糖核苷、二脫氧核糖核苷和碳環(huán)核 苷。
[0014] "核苷酸"表示核苷的酯，例如，核苷的磷酸酯，其具有一個、兩個、三個或更多個共 價連接至核苷的糖部分的5'位置的磷酸酯基團。
[0015]術語"多核苷酸"和"寡核苷酸"互換使用。"寡核苷酸"是有時用于描述較短多核苷 酸的術語。寡核苷酸可以包含與指定的核苷酸序列的區(qū)域?qū)闹辽?個核苷酸，例如至少 約10-12個核苷酸，或至少約15-30個核苷酸。
[0016] 術語"擴增反應"表示用于增加靶核酸序列的拷貝的任何體外方式。
[0017] "擴增"表示使溶液處于足以允許擴增的條件的步驟。擴增反應的組分可以包括、 但不限于例如引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸、dNTP等。術語"擴增"通常表示靶核酸的 "指數(shù)"增加。但是，本文中使用的"擴增"還可以表示選定的靶核酸序列的數(shù)目的線性增加， 但是不同于一次性的、單引物延伸步驟。
[0018] "聚合酶鏈式反應"或"PCR"表示用于以等比數(shù)列擴增靶雙鏈DNA的特定區(qū)段或子 序列的方法。PCR是本領域技術人員眾所周知的；參見，例如，美國專利號4，683,195和4， 683,202;和 PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis 等人編， 1990〇
[0019] 本文中使用的術語"寡核苷酸探針"表示這樣的多核苷酸序列：其能夠與目標靶核 酸雜交或?qū)喜⑶以试S所述靶核酸的特異性檢測。
[0020] 術語"主混合物"或"主混合物溶液"與術語"試劑溶液"互換使用，且表示PCR發(fā)生 所需的所有或大部分成分或因子的混合物，且在某些情況下，除了樣品和擴增子特異性的 模板和引物以外的全部。商購可得的主混合物經(jīng)常是濃縮的溶液。主混合物可以含有多種 樣品共有的所有試劑，但是它也可以僅為一種樣品構建。使用主混合物有助于減小由吸量 的體積之間的差異引起的樣品之間的吸量錯誤和變動。
[0021 ]術語"約"表示下面的時間或溫度的近似范圍。因此，"約16小時"可以表示時間范 圍，例如12小時至20小時之間，且"約65°C"可以表示溫度范圍，例如60°C至70°C之間。
[0022] "核酸聚合酶"表示催化核苷酸向核酸內(nèi)的摻入的酶。示例性的核酸聚合酶包括 DNA聚合酶、RNA聚合酶、末端轉(zhuǎn)移酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、端粒末端轉(zhuǎn)移酶等。
[0023] "熱穩(wěn)定的DNA聚合酶"表示這樣的DNA聚合酶：當遭受高溫選定的時間段時，其為 穩(wěn)定的（即抵抗分解或變性)且保持足夠的催化活性。例如，當遭受高溫使雙鏈核酸變性所 需的時間時，熱穩(wěn)定的DNA聚合酶保留實現(xiàn)后續(xù)引物延伸反應的足夠活性。核酸變性所需的 加熱條件是本領域眾所周知的，并且在美國專利號4,683，202和4,683,195中舉例說明。本 文中使用的熱穩(wěn)定的聚合酶通常適用于溫度循環(huán)反應諸如聚合酶鏈式反應（"PCR"）中。熱 穩(wěn)定的核酸聚合酶的例子包括水生棲熱菌Taq DNA聚合酶、棲熱菌屬(Thermus)種Z05聚合 酶、黃棲熱菌（Thermus flavus)聚合酶、海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)聚合酶諸如 TMA-25和TMA-30聚合酶、Tth DNA聚合酶等。
[0024] "經(jīng)修飾的"聚合酶表示其中至少一個單體不同于參照序列的聚合酶，所述參照序 列是例如所述聚合酶的天然或野生型形式或所述聚合酶的另一種修飾形式。示例性修飾包 括單體插入、缺失和置換。經(jīng)修飾的聚合酶還包括嵌合聚合酶，其具有衍生自兩個或更多個 親本的可鑒定的組分序列（例如，結構或功能結構域等）。在經(jīng)修飾的聚合酶的定義內(nèi)還包 括包含參照序列的化學修飾的那些。經(jīng)修飾的聚合酶的例子包括G46E E678G CS5 DNA聚合 酶、G46E L329A E678G CS5 DNA聚合酶、G46E L329A D640G S671F CS5 DNA聚合酶、G46E L329A D640G S671F E678G CS5 DNA聚合酶、G46E E678G CS6 DNA聚合酶、Z05 DNA聚合酶、 AZ05聚合酶、AZ05-Gold聚合酶、AZ05R聚合酶、E615G Taq DNA聚合酶、E678G TMA-25聚 合酶、E678G TMA-30聚合酶等。
[0025] 術語"5 '至3 '核酸酶活性"或"5 ' -3 '核酸酶活性"表示通常與核酸鏈合成相關的核 酸聚合酶的活性，由此核苷酸從核酸鏈的5 '末端除去。例如，大腸桿菌DNA聚合酶I具有該活 性，而克列諾片段沒有。一些具有5'至3'核酸酶活性的酶是5'至3'外切核酸酶。這樣的5'至 3'外切核酸酶的例子包括:得自枯草芽孢桿菌(B. subtilis)的外切核酸酶，得自脾的磷 酸二酯酶A外切核酸酶，得自酵母的外切核酸酶II，得自酵母的外切核酸酶V，和得自粗糙 鏈抱霉(Neurospora crassa)的外切核酸酶。
[0026] 利用5 '至3 '核酸酶活性的靶核酸的檢測可以通過如以下文獻所述的"TaqMan ? " 或"5~核酸酶測定"來執(zhí)行:美國專利號5，210，015、5，487，972和5，804，375;和Hoi land等 人，1988，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280。在TaqMan? 測定中，在擴增區(qū) 內(nèi)雜交的標記的檢測探針在擴增反應期間存在。探針如此進行修飾，以阻止探針充當DNA合 成的引物。所述擴增使用具有5'至3'外切核酸酶活性的DNA聚合酶執(zhí)行。在擴增的每個合成 步驟期間，與來自待延伸引物下游的靶核酸雜交的任何探針通過DNA聚合酶的5'至外切 核酸酶活性降解。因而，新靶鏈的合成也導致探針的降解，并且降解產(chǎn)物的積累會提供靶序 列合成的量度。
[0027] 適合用于檢測降解產(chǎn)物的任何方法均可用在5'核酸酶測定中。通常，檢測探針用 兩種熒光染料進行標記，其中之一能夠淬滅另一種染料的熒光。所述染料附著至探針，通常 報道或檢測染料附著至5'末端，且淬滅染料附著至內(nèi)部位點，使得當探針處于非雜交狀態(tài) 時，淬滅發(fā)生，并且使得通過DNA聚合酶的5 '至3 '外切核酸酶活性實現(xiàn)的探針切割發(fā)生在兩 種染料之間。擴增導致染料之間的探針切割，伴隨淬滅的消除和來自最初淬滅的染料的可 觀察的熒光的增加。通過測量反應熒光的增加，監(jiān)測降解產(chǎn)物的積累。美國專利號5,491， 063和5,571，673描述了用于檢測與擴增伴隨發(fā)生的探針降解的替代方法。
[0028] 熒光染料可以包括帶負電荷的的染料，諸如熒光素家族的染料，或電荷中性的染 料，諸如羅丹明家族的染料，或帶正電荷的染料，諸如花青家族的染料。熒光素家族的染料 包括，例如，6-羧基-熒光素 (FAM)、2'，4, 4'，5'，7, 7'-六氯熒光素 (HEX)、TET、J0E、NAN 和Z0E。羅丹明家族的染料包括，例如，德克薩斯紅、R0X、R110、R6G和TAMRA或羅丹明衍生物 JA270 (參見，美國專利號6，184,379)<^411、冊乂、1￡1'、1(^、祖12(^、1?(?、1?110、1?66和1厶11^ 可商購得自，例如，Perkin-Elmer, Inc. (Wellesley, MA, USA)，且德克薩斯紅可商購得 自，例如，Molecular Probes, Inc. (Eugene, 0R)?；ㄇ嗉易宓娜玖习ǎ?，Cy2、Cy3、 Cy5、Cy5.5和Cy7,且可商購得自，例如，Amersham Biosciences Corp. (Piscataway, NJ， USA)〇
[0029] 用于檢測靶核酸的5'核酸酶測定可以采用具有5'至3'外切核酸酶活性的任何聚 合酶。因此，在某些實施方案中，具有5'核酸酶活性的聚合酶是熱穩(wěn)定和熱活性的核酸聚合 酶。這樣的熱穩(wěn)定的聚合酶包括、但不限于來自真細菌屬棲熱菌屬、熱袍菌屬(Thermatoga) 和棲熱腔菌屬(Thermosipho)的多個種的天然和重組形式的聚合酶以及其嵌合形式。例如， 可以用于本發(fā)明的方法中的棲熱菌屬種聚合酶包括水生棲熱菌(Taq)DNA聚合酶、嗜熱棲熱 菌(Thermus thermophilus) (Tth)DNA聚合酶、棲熱菌屬種Z05(Z05)DNA聚合酶、棲熱菌屬種 spsl7(spsl7)和棲熱菌屬種 Z05(例如在美國專利號 5,405,774、5,352,600、5,079,352、4， 889，818、5,466,591、5,618,711、5,674,738和 5,795,762中所述）?？梢杂糜诒景l(fā)明的方法 中的熱袍菌屬聚合酶包括例如海棲熱袍菌DNA聚合酶和新阿波羅棲熱袍菌（Thermatoga neapoli tana) DNA聚合酶，而可以使用的棲熱腔菌屬聚合酶的一個例子是非洲棲熱腔菌 (Thermosipho africanus)DNA聚合酶。海棲熱袍菌和非洲棲熱腔菌DNA聚合酶的序列公開 于國際專利公開號W0 92/06200中。新阿波羅棲熱袍菌的序列可以在國際專利公開號W0 97/09451中找到。
[0030] 在5'核酸酶測定中，擴增檢測通常與擴增同時發(fā)生（即，"實時"）。在某些實施方案 中，擴增檢測是定量的，并且擴增檢測是實時的。在某些實施方案中，擴增檢測是定性的（例 如，靶核酸的存在或不存在的終點檢測）。在某些實施方案中，擴增檢測在擴增之后。在某些 實施方案中，擴增檢測是定性的，并且擴增檢測在擴增之后。
[0031] 提供以下實施例和附圖以幫助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真實范圍在所附權利要求書 中闡述。
[0032] 液相層析 在液相層析中，樣品穿過含有適當顆粒（固定相）的柱或筒裝置。這些顆粒被稱作層析 填充材料。溶劑(流動相)流動穿過所述裝置。在固相萃取(SPE)中，將樣品加載到筒上，并且 溶劑流攜帶樣品穿過裝置。樣品中的不同化合物然后通過以不同的各個速度行進穿過裝置 而分離。
[0033]當利用筒形式時，存在幾種實現(xiàn)流動的方式。可以為沒有設計成耐受壓力的柱使 用重力或真空。通常，顆粒在該情況下具有較大的直徑(> 50微米），使得存在更少的流動阻 力。開放玻璃柱是這類的一個例子。另外，可以給小塑料柱(通常呈注射器筒的形狀)裝入填 充材料顆粒并用于執(zhí)行樣品制備。這被稱作固相萃取(SPE)。在這里，使用層析裝置(被稱作 筒)(經(jīng)常與真空輔助的流動一起)來提純非常復雜的樣品，然后將它進一步分析。
[0034] 需要較小的粒度(〈10微米)來改善分離能力。但是，較小的顆粒具有較大的流動阻 力，所以需要較高的壓力來建立期望的溶劑流速。被設計成耐受高壓的栗和柱是必要的。當 使用中壓至高壓使溶劑流動穿過層析柱時，該技術被稱作高效液相層析(HPLC)。
[0035] HPLC最初指示以下事實:使用高壓來產(chǎn)生填充柱中的液相層析所需的流動。在開 始時，栗僅具有500 psi的壓力能力（35巴）。這被稱作高壓液相層析或HPLC。較新的HPLC儀 器可以形成高達6,000 psi (400巴）的壓力，并包括改進的注射器、檢測器和柱。使用較小 顆粒和甚至較高壓力導致性能的持續(xù)改進。
[0036]高效液相層析現(xiàn)在是分析化學中最有利的工具之一。它具有分離、鑒定和定量存 在于可以溶解在液體中的任何樣品中的化合物的能力。目前，可以容易地鑒定低至萬億分 之幾(ppt)的痕量濃度的化合物。HPLC可以且已經(jīng)應用于幾乎任何樣品，諸如藥物、食品、營 養(yǎng)制品、化妝品、環(huán)境基質(zhì)、法醫(yī)樣品和工業(yè)化學品。
[0037]做出儀器和柱技術的進一步發(fā)展來實現(xiàn)液相層析的分辨率、速度和靈敏度的非常 顯著的增加。需要具有較小顆粒（1.7微米)的柱和具有被設計成在15,000 psi (1，000巴） 遞送流動相的專門能力的儀器來達到新的性能水平。這種用于執(zhí)行超效液相層析的新系統(tǒng) 被稱作UPLC技術。 實施例
[0038]實施例1超效液相層析(UPLC)條件 使用具有Empower 2軟件、具有光電二極管陣列（PDA)檢測器和熒光檢測器的Waters Acquity?UPLC儀器，執(zhí)行UPLC。使用的柱是Acquity OST C18柱，其具有1.7 yM粒度、2.1 x 50 mm內(nèi)徑。嵌入的柱加熱器設定在60°C溫度。流動相由100mM三乙基乙酸銨(TEAA) pH 7.0 (對于緩沖液A)和100%乙腈(對于緩沖液B)組成。PDA檢測器設定在254 nm的吸光度，20點/ 秒。熒光檢測器設定成以495 nm的激發(fā)波長和510 nm的發(fā)射波長讀出6-羧基-熒光素(FAM) 的信號。對于要測試的每種反應混合物，將10 yl注射進柱中，且用于運行柱的梯度顯示在 表1上。
[0040]實施例2 13種不同的甘油樣品的測試 使用下述條件測試了 13個不同批次的甘油樣品（樣品編號1-13)。將250 yl 80%甘油樣 品與250 yl 100 mM三(羥甲基）甲基甘氨酸pH 8.3緩沖液混合。將混合物劇烈渦旋以徹底 混合。接著，將FAM-標記的寡核苷酸探針(探針編號1)以1 yM的終濃度加入混合物中。將所 述混合物在65°C溫育16小時，并使用在實施例1中描述的條件將10 yl注射進UPLC柱中。圖1 顯示了通過熒光測量的測試的13批甘油樣品的洗脫概況。在1.00 min級分洗脫的熒光峰代 表完整的FAM-標記的探針。在0.30和0.80分鐘標志之間出現(xiàn)的在甘油樣品12和13中看到的 較小熒光信號代表降解的寡核苷酸探針。這些降解產(chǎn)物的存在指示，甘油樣品12和13不適 合用在用于PCR測定的主混合物中。
[0041]實施例3使用不同探針測試"好"和"壞"甘油樣品 使用實施例2所述的實驗所用的FAM-標記的寡核苷酸探針(探針編號1)測試了 7種不同 的甘油樣品，并產(chǎn)生了測試混合物A-G。測試混合物G含有"壞"甘油樣品（實施例2中的樣品 12)。另外，將"壞"甘油樣品（樣品12)與兩種不同的FAM-標記的寡核苷酸探針(探針編號2、 探針編號3)混合以分別產(chǎn)生測試混合物H和I。將所有測試混合物如在實施例2中所述溫育， 如在實施例1中所述通過UPLC分析。將在0.3分鐘和0.8分鐘之間的熒光峰值積分，并將計算 的熒光峰面積轉(zhuǎn)化為圖2所示的條形圖上的條。如預期的，僅在測試混合物G、H和I中測試的 "壞"甘油樣品(樣品12)表現(xiàn)出指示寡核苷酸探針的降解產(chǎn)物的存在的峰值。
【主權項】
1. 一種用于篩選甘油樣品的方法，所述甘油樣品適合用在主混合物溶液內(nèi)以執(zhí)行聚合 酶鏈式反應(PCR)測定，所述方法包括： 提供所述甘油樣品； 提供所述主混合物溶液； 將所述甘油樣品和所述主混合物溶液混合以產(chǎn)生測試混合物； 給所述測試混合物提供用熒光染料標記的寡核苷酸探針； 將所述測試混合物在約65°C溫育約16小時； 將所述測試混合物加入液相層析系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)連接至熒光檢測器； 通過所述液相層析系統(tǒng)將所述寡核苷酸探針與所述寡核苷酸探針的降解產(chǎn)物分離； 測量來自所述液相層析系統(tǒng)的分離的級分的熒光信號， 其中來自與所述寡核苷酸探針的降解產(chǎn)物對應的級分的熒光信號的檢測指示所述甘 油樣品不適合用于執(zhí)行PCR測定，并且 其中來自與所述寡核苷酸探針的降解產(chǎn)物對應的級分的熒光信號的不存在指示所述 甘油樣品適合用于執(zhí)行PCR測定。2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中使用超效液相層析系統(tǒng)執(zhí)行所述分離步驟。
【文檔編號】C12Q1/68GK105849281SQ201480070183
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2014年12月22日
【發(fā)明人】N.喬恩布倫納, C.阿納克勒托
【申請人】豪夫邁·羅氏有限公司