專利名稱：Prohibitin蛋白抗體在制備診斷老年性癡呆的試劑盒中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及Prohibitin蛋白抗體在制備診斷老年性癡呆的試劑盒中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
當(dāng)前，世界各國人口老齡化速度日趨加快，經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)國家人口平均壽命已達(dá)到或接近80歲。我國人口平均壽命70歲，其中60歲以上的老人已達(dá)I. 3億，預(yù)計在本世紀(jì)，衰老以及老化相關(guān)疾病如老年性癡呆等將成為影響人類健康和生活質(zhì)量的重要因素。在西方國家及我國上海等大城市，老年性癡呆己成為繼心臟病、腫瘤和腦卒中之后第四位致死原因。老年性癡呆，又稱為阿爾茨海默氏癡呆(Alzheimer’s disease, AD )，1907年由德國神經(jīng)病理學(xué)家Alois Alzheimer首先報道,屬于系統(tǒng)性神經(jīng)退化疾病，以高級認(rèn)知功能 降低為特點；是普遍、迅速增長、常發(fā)生于老年及中年末期的年齡依賴性的老年性癡呆。目前在老年人口中發(fā)病率為7. 38-18. 2%，其發(fā)病率增長勢頭驚人，全世界現(xiàn)有AD病人1800萬，預(yù)計2025年將達(dá)到3000萬人，國內(nèi)65歲以上患病率為6. 5%。美國用于診斷和護(hù)理AD的開支為500億美元/年，如果推遲一年發(fā)病，將節(jié)省開支100億美元。AD是神經(jīng)變性性疾病，導(dǎo)致認(rèn)知損害(健忘、失語、失用和失認(rèn))，以進(jìn)行性癡呆為臨床特征，起病緩慢，早期為近事記憶減退和性格改變(如出現(xiàn)固執(zhí)、主觀、自私、急躁、淡漠，常有睡眠節(jié)律改變)；中期以理解、判斷、計算等智能活動全面減退為特點；后期則出現(xiàn)嚴(yán)重癡呆、語言障礙、ニ便失禁、生活不能自理等表現(xiàn)。腦電圖出現(xiàn)慢波慢活動，影象學(xué)檢查有腦萎縮。老年期癡呆，首先必須確定癡呆，國內(nèi)外廣為接受DSM-III-R診斷標(biāo)準(zhǔn)。然后再判斷可逆及不可逆的癡呆，一般需要收集發(fā)病年齡、病情進(jìn)展等病史和臨床表現(xiàn)，并做相關(guān)的生化、頭部影像和腦電活動等輔助檢查。一些神經(jīng)心理學(xué)檢查量表，比如HDS-R長谷川簡易癡呆、MMSE簡易精神狀態(tài)、ADL日常生活能力、WAIS智力等量表常用來進(jìn)行患者癡呆嚴(yán)重程度的評定。其次診斷，目前比較權(quán)威的仍是“NINCDS-ADRDA診斷標(biāo)準(zhǔn)”，它于1984年公開發(fā)表，包括“可能的、支持可能的、可疑的、確定的”等不同程度的診斷依據(jù)，對AD的診斷敏感性88%，特異性達(dá)91%，診斷可信限為92%。以其作為參考，制定了我國AD的CMA診斷標(biāo)準(zhǔn)。最后必須做好鑒別診斷，老年期癡呆的原因多種多樣，也包括一些治療可能相反的原因，如憂郁癥、藥物損害、代謝改變、營養(yǎng)缺乏等，必須充分進(jìn)行鑒別診斷。從發(fā)病率來說，AD、VD(血管性癡呆)、MID(多發(fā)梗塞性癡呆)常是最需要進(jìn)行鑒別的。常用Hackinki缺IfIL量表判斷)]畫IIIL管病，再用DSM-IV進(jìn)行AD， VD的鑒別診斷。因此，單ー臨床試驗不能確診AD，必須依賴全面的健康史，物理檢查，神經(jīng)精神狀態(tài)評價，血、尿分析，腦影像學(xué)、腦電流圖、正式精神病學(xué)評估和神經(jīng)心理測試等綜合判斷。臨床也正在不斷地尋找有助于早期診斷的方法，比如建議載脂蛋白E(ApoE)基因型多態(tài)性分析可作為AD的ー個診斷參考指標(biāo)。認(rèn)為ApoE不僅參與脂類代謝，而且與AD發(fā)病有密切的關(guān)系，ApoE能促進(jìn)淀粉樣蛋白(amyloidp-protein, )纖維的形成，與共同形成復(fù)合物存在于老年斑((senile plaque, SP)中，介入腦神經(jīng)細(xì)胞的變性過程。國內(nèi)研究ApoE基因多態(tài)性后認(rèn)為，ApoE e 4等位基因是個體發(fā)生AD的危險因素，內(nèi)含子I內(nèi)增強(qiáng)子元件(IEl) G/G與e 4相關(guān)，能増加AD發(fā)病風(fēng)險。對早老素(PS)的基因多態(tài)性的研究，證明PS-I 1/1基因型和I等位基因可増加散發(fā)性與晚發(fā)性AD發(fā)病風(fēng)險。其他用膽堿能拮抗劑(如托毗卡胺)進(jìn)行擴(kuò)瞳實驗、進(jìn)行血漿和/或腦脊液的激素、神經(jīng)膚、免疫復(fù)合物、微量元素及生化等檢查輔助診斷，但有證據(jù)表明，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)和AD整個進(jìn)展過程，甚至涉及全部的生化異常。因此，迄今為止，AD只有通過腦活檢或尸體解剖才能確診。相對滯后的確診和治療，嚴(yán)重影響了 AD的預(yù)后。所以，AD分子水平作用機(jī)制的確立是研究簡便、快捷、確切的AD早期診斷方法的基礎(chǔ)。AD是年齡相關(guān)的多因素疾病，起始病因可引起編碼APP等其他與家族性(familial AD，F(xiàn)AD)或散發(fā)性((sporadic AD, SAD) AD發(fā)病機(jī)制有關(guān)蛋白的基因突變。FAD有遺傳性或表型等不同表現(xiàn)，即不同的基因突變可引起AD表型，同一基因的不同突變可引 起不同表型的疾病，包括Alzheimer型癡呆，和伴有腦出血及卒中的腦淀粉樣血管病。老化、性別、腦創(chuàng)傷及ApoE基因的變異都是增加AD形成的危險因子，這些特點都使得AD的病因和病理機(jī)制非常復(fù)雜。許多科學(xué)家就AD的確切病因及發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了不斷的探索和研究，但其致病原因至今尚未闡明。目前認(rèn)為AD是由遺傳學(xué)因素、環(huán)境因素和代謝因素等多種因素相互聯(lián)系、相互影響、共同作用所引起的ー種病理過程，尤其是近年來由于分子生物學(xué)的發(fā)展，促進(jìn)了 AD病因?qū)W研究。AD分子水平研究的目的是盡快全面了解淀粉樣變等AD病理產(chǎn)生的原因，在臨床 癥狀出現(xiàn)前正確預(yù)測發(fā)病危險，幫助尋求有效的干預(yù)防治措施，為進(jìn)ー步治療提供理論基礎(chǔ)，同時可延緩衰老，提高老年人生存質(zhì)量，因此AD分子水平作用機(jī)制的研究已成為醫(yī)學(xué)界乃至整個人類社會廣泛關(guān)注的重大課題。是老年斑的核心成分，自1987年被首次分離成功后，它的結(jié)構(gòu)及功能一直是科學(xué)工作者研究的焦點，從離體實驗到體內(nèi)實驗，從細(xì)胞水平到分子水平的研究都顯示A 3是AD最主要的致病因子，是AD形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素，由此而形成了淀粉樣蛋白級聯(lián)假說，這是目前解釋老年癡呆病因的主流學(xué)說。該學(xué)說認(rèn)為腦內(nèi)AP聚集是AD患者的原發(fā)性改變，其他病理過程均由A3產(chǎn)生和清除的不平衡所致，由此形成了 3淀粉樣蛋白級聯(lián)假說的理論依據(jù)。具體內(nèi)容是早發(fā)型AD患者由于APP，PSl，PS2基因突變使A3生成増加，晚發(fā)型患者由清除機(jī)制障礙致AP隨年齡逐漸上升，兩者共同作用的結(jié)果使AP積聚、沉積。AP可激活小膠質(zhì)和星形膠質(zhì)細(xì)胞，伴隨著炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致突觸進(jìn)行性損傷，改變了神經(jīng)元內(nèi)的離子平衡狀態(tài)，產(chǎn)生氧化損傷，改變了激酶/磷酸酶活性，引起神經(jīng)元死亡，逐漸產(chǎn)生癡呆。這ー假說主要證據(jù)包括I.同時表達(dá)突變的人淀粉樣蛋白前體(amyloid precursor protein, APP)和tau蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠與單一 tau蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠相比，前者NFTs更多，而AP斑塊的結(jié)構(gòu)和數(shù)量基本沒有差異,提示AD患者A3改變發(fā)生在tau改變之前,進(jìn)而經(jīng)實驗證實了 AP與tau蛋白因與果的關(guān)系；2.編碼tau蛋白的基因突變，在腦內(nèi)可引起嚴(yán)重的神經(jīng)元纖維纏結(jié)，但沒有AP沉積，提示tau蛋白改變不能誘導(dǎo)出AD特征性的類淀粉樣蛋白斑塊，因此，神經(jīng)元纖維纏結(jié)很可能在AP形成斑塊之后發(fā)生；3. APP轉(zhuǎn)基因小鼠和ApoE缺陷小鼠雜交的后代，腦內(nèi)AP沉積明顯減少，提示ApoE基因突變的致病作用很可能涉及AP代謝；4. AP分解代謝和清除方面的功能障礙對晚發(fā)型AD起作用。導(dǎo)致AD主要有以下的機(jī)制
(I)基因突變基因突變因素主要與家族型AD密切相關(guān)，早發(fā)型AD患者由于APP，PSI，PS2基因突變使AP生成増加，晚發(fā)型患者則由ApoE基因突變所致。①APP基因
的前體蛋白基因，位于人21號染色體，APP發(fā)生基因突變導(dǎo)致APP異常表達(dá)和AP聚集沉淀。某些基因調(diào)控的異常也會刺激APP基因過度表達(dá)，引起AP沉淀。②Presenilin基因(PS)其中PSl位于14號染色體，PS2位于I號染色體，大多數(shù)家族型AD患者均發(fā)現(xiàn)PSI，PS2突變，Presenilin蛋白可能參與APP蛋白的合成后加工，最終導(dǎo)致AP異常產(chǎn)生、沉淀形成SPs或神經(jīng)退行病變。也有研究者推測Presenilin參與介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。③ApoE基因ApoE在脂質(zhì)運(yùn)輸過程導(dǎo)致膽固醇運(yùn)輸功能障礙，最后致使突觸丟失。 (2)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡涉及到復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，其中Bcl-2家族起了極其重要的作用，其家族成員Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而Bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，Bax/Bcl-2組成了ー個平衡體系，AP能下調(diào)Bcl-2表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，另外AP的沉淀可在沉淀激活P53，促進(jìn)其表達(dá)并增加誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。(3)觸發(fā)氧化應(yīng)激AD與氧化應(yīng)激的關(guān)系已成為探討AD發(fā)病機(jī)制的新研究方向，外源性給予A3損傷神經(jīng)元有氧化應(yīng)激介導(dǎo)的證據(jù)，提示A3本身可觸發(fā)機(jī)體氧化損傷。
神經(jīng)毒性機(jī)制可能是由于纖維狀A(yù)P的本身具有自由基性質(zhì)，促使細(xì)胞外自由基鏈反應(yīng)，引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化物生成增多，破壞細(xì)胞膜功能，使細(xì)胞膜通透性増加，細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，激活鈣依賴性蛋白酶、脂酶、激酶，使細(xì)胞內(nèi)自由基增多，從而損傷細(xì)胞器和細(xì)胞骨架，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡。(4)免疫炎癥作用AD發(fā)生通常是ー個緩慢的炎癥病理改變過程，SP中AP沉積激活小膠質(zhì)細(xì)胞引起炎癥反應(yīng)是AD的核心病理機(jī)制。炎癥初期小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)吞噬受體清除AP，隨著AP增多，AP封閉了吞噬受體，使小膠質(zhì)細(xì)胞失去吞噬作用，同時，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活釋放炎性細(xì)胞因子如IL-1、IL_6、腫瘤壞死因子-a (TNF- a )等，這些炎性因子反過來激活小膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞產(chǎn)生APP及Aに形成惡性正反饋環(huán)路，導(dǎo)致APP及A 3增加。(5)細(xì)胞骨架改變微管是神經(jīng)細(xì)胞中參與胞體與軸突營養(yǎng)輸送的通道，是細(xì)胞骨架的重要成分，它由微管蛋白和微管相關(guān)蛋白組成，tau蛋白是MAP的主要成分。在AD腦內(nèi)，異常過度磷酸化的tau蛋白含量顯著升高并聚集成雙螺旋絲形式，喪失了促進(jìn)微管組裝的生物活性導(dǎo)致細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)異常和神經(jīng)細(xì)胞的死亡。由于AD研究的樣品的來源受到限制，而其病因尚未完全闡明，因此建立良好的AD研究動物和細(xì)胞模型尤為重要。AD動物模型大致有損傷模型、自然衰老模型和轉(zhuǎn)基因動物模型三大類。每ー種模型在一定程度上、某些方面模擬了 AD癥狀和病理改變，但均有各自的適用范圍和局限性，對于研究AD分子機(jī)制方面不如細(xì)胞模型。Yankner等在1990年首先發(fā)現(xiàn)并證實合成的AP對培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元有毒性作用，體外培養(yǎng)的細(xì)胞模型以其簡便、實用的優(yōu)點逐漸被廣泛用來研究AP的神經(jīng)毒性機(jī)制。實驗常用的細(xì)胞有原代培養(yǎng)的海馬、大腦皮層等神經(jīng)元。其中WAP作用原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元模型最為常見。該模型有以下優(yōu)點海馬區(qū)是AD中損傷最嚴(yán)重的部位，同時與學(xué)習(xí)、記憶密切相關(guān)，而且原代培養(yǎng)更符合實際的情況，因此選用原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)細(xì)胞作為研究AD的細(xì)胞模型較為理想。但是由于原代培養(yǎng)大多采取大鼠等實驗動物來研究，而實驗動物與人之間細(xì)胞生理機(jī)能、代謝途徑、基因組成、蛋白質(zhì)構(gòu)相上存在著一定的差異。就AD病而言大鼠、小鼠的A3氨基酸序列與人的相比只有3個氨基酸不同，但卻能使保持較穩(wěn)定的可溶性狀態(tài)，而不發(fā)生聚集、沉淀產(chǎn)生癡呆。另外原代細(xì)胞培養(yǎng)操作難度大，周期長、培養(yǎng)系統(tǒng)不夠穩(wěn)定；還有原代培養(yǎng)屬于混和培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中膠質(zhì)細(xì)胞也活躍增生，對實驗的標(biāo)準(zhǔn)化不利，結(jié)果缺乏說服力。為了克服原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元模型的不足，研究中經(jīng)常使用AP損傷人神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞系構(gòu)建AD模型，常用的細(xì)胞系有星型膠質(zhì)細(xì)胞瘤源性細(xì)胞系B12/50，大鼠嗜福細(xì)胞瘤細(xì)胞系PC12，人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y (又名成神經(jīng)瘤細(xì)胞系)，這些細(xì)胞系具有神經(jīng)元的形態(tài)特點，能在體外不斷傳代，較原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元容易培養(yǎng)。本發(fā)明選擇SH-SYSY細(xì)胞建模，用A P 25_35作用于SH-SY5Y細(xì)胞構(gòu)建A ^ 25_35損傷神經(jīng)元的體外培養(yǎng)模型。AD的發(fā)生與腦內(nèi)多種調(diào)控基因的失調(diào)密切相關(guān)，但它們與疾病的因果關(guān)系還有待 進(jìn)ー步證實，因此，探明影響AD發(fā)生發(fā)展的基因的種類、結(jié)構(gòu)、功能及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，對于掲示AD的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。傳統(tǒng)的實驗方法多是針對某一或幾個AD相關(guān)的基因進(jìn)行相對孤立地研究，而AD的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，是遺傳背景和外在因素(如環(huán)境條件)相互作用的結(jié)果，必然涉及多個基因和蛋白的表達(dá)調(diào)控，必須整體地、全面地了解發(fā)病的機(jī)制。蛋白質(zhì)組學(xué)可以一次檢測大量蛋白甚至細(xì)胞內(nèi)幾乎所有蛋白的表達(dá)情況，獲得大量的數(shù)據(jù)并進(jìn)行平行分析，同時進(jìn)行多祥本比較，由于排除了一系列復(fù)雜因素導(dǎo)致的各項比較實驗的內(nèi)在差異，使一次性多祥本比較性分析的精確性大大提高，具有高通量、自動化的特點，適合用于老年癡呆等神經(jīng)退行性病變及各種腫瘤發(fā)生機(jī)制的研究。直到20世紀(jì)90年代中期，生物化學(xué)家、分子生物學(xué)家和細(xì)胞生物學(xué)家還在研究單獨(dú)的基因和蛋白質(zhì)或與生物化學(xué)途徑相關(guān)的少量組分。那時可用的技術(shù)有Northern印跡法(用于基因表達(dá)分析)和western印跡法(用于蛋白質(zhì)分析)，利用這些技術(shù)研究和分析多基因或多蛋內(nèi)質(zhì)是非常因難的。蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)使大規(guī)模、高通量的蛋白質(zhì)研究成為可能。以下4種重要工具的發(fā)展和結(jié)合使用給研究人員提供了靈敏性和專ー性較高的識別和鑒定蛋白質(zhì)的方法。第一種工具是數(shù)據(jù)庫。蛋白質(zhì)、EST和基因組序列數(shù)據(jù)庫共同提供了生物表達(dá)全部蛋白質(zhì)的完整數(shù)據(jù)庫目錄。例如，根據(jù)對果蠅的所有編碼序列的分析，有110個果蠅基因編碼具有EGF類結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，87個基因編碼具有酪氨酸激酶催化結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。在進(jìn)行果蠅蛋白質(zhì)組學(xué)研究時，檢索大量已知的可能蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。當(dāng)用限定的序列信息，甚至原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索時，可以根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫的匹配情況鑒定蛋白質(zhì)組分。第二種工具是質(zhì)譜(MS)。質(zhì)譜儀的使用在過去十年中有了極大的革新，在發(fā)展為分析生物分子，特別是分析蛋白質(zhì)和肪的高靈敏度和肽可靠性上達(dá)到頂點。MS儀器的使用可提供三類分析，這三類分析在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中都非常有用。首先，MS可以進(jìn)行IOOkDa或更大完整蛋白質(zhì)的精確質(zhì)量測定。估計蛋白質(zhì)質(zhì)量的最好方法是MS分析，而不是測定蛋白質(zhì)在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的遷移。高精度蛋白質(zhì)質(zhì)量測定的應(yīng)用有限，因為它們往往不夠靈敏。凈質(zhì)量對精確鑒定蛋ロ質(zhì)往往是不充分的。其次，MS也能對蛋白質(zhì)水解消化產(chǎn)生的膚進(jìn)行精確的質(zhì)量測定。相對于完整蛋白質(zhì)質(zhì)量測定，肽質(zhì)量測定可以有高靈敏度和高質(zhì)量準(zhǔn)確度?？梢灾苯佑秒馁|(zhì)量測定數(shù)據(jù)在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，這樣常?？梢源_切鑒定靶蛋白質(zhì)。最后，MS可以對蛋白質(zhì)水解消化得到的膚序列進(jìn)行分析。日前認(rèn)為MS是膚序列分析中的最新技木。MS序列數(shù)據(jù)為蛋白質(zhì)鑒定提供了最有力和最精確的方法。蛋白質(zhì)組學(xué)的第三個必要工具是對數(shù)據(jù)庫中特定蛋白質(zhì)序列與MS數(shù)據(jù)進(jìn)行比對的各種軟件。前面提到從MS數(shù)據(jù)可以測定序列，但是這種從頭開始分析成百上千的譜圖時是ー項費(fèi)時費(fèi)力的任務(wù)。蛋白質(zhì)組學(xué)軟件將未分析的MS數(shù)據(jù)，在特定算法的幫助下與蛋白質(zhì)、EST和基因組序列數(shù)據(jù)庫的序列相比對，自動檢測大量用于蛋白質(zhì)序列匹配的MS數(shù)據(jù)。然后研究人員檢查自動槍測的結(jié)果，估計數(shù)據(jù)的質(zhì)量，所用的時間比手工解釋每ー張譜圖要少得多。蛋白質(zhì)組學(xué)的第四種必需工具是蛋白質(zhì)的分析分離技木。在蛋白質(zhì)組學(xué)中蛋白 質(zhì)分離有兩個目的。第一，通過將蛋白質(zhì)混合物分離成單一蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)小組以簡化復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物。第二，蛋白質(zhì)的分離分析可以比較兩個樣品蛋白質(zhì)的不同表現(xiàn)，研究者可以標(biāo)記用于分析的特定蛋白質(zhì)。2D-SDS-PAGE是員廣泛用于蛋白質(zhì)組學(xué)的技木。2D凝膠電泳也許是在復(fù)雜樣品中分離蛋白質(zhì)的最好單項技木。其他的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，包括1D-SDS-PAGE、高效液相層析(HPLC)、毛細(xì)管電泳(CE)、等電聚焦(IEF)和親和層析，也都是分析蛋白質(zhì)組學(xué)的有用工具。最有力的技術(shù)是將不向的蛋白質(zhì)和膚分離技術(shù)結(jié)合為多維技術(shù)。例如，離子交換液相層析(LC)與反相(RP)-HPLC的串聯(lián)是分離復(fù)雜肽混合物的有カエ具。PHB蛋白包括phbI和phb2，1989年MeeIung等首先從老鼠肝臟內(nèi)克隆出哺乳動物的Phbl基因。Phbl被認(rèn)為是ー種細(xì)胞增殖抑制因子，因此命名為Prohibitin。PHB已被證實存在于果蠅、酵母和植物中。同Phbl —祥，phb2在人和嚙齒類動物間以及低等生物中都高度保守。近來發(fā)現(xiàn)PHB既存在于線粒體內(nèi)膜上，發(fā)揮分子伴侶作用，也存在于細(xì)胞核內(nèi)，發(fā)揮著負(fù)性轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。Phbl蛋白發(fā)現(xiàn)存在于細(xì)胞核，并且配合轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞周期過程中發(fā)揮重要作用。Phb2同樣影響細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，作為ー種雌激素受體抑制因子研究多年的REA最終被克隆發(fā)現(xiàn)序列同源于phb2。Phbl和phb2已被證實存在于質(zhì)膜，脂滴和脂筏前體中。此外woodloek等發(fā)現(xiàn)細(xì)胞漿里也有少量的PHB表達(dá)，可以與B淋巴細(xì)胞表面的IgM發(fā)生非共價結(jié)合，可能參與B細(xì)胞的早期信號傳遞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明從蛋白質(zhì)組學(xué)出發(fā)，以比較蛋白組學(xué)技術(shù)為研究手段，對細(xì)胞樣品中蛋白質(zhì)進(jìn)行整體水平研究，通過ニ維凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，建立A P 25_35作用的SH-SY5Y細(xì)胞和作為對照組的正常SH-SY5Y細(xì)胞的差異蛋白圖譜；用生物質(zhì)譜技術(shù)對差異蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，建立了蛋白質(zhì)肽指紋圖譜和肽序列標(biāo)簽，結(jié)合生物信息學(xué)軟件查詢蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，找到了ー種在AD中存在的差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，經(jīng)質(zhì)譜鑒定為Prohibitin蛋白。進(jìn)ー步的免疫印跡試驗證實，Prohibitin蛋白的確在AD患者和正常個體血清中存在顯著的差異表達(dá)?；赑rohibitin蛋白與AD的這種相關(guān)性,該蛋白可以作為ー個蛋白質(zhì)分子標(biāo)記，對其表達(dá)量進(jìn)行檢測可以用于檢測AD。本發(fā)明的ー個目的在于提供一種檢測老年性癡呆的試劑盒。本發(fā)明的另ー個目的在于提供ー種Prohibitin蛋白抗體在制備用于檢測老年性癡呆試劑盒中的應(yīng)用。Prohibitin蛋白與AD的相關(guān)性為AD的診斷和/或治療提供了一條全新的途徑。


圖I為AD患者和正常個體血清中Prohibitin蛋白免疫印跡檢測結(jié)果。其中，第I泳道為正常個體血清樣本，2-4泳道分別為3例AD患者的血清樣本。上部為Prohibitin蛋白，下部為作為內(nèi)參的P-Actin蛋白。
具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例進(jìn)ー步對本發(fā)明加以說明。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，按照常規(guī)條件操作或按照制造廠商建議的條件。本發(fā)明從蛋白質(zhì)組學(xué)出發(fā)，以比較蛋白組學(xué)技術(shù)為研究手段，對細(xì)胞樣品中蛋白質(zhì)進(jìn)行整體水平研究，通過ニ維凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，建立A P 25_35作用的SH-SY5Y細(xì)胞和作為對照組的正常SH-SY5Y細(xì)胞的差異蛋白圖譜；用生物質(zhì)譜技術(shù)對差異蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，建立了蛋白質(zhì)肽指紋圖譜和肽序列標(biāo)簽，結(jié)合生物信息學(xué)軟件查詢蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，找到了ー種在AD中存在的差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，經(jīng)質(zhì)譜鑒定為Prohibitin蛋白。進(jìn)ー步的免疫印跡試驗證實，Prohibitin蛋白的確在AD患者和正常個體血清中存在顯著的差異表達(dá)。實施例I、AD細(xì)胞模型樣品的制備
I.細(xì)胞培養(yǎng)
從液氮中取出冷凍SH-SYSY細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，迅速投入37°C水浴中，約Imin溶化，恢復(fù)至室溫的15%胎牛血清培養(yǎng)基稀釋至原體積5倍(8-10ml), IOOOrpm低速離心，IOmin,棄上清，沉淀用15%胎牛血清培養(yǎng)基15ml，37°C，5% CO2培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，當(dāng)細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底面時傳代換液(大約48h)，倒掉舊培養(yǎng)液，用0. 25%胰酶作用細(xì)胞lmin，當(dāng)細(xì)胞形態(tài)變?yōu)閳A形時立即停止消化，然后用培養(yǎng)液直接吹打法傳代(也可以直接吹打)。對生長狀態(tài)良好的細(xì)胞適當(dāng)凍存保種，其方法為收集細(xì)胞IXlO7細(xì)胞于用15%胎牛血清培養(yǎng)基中，另加DMSO至終濃度為20%，采用梯度降溫(減少-15°C左右細(xì)胞內(nèi)形成冰晶對細(xì)胞的損傷)，立即4°C，30min再_20°C，4_8h再_70°C過夜，最后液氮保存。2.藥物處理細(xì)胞制備AD細(xì)胞模型
(1)收集SH-SYSY細(xì)胞，血球板進(jìn)行細(xì)胞記數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)為IXlO7細(xì)胞分別加入兩個培養(yǎng)瓶，保證細(xì)胞數(shù)一致。加入15%的FBS的RPMI 1640, 37°C, 5% CO2常規(guī)培養(yǎng)
(2)凝聚態(tài)AP 25_35的制備用超純水將凍干的A P 25_35充分溶解配成lmmol/L的儲存液，于_20°C保存，臨用前于37°C放置4-24h使其形成凝聚態(tài)A ^ 25_35，加入其中一瓶進(jìn)行處理，工作濃度為10 u mol/L,另ー瓶作為對照組，常規(guī)培養(yǎng)48h。3.蛋白收集和濃度測定
在細(xì)胞狀態(tài)良好時收集細(xì)胞，刮取貼壁細(xì)胞并計數(shù)，細(xì)胞濃度約為107/mL，用PBS (pH=7. 4)洗滌細(xì)胞3 次。加入細(xì)胞裂解液(8mol/L尿素，4% CHAPS, 40mmol/L Tris-HCI,pH=7.4)，振蕩30 min，充分混勻樣品后，將細(xì)胞裂解液高速離心(16 OOOg離心20 min)，取上清液，采用Bradford法測定蛋白濃度后置于_70°C冰箱保存。實施例2、差異蛋白的篩選
I.第一向等電聚焦電泳與平衡
將樣品與水化液(7mol/L 尿素，2mol/L 硫脲，4 % CHAPS, 65mmol/L DTT，0. 2 %IPGBuffer,痕量溴酚藍(lán))混合，總體積為500 u L，總蛋白量為200 u g，加入聚焦盤中，并將IPG干膠條膠面向下置于聚焦盤中，然后在ProteanIEF Cell等電聚焦儀中進(jìn)行等電聚焦。參數(shù)設(shè)置如下17°C被動水化16 h，100 V聚焦5 h，250 V聚焦3 h，500 V聚焦2 h，I 000V聚焦2 h，10 000 V聚焦5 h，總電壓時間積為60 000 Vh 后終止聚焦。電泳結(jié)束后取出膠條沖洗井先后于DTT和碘こ酰胺中各平衡I次，毎次均為15 min。2.第二向 SDS-PAGE 電泳
將平衡后的膠條置于10%的均勻SDS-PAGE分離膠上端，用0. 5%的瓊脂糖封膠。電泳參數(shù)設(shè)置第一步為恒定電流5 mA/gel,50 min ;第二步為25mA/gel，待溴酚藍(lán)遷移至凝膠下緣時停止電泳。3.凝膠染色
采用和質(zhì)譜相容的銀染方法顯示2-DE圖譜，其步驟分為固定、漂洗、水洗、銀染、水洗、顯色、終止、水洗及保存。4.凝膠掃描與圖像分析
每組細(xì)胞重復(fù)上樣5次，得到5張不同的凝膠。用雙向電泳凝膠專用圖像掃描儀GS-710對所有凝膠進(jìn)行透射掃描。利用ImageMaster 2D軟件對凝膠進(jìn)行分析。整個分析過程包括通過自動檢測和手工標(biāo)記進(jìn)行蛋白質(zhì)點檢測，利用背景扣除消減部分背景和垂直條紋并進(jìn)行蛋白質(zhì)點的匹配和匹配蛋白質(zhì)點的表達(dá)量差異分析。圖譜顯示，除已用于AD篩查的標(biāo)志物外，表達(dá)差異的蛋白質(zhì)點共7個。5.質(zhì)譜分析
將雙向電泳分析發(fā)現(xiàn)的表達(dá)有明顯差異的蛋白質(zhì)點，從凝膠上切下，進(jìn)行水洗、脫色、酶解、萃取和冷凍干燥后，在MALDI-T0FMS質(zhì)譜儀上進(jìn)行分析，獲得肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)和相應(yīng)數(shù)據(jù)。6.數(shù)據(jù)庫查詢
將MALDI-T0F-MS肽指紋圖譜所得到的質(zhì)荷比在Mascot數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，再通過NCBI數(shù)據(jù)庫搜索匹配蛋白。查詢參數(shù)物種分類選擇為人類；酶選擇為Trypsin ;允許的未酶切位點選擇為I ;固定修飾為carbamidomethyl (C),變量修飾為oxidation(M),量誤差為0. 5Da ;肽片段容差選擇為IOOppm ;離子選擇為MH+和monoiso-tope ;選擇直接輸入MascotSearch即可進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索。其中以匹配分值(mowse score)為基礎(chǔ)的概率(P)評價數(shù)據(jù)庫搜尋結(jié)果的質(zhì)量，匹配分值的大小表示鑒定蛋白屬于隨機(jī)匹配的可能性，當(dāng)匹配分值達(dá)到或超過66分時，待測蛋白的氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫中某已知蛋白的氨基酸序列覆蓋率較高，認(rèn)為匹配的可能性很大，統(tǒng)計學(xué)上有意義(P < 0. 05)。本發(fā)明的Prohibitin蛋白得分100遠(yuǎn)高于66分,且在綠色域值以外說明結(jié)果可信。在7個顯著差異蛋白質(zhì)點中選擇差異倍數(shù)最大的I個異常蛋白質(zhì)點進(jìn)行質(zhì)譜分析。結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中共發(fā)現(xiàn)多個蛋白之匹配并可能性具有統(tǒng)計學(xué)意義(即匹配的程度)，搜索鑒定該差異蛋白質(zhì)為Prohibitin蛋白。實施例3、Prohibitin蛋白蛋白差異表達(dá)的免疫印跡驗證
為了確認(rèn)Prohibitin蛋白的差異表達(dá)，取已被確診為AD的患者血清標(biāo)本3例，并取經(jīng)證實為患AD的正常血清標(biāo)本I例作為對照，血液室溫凝集后高速離心(12000rpm/min，15min),經(jīng)常規(guī)樣品處理后,進(jìn)行Western blot檢測。實驗步驟大體如下以40 mg蛋白上樣電泳(SDS-PAGE凝膠),電壓I5OV轉(zhuǎn)印至Immobilon-P膜(Millipore公司)。5%脫脂奶粉室溫封閉I. 5 h,加入ー抗。ー抗分別是抗P-Actin抗體和抗Prohibitin抗體(I 1000 ；Abcam公司)，次日加入ニ抗辣根過氧化物酶抗體，并進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光法染色(ECL試劑盒，Amersham公司)。免疫印跡驗證結(jié)論表明，和正常人體血清中相比，Prohibitin蛋白在AD患者血清中顯著高表達(dá),與質(zhì)譜結(jié)果吻合，進(jìn)ー步驗證了質(zhì)譜鑒定結(jié) 果的準(zhǔn)確性。實施例4、Prohibitin蛋白抗體在制備用于AD檢測的試劑盒中的用途
由于Prohibitin蛋白在AD中存在差異表達(dá)，顯然與AD的發(fā)生發(fā)展有著密切的相關(guān)性，因此以Prohibitin蛋白作為ー個蛋白質(zhì)分子標(biāo)記，對其表達(dá)量進(jìn)行檢測可以用于檢測AD。相應(yīng)的,特異性抗Prohibitin蛋白的抗體,包括各種抗Prohibitin蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體，由于其能夠用于檢測Prohibitin蛋白的表達(dá)量。因而可以用于檢測AD，或者用于制備檢測AD的制劑或試劑盒等。檢測方法可以包括，但不限于，免疫印跡、蛋白質(zhì)芯片、免疫熒光、酶聯(lián)免疫檢測、免疫層析檢測等方法，試劑盒中的其他試劑及其組合方法均為本領(lǐng)域的常規(guī)之選，抗體可進(jìn)行必要的修飾，例如偶聯(lián)標(biāo)記物，所述標(biāo)記物可以是熒光物質(zhì)、酶、放射性同位素等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可利用Prohibitin蛋白在AD中存在差異表達(dá)這ー重要信息，對上述內(nèi)容進(jìn)行適當(dāng)修改，以實現(xiàn)相應(yīng)的執(zhí)行情況。但是，所有基于本發(fā)明的修改或改造新方法，屬于保留的權(quán)利。
權(quán)利要求
1.一種檢測老年性癡呆的試劑盒，其特征在于，包括Prohibitin蛋白抗體，用于測量來自受測對象生物樣本中的Prohibitin蛋白表達(dá)量。
2.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其中，所述Prohibitin蛋白抗體為單克隆或多克隆抗體。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒,其中，所述Prohibitin蛋白抗體偶聯(lián)有標(biāo)記物。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中，所述所述標(biāo)記物選自由熒光物質(zhì)、酶、放射性同位素組成的組。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的試劑盒，其中，所述生物樣本為血清。
6.Prohibitin蛋白抗體在制備診斷老年性癡呆的試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于,所述試劑盒包括Prohibitin蛋白抗體,用于測量來自受測對象生物樣本中的Prohibitin蛋白表達(dá)量，通過與正常個體生物樣本中的Prohibitin蛋白表達(dá)量進(jìn)行比較，以確定所述受測對象是否患有老年性癡呆。
7.如權(quán)利要求6所述的試劑盒,其中，所述Prohibitin蛋白抗體為單克隆或多克隆抗體。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒,其中，所述Prohibitin蛋白抗體偶聯(lián)有標(biāo)記物。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其中，所述所述標(biāo)記物選自由熒光物質(zhì)、酶、放射性同位素組成的組。
10.如權(quán)利要求6-9中任一項所述的試劑盒，其中，所述生物樣本為血清。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有抗乳腺癌活性的寡肽，其序列為His-Asn-Tyr-Gly-Phe-Val-Pro-Ser-Leu。所述寡肽在較低濃度下能選擇性抑制體外乳腺癌細(xì)胞的生長，而對正常乳腺細(xì)胞的生長無影響。體內(nèi)試驗也表明，該寡肽對癌細(xì)胞的生長和增殖有很強(qiáng)的抑制作用，并呈現(xiàn)明顯的劑效關(guān)系。因其安全、高效、理想的抗癌效果，該寡肽可用于制備抗癌藥物，并具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N33/53GK102707065SQ20121007959
公開日2012年10月3日 申請日期2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月23日
發(fā)明者吳健 申請人:常熟市虞山綠茶有限公司