一種乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物檢測領域，具體涉及一種腫瘤血清標志物CA125、HE4和P?her2的乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒。本發(fā)明提供的乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒主要由抗體酶標板、生物素抗體包被板、牛血清白蛋白、血清稀釋液、辣根過氧化物酶、四甲基聯(lián)苯胺、硫酸、陰性對照液和陽性對照液組成。本發(fā)明提供的乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒可以檢測手術治療后患者或復發(fā)及轉移性腫瘤患者體內CA125、HE4和p?her2的表達水平，對乳腺癌的臨床診斷具有重要意義；而且本發(fā)明提供的乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒可以降低血清中其他物質的干擾，大大的提高檢測結果的準確性和穩(wěn)定性，有利于乳腺癌患者的早期診斷和預后處理。
【專利說明】
一種乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒
技術領域
[00011本發(fā)明屬于生物檢測領域，具體涉及一種腫瘤血清標志物CA125、HE4和P-her2的 乳腺癌三聯(lián)診斷試劑盒。
【背景技術】
[0002] 乳腺癌是一種較為常見的惡性腫瘤疾病，是發(fā)病率最高的女性惡性腫瘤疾病，約 占各種惡性腫瘤疾病的10 %-12%。經相關研究顯示，全世界每年大約有160萬人被診斷了 為乳腺癌，并且每年約有50萬人死于該疾病。而且乳腺癌的發(fā)病率正以每年4%的速度遞 增，患者人群也開始年輕化，嚴重威脅全球女性的身心健康。因此，加強對乳腺癌治療技術 的研究是極其必要的。
[0003] CA125、HE4和p-her2在乳腺癌中具有較高的表達。近年來，腫瘤患者血清CA125、 HE4和p-her2水平在腫瘤臨床實踐中的應用價值已引起越來越多的關注。國外已有血清檢 測試劑盒被批準用于臨床，并且CA125、HE4和p-her2血清水平及其變化趨勢可用作腫瘤治 療效果的評價與預后評估指標。因此CA125、HE4和p-her2血清水平檢測在腫瘤診斷和治療 中有著重要的應用價值。
[0004] 傳統(tǒng)的CA125、HE4和p-her2檢測主要是通過創(chuàng)傷性的腫瘤組織活檢，使用免疫組 化（IHC)和熒光原位雜交(FISH)等方法，但是這些方法不能檢測手術治療后患者或復發(fā)及 轉移性腫瘤患者體內的CA125、HE4和p-her2表達水平。因此，研究和開發(fā)出可以用于檢測手 術治療后患者或復發(fā)及轉移性腫瘤患者體內的CA125、HE4和p-her2表達水平，無創(chuàng)傷性的 乳腺癌腫瘤檢測方法仍是當前亟需解決的難題。
[0005] 中國專利申請201510038319.8公開了 一種腫瘤相關抗體定量檢測試劑盒，所述試 劑盒是將一種腫瘤抗原性的植物蛋白作為抗原包被在96孔板中，以不同受試者血清中的腫 瘤抗體作為一抗，標記辣根過氧化酶的羊抗人抗體作為二抗，采用間接免疫發(fā)光學技術來 檢測受試者血清中腫瘤抗體。
[0006] 中國專利申請201510600309.9公開了一種用于檢測血清HER2的試劑盒及用途，所 述試劑盒包括配對的抗HER2單克隆抗體曲妥珠單抗和生物素化的A18,該試劑盒是通過酶 聯(lián)免疫吸附法(ELISA)來檢測乳腺癌患者血清中的HER2表達水平，從而達到檢測乳腺癌的 目的。該試劑盒是一種無創(chuàng)傷性、簡便、迅速的診斷和監(jiān)測HER2陽性腫瘤病程發(fā)展的用于檢 測乳腺癌的檢測試劑盒。
[0007] 然而，現(xiàn)有的血清檢測試劑盒只能檢測單一的指標，在檢測過程中存在靈敏性和 特異性較低的缺陷，大大的限制了上述產品的推廣和應用。
【發(fā)明內容】
[0008] 為了解決現(xiàn)有技術中的乳腺癌診斷試劑盒的不足，本發(fā)明目的在于提供一種乳腺 癌三聯(lián)檢診斷試劑盒，相比于現(xiàn)有的乳腺癌診斷試劑盒，本發(fā)明乳腺癌診斷試劑盒具有更 高的靈敏度高和更強的特異性。
[0009] 本發(fā)明提供了一種乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒，包括抗體酶標板、生物素抗體包被 板、牛血清白蛋白、血清稀釋液、辣根過氧化物酶、四甲基聯(lián)苯胺、硫酸、陰性對照液和陽性 對照液;所述酶標板抗體包括包被在酶標板上的抗CA125、HE4和p-her2單克隆抗體;所述生 物素抗體包被板包括包被在微孔板的生物素標記的CA125、HE4和p-her2單克隆抗體。
[0010] 進一步地，所述抗體酶標板的制備方法為：用pH為8.2的ros緩沖液將抗CA125、HE4 和p-her2單克隆抗體稀釋至20-100μg/ml，按100μΙ/孔的加入量加于96孔酶標板中，在溫度 為2-8 °C的條件下放置過夜，然后用洗滌液洗滌，所述洗滌液為含有0.05 % Tween-20，pH為 7.4的磷酸鹽緩沖液，甩干，得包被有抗CA125、HE4和p-her2單克隆抗體的96孔酶標板。 [0011]進一步地，所述生物素抗體包被板的制備方法為:將CA125、HE4和p-her2單克隆抗 體與活化的生物素混合進行標記，透析去除未結合的生物素，得生物素CA125、HE4、p-her2 單克隆抗體;用pH為8.2的?83緩沖液將04125、冊4、？-1^^2單克隆抗體稀釋至20-10(^8/1111， 按100μΙ/孔的加入量加于微孔板中，在溫度為2-8°C的條件下放置過夜，然后用洗滌液洗 滌，所述洗滌液為含有〇 . 05 % Tween 20，pH為7.4的磷酸鹽緩沖液，甩干，得包被有生物素 CA125、HE4和p-her2單克隆抗體的微孔板。
[0012] 進一步地，所述血清稀釋液由以下組分組成：
[0013] 人胰島素5-8U/ML、磷酸二氫鉀2-4g/L、磷酸氫二鈉2-4g/L、硫酸鈉4-6g/L、氯化鈉 20-248/1、脫氧膽酸鈉10-14 8/140了4-21(0.4-0.68/1，余量為水。
[0014] 進一步地，所述血清稀釋液由以下組分組成：
[0015] 人胰島素6U/ML、磷酸二氫鉀3g/L、磷酸氫二鈉3g/L、硫酸鈉5g/L、氯化鈉22g/L、脫 氧膽酸鈉12g/L、EDTA-2K 0 · 5g/L，余量為水。
[0016] 進一步地，所述血清稀釋液的pH值為6.2-6.5。
[00?7]進一步地，所述血清稀釋液的pH值為6.4。
[00?8]進一步地，所述四甲基聯(lián)苯胺的濃度為0.4mg/ml。
[0019]進一步地，所述硫酸的濃度為2mol/L。
[0020] 本發(fā)明是在常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附試驗的基礎上，通過生物素與辣根過氧化物酶之間 的作用，建立了一種高靈敏度的生物素-酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，以測定待測樣中的腫瘤蛋白 CA125、HE4和p-her2的表達水平。因為生物素很易與抗體等蛋白質以共價鍵結合，所以有生 物素標記的CA125、HE4、p-her2單克隆抗體中的生物素容易與辣根過氧化物酶產生反應，既 起到多級放大的作用，同時由于酶在遇到相應的顯色底物時會發(fā)生催化作用而呈色的作 用，從而達到檢測目標抗原或抗體分子的目的。采用本發(fā)明的乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒可 以有效、穩(wěn)定地測定乳腺癌患者血清中CA125、HE4和p-her2的含量，其靈敏度高，測試重復 性好。
[0021] 進一步地，本發(fā)明提供的血清稀釋液可以有效的減少受檢血清中其他物質的干 擾，可以大大的提高CA125、HE4和p-her2檢測的靈敏度和穩(wěn)定性，有利于乳腺癌患者的早期 診斷和預后處理。
[0022] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提供的技術方案具有以下優(yōu)勢：
[0023] (1)本發(fā)明提供的乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒可以檢測手術治療后患者或復發(fā)及轉 移性腫瘤患者體內的CA125、HE4和p-her2表達水平，對乳腺癌的臨床診斷具有重要意義；
[0024] (2)本發(fā)明提供的乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒可以降低血清的其他物質的干擾，大 大的提高檢測結果準確性和穩(wěn)定性，有利于乳腺癌患者的早期診斷和預后處理。
【具體實施方式】
[0025]下面將進一步的詳細說明本發(fā)明。需要指出的是，以下說明僅僅是對本發(fā)明要求 保護的技術方案的舉例說明，并非對這些技術方案的任何限制。本發(fā)明的保護范圍以所附 權利要求書記載的內容為準。下列實施例中未注明具體試驗條件的試驗方法，通常按照常 規(guī)條件，分子克隆試驗指南（Sambrook J，et al.2008.Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd Ed.)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0026]實施例1、乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒 [0027] 1、乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒的制備
[0028] 1.1、抗體酶標板的制備方法為：
[0029] 用pH為8.2的roS緩沖液將抗CA125、HE4和p-her2單克隆抗體稀釋至60μg/ml，按 100μΙ/孔的加入量加于96孔酶標板中，在溫度為4°C的條件下放置過夜，然后用洗滌液洗 滌，所述洗滌液為含有〇. 05 % Tween 20，pH為7.4的磷酸鹽緩沖液，甩干，得包被有抗CA125、 HE4和p-her2單克隆抗體的96孔酶標板。
[0030] 1.2、生物素抗體包被板的制備方法為：
[0031]將CA125、HE4和p-her2單克隆抗體與活化的生物素混合進行標記，透析去除未結 合的生物素，得生物素 CA125、HE4和p-her2單克隆抗體；用pH為8.2的roS緩沖液將CA125、 HE4和p-her2單克隆抗體稀釋至50μg/ml，按100μ1/孔的加入量加于微孔板中，在溫度為4°C 的條件下放置過夜，然后用洗滌液洗滌，所述洗滌液為含有〇. 05 % Tween 20，pH為7.4的磷 酸鹽緩沖液，甩干，得包被有生物素 CA125、HE4和p-her2單克隆抗體的微孔板。
[0032] 1.3、血清稀釋液的配置：
[0033] 取人胰島素5-8U/ML、磷酸二氫鉀2-4g/L、磷酸氫二鈉2-4g/L、硫酸鈉4-6g/L、氯化 鈉20-248/1、脫氧膽酸鈉10-148/140了六-21(0.4-0.68/1，加水調節(jié)?!1為6.2-6.5。
[0034] 2、乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒的使用步驟：
[0035] 2.1、加樣：
[0036] (1)包被有抗CA125、HE4和p-her2單克隆抗體的96孔酶標板處理：
[0037]在包被有抗CA125、HE4和p-her2單克隆抗體的96孔酶標板上劃分陽性對照孔、陰 性對照孔、待測樣品孔和空白孔共四組檢測孔，陽性對照孔中加入陽性對照液，1〇〇μ1/孔， 陰性對照孔中加入陰性對照液，1〇〇μ1/孔，待測樣品孔中加入待測血清，1〇〇μ1/孔，樣本加 完后，然后每孔加入50ul量的濃度為0.5 %的牛血清白蛋白和50ul量的血清稀釋液，所述的 血清稀釋液為：人胰島素 6U/ML、磷酸二氫鉀3g/L、磷酸氫二鈉 3g/L、硫酸鈉 5g/L、氯化鈉 22g/L、脫氧膽酸鈉 12g/L、EDTA-2K 0 · 5g/L，加水調節(jié)pH值為6 · 4;在酶標板上加蓋或者覆 膜，在37 °C條件下放置2h后棄去液體，用洗滌液洗滌，甩干；
[0038] (2)加入生物素CA125、HE4和p-her2單克隆抗體：
[0039] 每個檢測孔中加入100μ1生物素CA125、HE4和p-her2單克隆抗體，在37°C條件下放 置lh后棄去液體，每個檢測孔中加入350μ1洗滌液浸泡2min，甩干或輕輕地拍干，洗滌、甩干 的動作重復3次；
[0040] (3)加入辣根過氧化物酶：
[0041 ]每個檢測孔中加入100μΙ的辣根過氧化物酶，在37°C條件下放置lh后棄去液體，每 個檢測孔中加入350μ1洗滌液浸泡2min，甩干或輕輕地拍干，洗滌、甩干的動作重復5次； [0042] (4)加入顯色底物：
[0043]在每個檢測孔中依次加入一滴濃度為0.4mg/ml四甲基聯(lián)苯胺，在37°C條件下避 光贅顯色；
[0044] (5)加入終止液：
[0045] 按照上述顯色底物的加入順序依次在每個檢測孔中加入50μ1終止液，終止反應， 終止反應的表現(xiàn)為檢測孔中的液體由藍色快速轉變成黃色。
[0046] 3、結果檢測：
[0047]在加入終止液后15min內，用酶聯(lián)儀在450nm的波長條件下檢測每個檢測孔的光密 度0D值，檢測試劑盒的檢測標準為：以標準品的濃度為縱坐標(或對數(shù)坐標），0D值為橫坐標 (或對數(shù)坐標），使用curve expert 1.30軟件繪出標準曲線(最佳方程式應依回歸方程計算 的R2值來定，以R2值越趨近于1為好），計算樣品的實際濃度。其中：陽性結果判斷標準如表1 所示：
[0048]表1陽性結果判斷標準
[0050] 實施例2、乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒的精確度試驗
[0051] 本發(fā)明制備的包被96孔酶標板的變異系數(shù)CV值小于8%，對同一批次及不同批次 的檢測試劑盒進行試驗測試，測試結果顯示批內及批間的試劑盒的CV值均小于8%，說明本 發(fā)明的乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒具有高精密性。
[0052] 實施例3、乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒的靈敏度試驗
[0053] 采用CA125、HE4和p-her2標準品配制不同濃度的供試溶液，具體如表2所示：
[0054] 表2不同濃度的CA125、HE4和p-her2標準品供試溶液
[0055]
[0056] 由表2可知，采用實施例1制備的乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒測試各濃度供試溶液進 行測定，通過酶標儀進行檢測，每個濃度測定3次。
[0057]結果表明，實施例1制備的乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒的靈敏度極佳，CA125的靈敏 度為<lU/ml，HE4的靈敏度為<3pmol/L，HCG的靈敏度為〈lIU/mL。
[0058]實施例4、乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒的穩(wěn)定性試驗
[0059] 1、將實施例1制備的乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒在室溫下放置3、6和12個月，然后按 照實施例3的方法進行靈敏度測定。
[0060] 2、本實施例的對比例如下：
[0061] 對比例1:制備方法同實施例1，區(qū)別僅在于，抗體酶標板的制備過程采用的PBS緩 沖液的平pH值為8.0。
[0062]對比例2:制備方法同實施例1，區(qū)別僅在于，抗體酶標板的制備過程采用的PBS緩 沖液的平pH值為8.4。
[0063]對比例3:制備方法同實施例1，區(qū)別僅在于，所述血清稀釋液為：人胰島素6U/ML、 磷酸二氫鉀3g/L、磷酸氫二鈉3g/L、硫酸鈉5g/L、氯化鈉22g/L、脫氧膽酸鈉12g/L，加水調節(jié) pH值為6.4。
[0064]對比例4:制備方法同實施例1，區(qū)別僅在于，所述血清稀釋液為：人胰島素6U/ML、 磷酸二氫鉀3g/L、磷酸氫二鈉3g/L、硫酸鈉5g/L、氯化鈉22g/L、脫氧膽酸鈉12g/L、EDTA-2K0 · 5g/L，加水調節(jié)pH值為6 · 0。
[0065]對比例5:制備方法同實施例1，區(qū)別僅在于，所述血清稀釋液為：人胰島素6U/ML、 磷酸二氫鉀3g/L、磷酸氫二鈉3g/L、硫酸鈉5g/L、氯化鈉22g/L、脫氧膽酸鈉12g/L、EDTA-2K0 · 5g/L，加水調節(jié)pH值為6 · 8。
[0066] 3、試驗結果
[0067] 試驗結果如表3、表4和表5所示：
[0068]表3乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒存放3個月后的靈敏度結果
[0074] 由表3、表4和表5可知，本發(fā)明制備的乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒具有較好的的靈敏 度。
[0075] 本
【發(fā)明內容】
僅僅舉例說明了要求保護的一些具體實施方案，其中一個或更多個技 術方案中所記載的技術特征可以與任意的一個或多個技術方案相組合，這些經組合而得到 的技術方案也在本申請保護范圍內，就像這些經組合而得到的技術方案已經在本發(fā)明公開 內容中具體記載一樣。
【主權項】
1. 一種乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒，其特征在于，包括抗體酶標板、生物素抗體包被板、 牛血清白蛋白、血清稀釋液、辣根過氧化物酶、四甲基聯(lián)苯胺、硫酸、陰性對照液和陽性對照 液;所述酶標板抗體包括包被在酶標板上的抗CA125、HE4和p-her2單克隆抗體;所述生物素 抗體包被板包括包被在微孔板的生物素標記的CA125、HE4和p-her2單克隆抗體。2. 如權利要求1所述的乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒，其特征在于，所述抗體酶標板的制備 方法為： 用pH為8.2的PBS緩沖液將抗CA125、HE4和p-her2單克隆抗體稀釋至20-100μg/ml，按 100μΙ/孔的加入量加于96孔酶標板中，在溫度為2-8°C的條件下放置過夜，然后用洗滌液洗 滌，所述洗滌液為含有〇. 05 % Tween-20，pH為7.4的磷酸鹽緩沖液，甩干，即得。3. 如權利要求1所述的乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒，其特征在于，所述生物素抗體包被板 的制備方法為： 將CA125、HE4和p-her2單克隆抗體與活化的生物素混合進行標記，透析去除未結合的 生物素，得生物素 CA125、HE4和p-her2單克隆抗體；用pH為8.2的roS緩沖液將CA125、HE4和 p-her2單克隆抗體稀釋至20-100μg/ml，按100μΙ/孔的加入量加于微孔板中，在溫度為2-8 °C的條件下放置過夜，然后用洗滌液洗滌，所述洗滌液為含有0.05 % Tween 20，pH為7.4的 磷酸鹽緩沖液，甩干，即得。4. 如權利要求1所述的乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒，其特征在于，所述血清稀釋液由以下 組分組成： 人胰島素5-8U/ML、磷酸二氫鉀2-4g/L、磷酸氫二鈉2-4g/L、硫酸鈉4-6g/L、氯化鈉20-248/1、脫氧膽酸鈉10-14 8/140了4-21(0.4-0.68/1，余量為水。5. 如權利要求4所述的乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒，其特征在于，所述血清稀釋液由以下 組分組成： 人胰島素6U/ML、磷酸二氫鉀3g/L、磷酸氫二鈉3g/L、硫酸鈉5g/L、氯化鈉22g/L、脫氧膽 酸鈉 12g/L、EDTA-2K 0.5g/L，余量為水。6. 如權利要求4所述的乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒，其特征在于，所述血清稀釋液的pH值 為6.2-6.5。7. 如權利要求5所述的乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒，其特征在于，所述血清稀釋液的pH值 為 6.4。8. 如權利要求1所述的乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒，其特征在于，所述四甲基聯(lián)苯胺的濃 度為 0.4mg/ml。9. 如權利要求1所述的乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒，其特征在于，所述硫酸的濃度為 2mol/L〇10. 如權利要求1所述的乳腺癌三聯(lián)檢診斷試劑盒，其特征在于，所述陰性對照液為不 含CA125、HE4和p-her2的正常人血清，所述陽性對照液為含有乳腺癌腫瘤標志物CA125、HE4 和p-her 2的乳腺癌患者血清。
【文檔編號】G01N33/574GK105866418SQ201610388260
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月3日
【發(fā)明人】陳立國
【申請人】廣州華弘生物科技有限公司