專利名稱：結(jié)合物的制備方法及相關(guān)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及免疫分析領(lǐng)域，具體而言涉及結(jié)合物如酶標記物、尤其堿性磷酸酶標記物的制備方法以及用于該方法的試劑盒。
背景技術(shù)：
酶標記物包括酶標記抗原、酶標記抗體和酶標記葡萄球菌蛋白A等。酶標記物質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到免疫酶技術(shù)的成功與否，因此被稱為關(guān)鍵的試劑。酶標記物中最常用的是酶標記抗體，它是將酶與特異性抗體經(jīng)適當方法連接而成。酶標記抗體主要應用于免疫 ￡口跡雜交(Western blotting)、酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme Iinkedimmunosorbent assay, ELISA)、化學發(fā)光酶免疫分析(chemiluminescence enzyme immunoassay, CLEIΑ)及免疫組化等免疫檢測和定量分析。酶標記抗體的質(zhì)量主要取決于純度好、活性強及親和力高的酶和抗體，其次要有良好的制備方法。目前常用的酶標記抗體(抗原)的方法主要有三種(BioconjugateTechniques， Academic Press/2008 年第二版)1.戊二醛交聯(lián)法此法是以雙功能交聯(lián)劑為橋，使酶與抗體(抗原)結(jié)合。最常用的交聯(lián)劑是戊二醛。它具有兩個活性醛基，可分別與酶分子和抗體(抗原)分子上的氨基結(jié)合。堿性磷酸酶一般用此法進行標記。戊二醛法又根據(jù)試劑加入的方法分為一步法和二步法。在一步法中戊二醛直接加入酶與待標記物的混合物中，反應后即得酶標記物。在兩步法中，先將酶與戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再與待標記物作用而形成酶標記物。也可先將待標記物與戊二醛作用，再與酶聯(lián)結(jié)。這兩種方法標記的堿性磷酸酶標記物的活性和標記率都不夠理想，影響免疫分析的靈敏度。2.過碘酸鹽氧化法此法只適用于含糖量較高的酶。辣根過氧化物酶的標記常用此法。反應時，過碘酸鈉將辣根過氧化物酶分子表面的多糖氧化為很活潑的醛基，可與蛋白質(zhì)上的氨基形氏堿而結(jié)合。該方法的操作較為復雜，酶和抗體(抗原)活性損失多，不太適合制備堿性磷酸酶標記物。3.琥珀酰亞胺-馬來酰亞胺交聯(lián)法一種同時帶有可與氨基反應的琥珀酰亞胺酯類和可與巰基反應的馬來酰亞胺基團的異源雙功能交聯(lián)試劑常用于制備酶標記物。這種交聯(lián)試劑常用的有4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯(SMCC)或其水溶性類似物4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸-3-磺基琥珀酰亞胺酯(sulfo-SMCC)， 它們可通過活化酶分子的氨基得到帶有馬來酰亞胺基團的酶分子，酶分子上的馬來酰亞胺基團可以和巰基化待標記物上的巰基基團反應，最后得到酶標記物。該方法所用試劑昂貴， 而且，待標記物通常需經(jīng)過巰基化處理，操作復雜。本發(fā)明提供制備結(jié)合物如酶標記物、尤其是堿性磷酸酶標記物的方法以及試劑盒。該方法簡便易行、成本低廉，標記后結(jié)合物中各成分如酶和待標記物活性保持好，酶標記物試劑靈敏度高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個方面涉及由待結(jié)合物A和待結(jié)合物B物制備結(jié)合物的方法，其中待結(jié)合物A含有氨基和羧基，待結(jié)合物B含有氨基，所述方法包括以下步驟1)在交聯(lián)劑存在下，用通式I的羧基化合物將待結(jié)合物A的氨基封閉
權(quán)利要求
1.由待結(jié)合物A和待結(jié)合物B制備結(jié)合物的方法，其中待結(jié)合物A含有氨基和羧基，待結(jié)合物B含有氨基，所述方法包括以下步驟1)在交聯(lián)劑存在下，用通式I的羧基化合物將待結(jié)合物A的氨基封閉
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述結(jié)合物為酶標記物，所述待結(jié)合物A為標記用酶。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述結(jié)合物為酶標記物；所述待結(jié)合物A為肽或蛋白質(zhì)，例如為抗體；所述待結(jié)合物B為標記用酶。
4.權(quán)利要求2或3的方法，其中所述標記用酶選自堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、 β -半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖氧化酶和蘋果酸脫氫酶，優(yōu)選為堿性磷酸酶。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述待結(jié)合物A為載體蛋白，所述待結(jié)合物B為半抗原。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述待結(jié)合物A為肽或蛋白質(zhì)，而待結(jié)合物B為固體支持體。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述待結(jié)合物A為選自抗體和配體的靶向部分，而待結(jié)合物 B為含氨基的藥物；或者所述待結(jié)合物A為肽或蛋白類藥物，而待結(jié)合物B為選自抗體和配體的靶向部分。
8.權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其中所述純化選自超濾純化、脫鹽柱純化和透析純化。
9.權(quán)利要求1-8中任一項的方法，其中在待結(jié)合物A的羧基被活化后，通過加入巰基化合物猝滅交聯(lián)劑活性，或者經(jīng)純化除去交聯(lián)劑，得到羧基活化的氨基封閉的待結(jié)合物Α。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述巰基化合物選自巰基乙醇和巰基蘇糖醇，優(yōu)選巰基乙
11.權(quán)利要求9的方法，其中羧基活化的氨基封閉的待結(jié)合物A的純化選自超濾純化、 脫鹽柱純化和透析純化。
12.權(quán)利要求1-11中任一項的方法，其中所述羧基化合物選自甲酸、乙酸、草酸、苯甲酸、水楊酸、磺基水楊酸和它們的鹽，優(yōu)選選自甲酸、乙酸、草酸、苯甲酸和它們的鹽，更優(yōu)選為乙酸鈉。
13.權(quán)利要求1-12中任一項的方法，其中所述碳二亞胺選自二環(huán)己基碳二亞胺、 1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N，N' - 二異丙基碳二亞胺；所述羥基琥珀酰亞胺選自N-羥基琥珀酰亞胺和N-羥基磺基琥珀酰亞胺。
14.權(quán)利要求1-13中任一項的方法，其中在步驟1)中，羧基化合物的摩爾數(shù)為酶分子或待標記物摩爾數(shù)的500-200000倍，優(yōu)選1000-20000倍；和/或交聯(lián)劑的摩爾數(shù)是酶分子或待標記物摩爾數(shù)的50-5000倍，優(yōu)選100-1000倍；和/或碳二亞胺和羥基琥珀酰亞胺的摩爾比例為5 1-1 10，優(yōu)選2 1-1 5。
15.權(quán)利要求1-14中任一項的方法，其中在步驟幻中，碳二亞胺的摩爾數(shù)是酶分子的摩爾數(shù)的10-5000倍，優(yōu)選50-1000倍；碳二亞胺和羥基琥珀酰亞胺的摩爾比例為 5:1-1: 10，優(yōu)選 2 1-1 5。
16.用于制備酶標記物的試劑盒，其包含1)標記用酶，其可以選自堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖氧化酶和蘋果酸脫氫酶，優(yōu)選為堿性磷酸酶；2)通式I的羧基化合物
17.權(quán)利要求16的試劑盒，其中所述羧基化合物選自甲酸、乙酸、草酸、苯甲酸、水楊酸、磺基水楊酸和它們的鹽，優(yōu)選選自甲酸、乙酸、草酸、苯甲酸和它們的鹽，更優(yōu)選為乙酸鈉。
18.權(quán)利要求16或17的試劑盒，其中所述碳二亞胺選自二環(huán)己基碳二亞胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N，N' -二異丙基碳二亞胺；所述羥基琥珀酰亞胺選自 N-羥基琥珀酰亞胺和N-羥基磺基琥珀酰亞胺。
19.權(quán)利要求16-18中任一項的試劑盒，其中所述巰基化合物選自巰基乙醇和巰基蘇糖醇，優(yōu)選巰基乙醇。
20.權(quán)利要求16-19中任一項的試劑盒，其中所述的試劑盒還含有離心超濾管、指示操作者進行操作的說明或這兩者。
全文摘要
本發(fā)明提供制備結(jié)合物如酶標記物、尤其是堿性磷酸酶標記物的方法以及試劑盒。所述方法采用羧基化合物封閉含有氨基和羧基的待結(jié)合物A(如酶)分子表面的氨基基團，封閉了氨基的待結(jié)合物A(如酶)經(jīng)碳二亞胺活化，之后將碳二亞胺失活或去除，加入含有氨基的待結(jié)合物B(如待標記物)，反應一段時間后，得到結(jié)合物(如酶標記物)。
文檔編號G01N33/531GK102269762SQ20101019264
公開日2011年12月7日 申請日期2010年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月4日
發(fā)明者張裕平, 李可, 錢純亙 申請人:深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司