腦多頭蚴病的標志物gp50以及用于診斷腦多頭蚴病的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于動物疾病診斷領域，具體涉及一種腦多頭蚴病的標志物GP50以及用于診斷腦多頭蚴病的試劑盒。腦多頭蚴病間接ELISA診斷方法敏感性達95％、特異性達92.6％。人工感染多頭帶絳蟲山羊的血清抗體監(jiān)測發(fā)現(xiàn)在感染后的整個檢測期GP50抗體值均呈現(xiàn)陽性。因此GP50重組蛋白可作為腦多頭蚴病標志物，用于診斷腦多頭蚴病。本發(fā)明所述腦多頭蚴病的間接ELISA診斷試劑盒可以快速、靈敏、特異的用于診斷腦多頭蚴病，為腦多頭蚴病感染的早期的診斷及治療效果的評價奠定基礎。
【專利說明】
腦多頭蚴病的標志物GP50以及用于診斷腦多頭蚴病的試劑盒
技術領域
[0001]本發(fā)明屬于動物疾病診斷領域，具體涉及一種腦多頭蝴病的標志物GP50以及用于 診斷腦多頭蝴病的試劑盒。
【背景技術】
[0002] 腦多頭蝴病(Coenuriasis)又叫腦包蟲病，是由多頭帶絳蟲(Taenia multiceps) 的中絳期幼蟲腦多頭蝴(Coenurus cerebral is)寄生于牛、羊等偶蹄動物的腦和脊髓等處 引起的一種寄生蟲病。該病呈世界性分布，常引起患病動物發(fā)生死亡，給畜牧業(yè)造成巨大經(jīng) 濟損失，同時人也有感染的報道。
[0003] 多頭蝴病的臨床表現(xiàn)多樣，而且在動物感染后的一段時間內(nèi)不出現(xiàn)典型的臨床癥 狀，所以在感染早期難以確診。多樣的臨床表現(xiàn)導致了臨床診斷的復雜性和迫切需要更可 靠的診斷工具。
[0004] 醫(yī)學影像技術已經(jīng)用于人腦多頭蝴病的診斷，主要是應用MRI和CT掃描來識別人 腦部的包囊。這些技術同樣也可以用在動物腦多頭蝴的診斷上，Manunta等(2012)研究了 33 只患慢性腦多頭蝴病的綿羊和1只患病山羊的腦和頭骨的MRI特征，提示患病綿羊和山羊顱 腔形態(tài)異常，內(nèi)含大量的包囊。由于檢測結(jié)果的可信度高，MRI和CT掃描被認為是診斷人和 動物腦多頭蝴病最好的方法，但是這些先進的診斷方法不易在養(yǎng)殖場實施，檢測成本非常 昂貴，而且MRI和CT掃描技術成功應用的前提條件是腦多頭蝴在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)定居并形 成一定大小的包囊，所以此類技術并不能在感染的早期進行診斷。
[0005] 現(xiàn)代分子生物學技術已經(jīng)用于腦多頭蝴病的診斷，Ahmad Oryan等（2015)提取患 腦多頭蝴病的綿羊和山羊腦脊液DNA，以多頭帶絳蟲線粒體基因C0X1序列設計引物，建立了 檢測小型反芻動物腦多頭蝴病的PCR診斷方法，研究表明多頭帶絳蟲DNA存在于感染腦多頭 蝴的綿羊和山羊腦腦脊液中，能夠被所建立的PCR診斷方法所擴增。該診斷方法具有較高的 準確性，但抽取動物的腦脊液操作煩瑣，且不能進行早期診斷。
[0006] 傳統(tǒng)的血清學診斷技術已經(jīng)用于腦多頭蝴病的早期診斷，目前已經(jīng)建立了診斷多 頭蝴病的ELISA、Dot-ELISA、間接血凝試驗（IHA)及斑點免疫金滲濾試驗(DIGFA)等方法，這 些方法都具有較好的診斷效果，但其所用抗原為蟲體包囊液或原頭蝴等天然蟲體抗原，限 制了此類方法在生產(chǎn)上的推廣及使用。
[0007] GPI錨定蛋白是一類依賴糖基磷脂酰肌醇(Glycosyl Phosphatidyl Inositol, GPI)錨定連接在真核生物細胞膜表面的一類蛋白質(zhì)。GPI錨定蛋白在許多生物進程中扮演 著重要作用。Hancock等(2004)研究表明豬帶絳蟲GP50蛋白是一個GPI錨定在細胞膜表面的 豬囊尾蝴的診斷蛋白，并成功建立了基于重組GP50蛋白檢測豬的豬囊尾蝴感染血清 Western-blot方法。近年來，針對豬和人的豬囊尾蝴病已經(jīng)建立了基于GP50重組蛋白的 FAST-ELISA(Falcon assay screening test-enzyme-1 inked immunosorbent assay, FAST-ELISA)和QuickELISA診斷方法，其敏感性和特異性均較高，證實了 GP50重組蛋白在豬 囊尾蝴病上的診斷價值，但未見關于腦多頭蝴GP50(TmGP50)蛋白的相關研究報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 有鑒于此，本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的問題，提供一種腦多頭蝴病的標志物 以及用于診斷腦多頭蝴病的試劑盒。
[0009]
【申請人】采用多頭帶絳蟲GP50重組蛋白作抗原，建立了檢測山羊腦多頭蝴病的間接 ELISA診斷方法，其敏感性為95 %，特異性為92.6%，能夠在感染后第2周檢測出山羊血清抗 體陽性，與現(xiàn)有方法相比具有更早的檢出時間（提前7天）。此外，藥物治療組山羊在肌肉注 射吡喹酮后約3周呈現(xiàn)血清抗GP50抗體陰性，一直持續(xù)至整個試驗結(jié)束。表明GP50重組蛋白 可用于腦多頭蝴病的診斷以及藥物治療后的效果評價。
[0010]因此本發(fā)明提供了 GP50重組蛋白制備腦多頭蝴病標志物中的應用。
[0011] 本發(fā)明還提供了 GP50重組蛋白在制備腦多頭蝴病診斷試劑盒中的應用。所述診斷 試劑盒包括但不限于間接ELISA診斷試劑盒。
[0012] 本發(fā)明所述應用中所述腦多頭蝴病的受檢樣品可以采用本領域技術人員公知的 任何一種樣品，包括但不限于血液、唾液、尿液。優(yōu)選的，所述腦多頭蝴病的受檢樣品為血清 或血漿。
[0013] 本發(fā)明所述GP50重組蛋白為GP50基因與表達載體連接后獲得的重組質(zhì)粒在宿主 細胞中誘導表達的蛋白。
[0014] 在一些實施方案中，所述GP50重組蛋白的制備方法具體為提取山羊腦多頭蝴總 RNA，RT-PCR技術擴增GP50基因，構建pET-32a-GP50表達載體并誘導表達的蛋白。
[0015] 本發(fā)明所述表達載體可以采用本領域技術人員公知的任何一種表達載體，如pGEX 系列載體、PET系列載體等。優(yōu)選的，所述表達載體為pET32a (+)為pET32a (+)。
[0016] 本發(fā)明所述宿主細胞優(yōu)選為大腸桿菌。
[0017]本發(fā)明還提供了一種腦多頭蝴病的間接ELISA診斷試劑盒，包括GP50重組蛋白。 [0018]在一些實施方案中，本發(fā)明所述試劑盒還包括間接ELISA反應常用試劑。如PBST洗 液、TMB顯色液、反應終止液等。
[0019] 進一步的，在一些實施方案中，本發(fā)明所述試劑盒還包括對照品和標準品。
[0020] 由上述技術方案可知，本發(fā)明提供了一種腦多頭蝴病的標志物以及用于診斷腦多 頭蝴病的試劑盒。以GP50重組蛋白為抗原建立的間接ELISA診斷方法敏感性達95%、特異性 達92.6%，與山羊細頸囊尾蝴血清和綿羊細粒棘球蝴血清存在交叉反應。人工感染多頭帶 絳蟲山羊的血清抗體監(jiān)測發(fā)現(xiàn)在感染后的整個檢測期（2-17周)GP50抗體值均呈現(xiàn)陽性。因 此GP50重組蛋白可作為腦多頭蝴病標志物，用于診斷腦多頭蝴病。本發(fā)明所述腦多頭蝴病 的間接ELISA診斷試劑盒可以快速、靈敏、特異的用于診斷腦多頭蝴病，為腦多頭蝴病感染 的早期的診斷及治療效果的評價奠定基礎。
【附圖說明】
[0021] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0022] 圖1示GP50基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖，其中，泳道Μ為DL2000DNA Marker，泳道1為 PCR產(chǎn)物；
[0023] 圖2示以多頭帶絳蟲GP50氨基酸序列構建的進化樹(NJ樹）；
[0024] 圖3示重組質(zhì)粒pMD19-T-GP50的酶切鑒定圖，其中，泳道Μ為DL2000DNA Marker;泳 道1為重組質(zhì)粒PMD19-T-GP50經(jīng)BamH I和Xho I酶切產(chǎn)物；
[0025] 圖4示重組蛋白的SDS-PAGE圖，其中，泳道Μ為蛋白Marker;泳道1為IPTG誘導的 pET32a( + )空載體；泳道2為IPTG誘導的pET32a( + )-GP50質(zhì)粒；泳道3為未經(jīng)IPTG誘導的 pET32a( + )-GP50 質(zhì)粒；
[0026]圖5示GP50重組表達蛋白的免疫印跡分析結(jié)果圖，其中，泳道Μ為蛋白Marker;泳道 1為山羊腦多頭蝴陽性血清;泳道2為陰性對照血清；
[0027] 圖6示間接ELISA診斷方法的敏感性和特異性檢測，其中粗體水平線表示cut-off 值(0.581);
[0028]圖7示人工感染多頭帶絳蟲山羊血清抗GP50抗體規(guī)律監(jiān)測圖，其中粗體水平線表 不cut-off值（0·581)。
【具體實施方式】
[0029] 下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的 實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都 屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0030] 為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細闡述。
[0031] 其中實驗動物及血清來源如下：2只70日齡雌性健康新西蘭大白兔購自四川農(nóng)業(yè) 大學實驗動物中心;20只健康成年雌性山羊，購自非腦多頭蝴病流行區(qū)。20份山羊腦多頭蝴 陽性血清和7份山羊細頸囊尾蝴陽性血清采自四川某羊場自然感染山羊;8份細粒棘球蝴陽 性血清采自四川地區(qū)自然感染的綿羊；36份陰性血清采自通過尸體解剖無絳蟲感染的山 羊，其中24份用于cut-off值的確定，12份用于所建立方法的特異性檢測。340份人工感染陽 性血清來自于人工感染多頭帶絳蟲的20只山羊，從感染蟲卵后第7天開始采血分離血清，每 周一次，持續(xù)17周。所有血清貯存于-20 °C備用。
[0032]蟲體中多頭帶絳蟲成蟲從人工感染的狗體內(nèi)分離獲得;腦多頭蝴，從四川某羊場 自然感染山羊的腦部獲得。所有蟲體均用無菌生理鹽水沖洗3~4次后放入4%的多聚甲醛 或液氮中保存?zhèn)溆谩?br>[0033]主要試劑及來源為：DNA Marker DL2000、DNA Marker DL5000、DNA Marker DL7000,2 X Taq PCR MasterMix，Tiangel Midi Purification Kit,Tianprep Mini Plasmid Kit，天根生化科技（北京）有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)，F(xiàn)ermentas公司；限制性內(nèi)切酶（BamH I、Xho I)、十二烷基橫酸鈉 (SDS)、DEPC等，大連寶生物工程有限公司；DTT，成都金線科技有限公司;GoldView I型核酸 染色劑，上海索萊寶生物科技有限公司；弗氏（不)完全佐劑、IPTG，Sigma公司;PCR引物合成 及測序由上海英俊生物工程有限公司完成。
[0034]菌株和質(zhì)粒來源為：大腸桿菌DH5a和BL21(DE3)，天根生化科技（北京）公司； PMD19-T Vector，購自大連寶生物工程有限公司；原核表達載體pET32a( + )，購自 invitrogen(美國）。
[0035] 培養(yǎng)基和常用緩沖溶液的配制方法如下：
[0036] 50XTAE buffer:Tris 242g加水充分溶解后，加入冰乙酸57.1mL和0.5M EDTA (pH8.0)100mL，精確定容至1L，貯存于4°C備用；
[0037] 5 X Tris-甘氨酸電泳緩沖液:30 · 3gTris，188g甘氨酸，lOgSDS制備成1L水溶液貯 存于4°C，臨用前稀釋5倍；
[0038]氨芐青霉素：用滅菌的雙蒸水配制成儲存濃度為100mg/mL，過濾除菌，儲存于-20 °C備用；
[0039] 含氨節(jié)青霉素的LB液體培養(yǎng)基配制：Casein Tryptone 10g，Yeast Extract 5g， NaCl 10g，加去離子水約900mL，調(diào)PH值至7.2，定容至11^，分裝后115°(：高壓滅菌151^11，待培 養(yǎng)基溫度降至45°C左右后，加入氨芐青霉素（100yg/mL)，混勻后無菌操作倒板，待凝固后4 °C保存?zhèn)溆茫?br>[0040] TE緩沖液：lmmol/L Tris-HCl(pH 8.0)0.5mL，0.5M EDTA(pH8.0)0.1mL，加入 400mL dd H20混勾，精確定容至500mL后，115°C高壓滅菌20min，室溫保存；
[0041] TB緩沖液：混合2.4mL 0.45M MnC12,4mLlM KCl，0.6mL 0.5M CaC12,0.5m L 0.5M K-MES buffer，加12.5mL去離子水至總體積為20mL;
[0042] 10 %十二烷基磺酸鈉(SDS): lOg SDS粉末溶解于80mL去離子水中，37°C水浴約lh， 溶解后，精確定容至l〇〇mL;
[0043] 5X上樣緩沖液：60mmol/L Tris-HCl(pH6.8)，25%甘油，2%SDS，14.4mmol/L 2- 巰基乙醇，0.1 %溴酚藍；
[0044] 1.5M Tris-HCl(8.8)溶液:Tris堿18.17g，溶于80mL去離子水，濃鹽酸調(diào)pH至8.8， 定容至100mL，保存4°C備用；
[0045] 30%丙稀酰胺母液：29.28厶(：巧13111丨(16，]^1^8-4(^713111丨(16，用6〇1111^去離子水充 分攪拌溶解，37度水浴，之后加去離子水定容至100mL，過濾后，4°C棕色瓶保存?zhèn)溆茫?br>[0046] 1 ·0M Tris-HCl(6 · 8)溶液:Tris堿 12 · lg，溶于80mL去離子水，濃鹽酸調(diào)pH至6 ·8， 精確定容至l〇〇mL，保存于4°C備用；
[0047] 10%過硫酸胺溶液:0. lg過硫酸胺溶于lmL去離子水中；
[0048] PBS液：KC1 0.2g/L，NaCl 8g/L，Na2HP04 12.03g/L，KH2P04 0.2g/L，用NaOH調(diào)節(jié) pH至7.2;
[0049] 0.01m〇l/L TBST:8.8g NaCl，0.2g KCl，3g Tris base用800mL去離子水溶解后， 加入500uL Tween-20，調(diào)整pH值到7.4，去離子水定容到1L高壓滅菌；
[0050] 25mg/mL IPTG:溶解250mg的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷于10mL水中，分成小份貝士 存于_20°C;
[00511 考馬斯亮藍染色液:考馬斯亮藍R250 0.25g，45mL甲醇，10mL冰醋酸，用去離子水 定容至100mL;
[0052] Western blot轉(zhuǎn)膜緩沖液：5.8g Tris，2.9g甘氨酸，0.37g SDS，200mL甲醇，加去 離子水定容至l〇〇〇mL;
[0053] Western blot洗滌緩沖液：Tris 2.42g，NaCl 29.2g，加水至 1000mL，臨用前加入 Tween-20 0.25mL；
[0054] Western blot底物顯色液：DAB 20mg，TBS 2.5mL，H20 50mL，30%H202 l.OyL混合 而成，現(xiàn)配現(xiàn)用；
[0055] Western blot顯色終止液：冰醋酸2mL，蒸餾水98mL。
[0056] 主要儀器設備為:PCR儀，（Mastercycle Gradient-3231，德國Eppendof公司）；電 泳儀(EPS301，德國賽多利斯公司）；凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc XR+，美國BI0-RAD公司）；紫外分 光光度儀，（美國Pharmacia Biotech公司）；超純水系統(tǒng)，（arium61316,德國賽多利斯公 司）；高速離心機（德國Eppendof公司）；移液器（德國Eppendof公司）；超聲波細胞破碎儀 (ZJ92-Π DN，寧波新芝生物科技股份有限公司）。
[0057] 主要數(shù)據(jù)庫和分析軟件為：開放閱讀框預測：http : //www · ncbi · nlm · nih · gov/ gorf/gorf.html ;NCBI(GenBank)數(shù)據(jù)庫：http: //www.ncbi ·nlm.nih·gov/;蛋白的分子量 和等電點預測：http://web.expasy.org/compute_pi/;BLAST 檢測：http:// blast .ncbi · nlm.nih · gov/Blast · cgi ;信號肽預測：http: //www. cbs · dtu · dk/services/ SignalP/;跨膜區(qū)預測:http://www. cbs ·dtu·dk/services/TMHMM/;親水性分析:http:// web · expasy · org/prot scale/ ;二級結(jié)構預測：http : //npsa-pbi 1 .ibcp.fr/cgi-bin/ secpred_hnn. pi;引物設計:Primer5.0軟件;密碼子偏好性分析:codonW 1.4.2軟件;序列 進化樹分析:MAGA 5.1軟件。
[0058]實施例1、腦多頭蝴總RNA的提取及GP50基因的擴增
[0059]取液氮保存的腦多頭蝴蟲體，參照上海華舜生物有限公司總RNA提取試劑盒所提 供程序提取腦多頭蝴總RNA，置于_70°C保存?zhèn)溆谩?br>[0000 ] 按照F ermen t a s公司試劑盒說明書進行，將提取的多頭帶絳蟲腦多頭蝴總RNA進行 反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，反應體系如下：先在PCR管中加入總10yL RNA;lyL DEPC-Water;lyL Oligo dT(18);65°C水浴5min，冰浴3min后在加入4yL 5XReaction buffer;2yL，dNTP (10mM);lyL AMV;lyL RNase inhibitor;反應程序為42°C60min，70°C5min，然后8°C保存。 [0061 ] 根據(jù)多頭帶絳蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的Unigenel7013序列及Genbnk中豬帶絳蟲GP50診 斷抗原基因(Accession No:AY214922.1)開放閱讀框，利用Primer 5.0設計了一對引物，弓丨 物序列如下：
[0062] 上游引物：5，-ATGCTGGCACTCACTGC-3';
[0063] 下游引物：5，-TCACAAAACCATTGGTATCA-3 '。
[0064] PCR擴增體系參照天根生化科技(北京)有限公司MasterMix PCR擴增試劑盒說明， 在PCR反應管中分別加入以下組分：2 X Taq PCR MasterMix: 12.5yL;模版cDNA產(chǎn)物：lyL; RNase Free dH20:9.5yL，上下游引物各lyL。將反應體系中的各個試劑混均、瞬時離心，進 行PCR擴增。
[0065] 擴增條件:94°C預變性5min; 30個循環(huán)，每個循環(huán)條件為94°C，變性45s，52°C退火 35s，72°C延伸45s;最后72°C延伸lOmiruPCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳并觀察結(jié)果，見圖 1〇
[0066]用0RF Finder在線分析軟件預測GP50基因的開放閱讀框(0RF);利用BLAST搜索目 的基因同源序列；用信號肽預測軟件Signal IP預測目的基因信號肽；用MEGA 5.1軟件以鄰 接法構建進化樹，結(jié)果見圖2。
[0067]圖1結(jié)果顯示，用特異性引物從多頭帶絳蟲腦多頭蝴cDNA中擴增到一條約849bp的 目的片段，與預期大小相符。其N-端有48bp的信號肽序列，除去信號肽后編碼286個氨基酸， 推導的蛋白分子大小為31.021^)&，等電點為7.584，與豬帶絳蟲〇&61^ &8〇1丨11111)6?50基因 序列相似性達92%，與亞洲帶絳蟲（Taenia asiatica)GP50基因序列相似性達96%?；?Genbank中絳蟲類GP50基因氨基酸序列的進化分析表明，所有序列僅構成較為明顯的一個 分支(圖2)。
[0068]實施例2、原核表達載體的構建 [0069] 1、GP50基因表達引物的設計、擴增與克隆
[0070] 根據(jù)GP50基因序列，用Primerf.O設計引物，并在上下游引物的5'端分別添加限制 性內(nèi)切酶位點BamH I、Xho I和保護性堿基，引物序列如下：
[0071 ]上游引物：5 ' -CCGGAATTCGAAAATGCCCCAA-3 '（含BamH I酶切位點）；
[0072]下游引物:5' -CGGCTCGAGTCACAAAACCATTGGTATCA-3'（含Xho I酶切位點）。
[0073] PCR反應體系及擴增程序見實施例1WCR擴增產(chǎn)物在1 %瓊脂糖凝膠中電泳，Gold-v i ew染色，切下目的條帶，純化并連接到pMD 19-T載體。按照質(zhì)粒抽提試劑盒說明書提取PCR 鑒定為陽性的克隆菌株質(zhì)粒。用BamH I和Xho I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳分 尚，結(jié)果見圖3。
[0074]圖3結(jié)果顯示雙酶切得到pMD19-T載體骨架和大于750bp的目的基因片段，片段大 小與預期相符，表明GP50基因已正確連接到pMD 19-T載體。
[0075] 酶切體系如下：BamH I，lyL; Xho I，lyL; 10 XM buffer，2yL;pMD19-T-GP50質(zhì)粒， 1 OyL; ddH20，6yL;共計 20yL。
[0076] 用膠回收試劑盒回收經(jīng)過BamH I和Xho I酶切后的GP50質(zhì)粒，在T4DNA連接酶的作 用下與pET32a( + )質(zhì)粒，16°C過夜連接。連接體系如下：雙酶切GP50產(chǎn)物，4.5yL;pET32a( + ) 質(zhì)粒，1以1^(1(1!12〇,2.541^10\了40嫩1^8&86 1311打61，141^了40嫩1^8&86，141^共計1(^匕將 以上連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5a，并將其鋪于含有氨芐青霉(50yg/mL)的LB培 養(yǎng)基中，37 °C倒置過夜培養(yǎng)，挑取單菌落進行PCR鑒定。
[0077]經(jīng)過上述鑒定為陽性的質(zhì)粒，小量提取其質(zhì)粒，分別選用BamH I和Xho I酶對質(zhì)粒 進行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠中電泳，檢測是否有目的條帶。
[0078] 將經(jīng)PCR鑒定和雙酶切雙重鑒定為陽性的重組質(zhì)粒，送上海英俊生物工程有限公 司進行測序。
[0079] 實施例3、重組質(zhì)粒pET32a( + )-GP50在大腸桿菌中的誘導表達及SDS-PAGE分析
[0080] 將pET32a( + )-GP50質(zhì)粒的單個白色菌落BL21(DE3)接入2mL LB培養(yǎng)液(含Amp 100 yg/mL)中，37°C搖床過夜培養(yǎng);分別取lmL培養(yǎng)液接種于另外兩瓶100mL的含Amp(100yg/mL) 的LB培養(yǎng)液中，37 °C搖床下培養(yǎng)4h;其中一瓶中加入IPTG至終濃度lmmo 1/L，另一瓶為對照 培養(yǎng)(不加IPTG);分別取lmL菌液移入兩個新的離心管中，12，000r/min離心2min，去上清收 集菌體。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測，結(jié)果見圖4。
[0081] 圖4結(jié)果顯示，重組表達蛋白位于細菌包涵體，誘導表達產(chǎn)物為與約20kDa的His-tag蛋白相偶聯(lián)的融合蛋白，大小約51kDa。
[0082] 實施例4、重組蛋白的純化和含量測定
[0083] 1、重組蛋白的純化
[0084] (1)將過夜培養(yǎng)的含pET32a( + )-GP50的BL21(DE3)菌落接種至含100yg/mL濃度Amp 的LB液體培養(yǎng)基中，加入IPTG至終濃度lmmo 1/L，37°C搖床下培養(yǎng)4h，搖床振蕩培養(yǎng)，獲得重 組蛋白菌液；
[0085] (2)將菌液12，000r/min離心10min，棄上清，留菌體，-20 °C放置50min，反復凍融， 使菌體細胞壁充分破除；
[0086] (3)超聲波破碎菌體，直到菌液澄清，并依次用含有不同濃度尿素的蛋白緩沖液洗 滌沉淀；
[0087] (4)洗滌后，再用含8mol/L尿素結(jié)合蛋白緩沖液，懸浮沉淀，冰上放置60min，12， 000r/min離心30min，用NC膜(孔徑0.45mm)過濾收集上清液；
[0088] (5)用His結(jié)合樹脂純化，用緩沖液（50mmol/L咪唑，6mo VL尿素，0 · 5mo 1/LNaCl， 20mmol/L Tris-HCl ρΗ7·9)洗去雜蛋白，用洗脫液（lmol/L咪唑，6mol/L尿素，0.5mol/ LNaCl，20mmol/L Tris-HCl ρΗ7·9)洗脫目的重組蛋白；
[0089] (6)4°C下，將重組蛋白分別在含2mol/L尿素的roS及roS溶液中依次透析，將重組 蛋白溶液進行冷凍干燥后，-80 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0090] 2、重組蛋白的含量測定
[0091] 參照上海杰瑞生物公司BCA蛋白定量測定劑盒說明書進行。
[0092]實施例5、免疫印跡分析
[0093] (1)蛋白樣品的制備：細菌誘導表達后，用超聲波粉碎儀將菌體超聲波勻漿約 lmin，然后12000r/min離心15min，取上清液；
[0094] (2)進行 SDS-PAGE;
[0095] (3)待電泳結(jié)束后將膠條割至合適大小，用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡4次，每次5min;
[0096] (4)將預先裁好的濾紙和NC膜浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中20min;
[0097] (5)轉(zhuǎn)膜:轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽極碳板、24層濾紙、NC膜、凝膠、24層濾紙陰 極碳板;每層精確對齊，去除氣泡，吸干多余液體。接通電源，恒流〇. 8mA/cm2，轉(zhuǎn)移35min。轉(zhuǎn) 移結(jié)束后，斷開電源，將膜取出。
[0098] (6)用 TBST 洗膜(0.01mol/L)，3 次，每次 5min;
[0099] (7)加入包被液(含5%脫脂奶粉的PBS溶液），室溫處理90min;
[0100] (8)去掉包被液，用0.01mol/L TBST洗膜，3次，每次5min;
[0101] (9)加入羊腦多頭蝴陽性血清(用0.01mol/L PBS按1:100稀釋），4°C孵化12h;
[0102] (10)去掉一抗并用 TBST(0.01mol/L)洗膜，4 次，每次 5min;
[0103] (11)加入HRP-兔抗羊IgG二抗(按1:3000的比例用O.Olmol/L PBS稀釋），室溫平穩(wěn) 搖動2h;
[0104] (12)倒掉二抗，TBST(0.01mol/L)洗膜 4 次，每次 5min;
[0105] (13)加入顯色液(現(xiàn)配現(xiàn)用），避光顯色直至目的條帶出現(xiàn)時加入雙蒸水終止反 應。結(jié)果見圖5。
[0106] 圖5結(jié)果顯示純化的重組蛋白可與山羊腦多頭蝴陽性血清發(fā)生明顯免疫反應。
[0107] 實施例6、間接ELISA診斷方法的建立和應用
[0108] 1、抗原包被濃度及抗體稀釋度的確定
[0109] 將重組蛋白用包被液稀釋為 3 · 148、1 · 574、0 · 787、0 · 396、0 · 197 和0 · 098yg/mL，100 μL每孔，包被96孔板，4°C過夜;洗滌、封閉后，將陰性和陽性血清分別按1:5、1:10、1: 20、1: 40、1:80倍比稀釋，每孔100μ1，37°C反應2h。后面步驟按常規(guī)ELISA方法進行，以P/N值最大 時的條件為最佳抗原濃度和最佳血清稀釋度。結(jié)果如表1所示。
[0110]表1抗原包被濃度及血清稀釋度的確定
[0113] 注:N，陽性血清;P，陰性血清；以粗斜體顯示的數(shù)字代表這種間接ELISA方法的最 佳條件。
[0114] 表1結(jié)果顯示，當抗原濃度為0.197yg/孔，血清稀釋度為1:10時，P/N值最大 (2.76)，且陽性血清的0D值接近于1，所以最佳抗原濃度為0.197yg/孔，最佳血清稀釋比1: 10。
[0115] 2、酶標記二抗稀釋度的確定
[0116] 抗原和血清最佳濃度確定以后，將HRP標記的兔抗羊IgG按1: 250、1:500、1:1000、 1: 2000和1:4000倍稀釋，反應lh，再加入TMB顯色，出現(xiàn)P/N值最大的二抗?jié)舛葹樽罴严♂?度。結(jié)果顯示酶標二抗?jié)舛茸罴严♂尪葹?:2000。
[0117] 3、血清最佳反應時間的確定
[0118] 將抗原和血清稀釋到最佳濃度后，分別反應0.5、1、1.5和2h，加入酶標二抗，顯色 測定0D450nm，以P/N值確定最佳反應時間。結(jié)果顯示血清最佳反應時間為1.5h。
[0119] 4、酶標二抗最佳孵化時間的確定
[0120] 加二抗后分別作用60、90和120min，常規(guī)方法進行ELISA試驗。比較各組陰、陽性血 清的0D450nm值和P/N值，以確定二抗最佳的反應時間。結(jié)果顯示酶標二抗最佳孵化時間為 lh〇
[0121] 5、Cut_off 值的確定
[0122] 按照上面已經(jīng)優(yōu)化的各條件用間接ELISA方法檢測24份陰性血清，每份血清設2個 重復，計算陰性樣品0D450平均值（1 )及標準方差(SD)。根據(jù)公式:臨界值.=I + 3SD:, 計算出Cut-off值。
[0123] 結(jié)果顯示24份陰性血清的0D450平均值（J )等于0.329,標準差（SD)等于0.084， 所以cut-off值= 0.329+0.252 = 0.581。在陰、陽性對照有效的情況下，0D450值大于0.581 就可判定為陽性。
[0124] 6、敏感性和特異性檢測
[0125] 用已建立的GP50重組蛋白間接ELISA法，檢測20份山羊腦多頭蝴陽性血清、7份山 羊細頸囊尾蝴陽性血清、8份綿羊細粒棘球蝴陽性血清和12份健康羊的血清，分別用下列公 式對敏感性和特異性進行評價，結(jié)果見圖6。
[0126] 敏感性（％ ) = ELISA檢測陽性X 100/真陽性；
[0127] 特異性（％ ) =ELISA檢測陰性X 100/真陰性。
[0128] 結(jié)果顯示，20份山羊腦多頭蝴陽性血清僅有1份0D450值低于cut-off值，敏感性為 95% (19/20) ;7份山羊細頸囊尾蝴陽性血清和8份綿羊細粒棘球蝴陽性血清各有1份0D450 值高于cut-off值，12份健康山羊血清0D450值均低于cut-off值，特異性為92.6 % (25/27)。
[0129] 7、人工感染多頭帶絳蟲山羊抗GP50血清抗體的檢測
[0130] 將20只來自非腦多頭蝴病流行區(qū)的成年健康山羊隨機分為兩組，分別為藥物治療 組和對照組，每組10只，隔離飼養(yǎng)于四川農(nóng)業(yè)大學實驗動物房，按70mg/Kg體重一次肌肉注 射10 % (w/v)吡喹酮驅(qū)蟲。所有山羊均于驅(qū)蟲后第7天經(jīng)口感染5500個多頭帶絳蟲蟲卵，其 中藥物治療組于感染后45天按70mg/Kg體重肌肉注射10% (w/v)吡喹酮驅(qū)蟲治療，每天1次， 持續(xù)2天。兩組均從感染蟲卵后第7天開始采血、分離血清，每周一次，持續(xù)17周，用上述建立 的間接ELISA診斷方法進行血清抗體檢測，結(jié)果見圖7。
[0131] 圖7結(jié)果顯示，對照組于感染后第2周血清抗體呈現(xiàn)陽性(0D值>0.581)，一直持續(xù) 至17周試驗結(jié)束;藥物治療組同樣于感染后第2周抗體呈現(xiàn)陽性，但在感染后第10周(注射 吡喹酮后第3周)抗體值呈現(xiàn)陰性(0D值〈0.581)，一直持續(xù)至實驗結(jié)束。
【主權項】
1. GP50重組蛋白在制備腦多頭蝴病標志物中的應用。 2. GP50重組蛋白在制備腦多頭蝴病診斷試劑盒中的應用。3. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述腦多頭蝴病的受檢樣品為血清或血 漿。4. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述GP50重組蛋白為GP50基因與表達載體 連接后獲得的重組質(zhì)粒在宿主細胞中誘導表達的蛋白。5. 根據(jù)權利要求4所述的應用，其特征在于，所述表達載體為pET32a( + )，所述宿主細胞 為大腸桿菌。6. -種腦多頭蝴病的間接ELISA診斷試劑盒，其特征在于，包括GP50重組蛋白。7. 根據(jù)權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還包括間接ELISA反應常用試劑。
【文檔編號】G01N33/68GK106018831SQ201610554272
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月14日
【發(fā)明人】楊光友, 黃興
【申請人】四川農(nóng)業(yè)大學