專利名稱：一種檢測四環(huán)素類藥物的試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測四環(huán)素類藥物的試劑盒及方法，具體涉及一種用于檢測牛奶樣品中四環(huán)素類藥物的膠體金試紙條及其檢測方法。
背景技術(shù)：
四環(huán)素類藥物(TCs)具有廣譜高效的殺菌抗生功效，可以與大多數(shù)藥物或飼料添加劑混用，已被廣泛應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中。但過量使用不可避免的造成了嚴(yán)重的藥物殘留，成為嚴(yán)重危害人類健康的食品安全隱患之一。為此世界各國對TCs殘留的檢測十分關(guān)注。歐盟第675/92號令中初步規(guī)定在肌肉及牛奶中的四環(huán)素類化合物的總量不得超過IOOyg/kg,在腎臟、肝臟及雞蛋中分別不得超過600 μ g/kg>300 μ g/kg及200 μ g/kg。日本肯定列表制度規(guī)定奶和雞蛋中四環(huán)素類化合物的總量分別不得超過100ng/mL和400ng/mg。已報(bào)道的四環(huán)素類藥物殘留的檢測方法有微生物法、薄層色譜法、高效液相測定法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、毛細(xì)管電泳、電化學(xué)分析、化學(xué)發(fā)光、酶聯(lián)免疫法、膠體金免疫法等，儀器檢測方法對待測樣品的前處理要求高，操作繁瑣，需要精密儀器設(shè)備。免疫學(xué)方法具有快速、靈敏、特異性高等特點(diǎn)，是四環(huán)素類藥物殘留檢測的有效方法之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測四環(huán)素類藥物的試劑盒。本發(fā)明所提供的試劑盒包括微孔試劑和試紙，微孔試劑具有微孔塞，試紙包括底板、樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊、保護(hù)膜，其依次連接；所述微孔試劑中凍干有四環(huán)素類藥物特異性抗體-膠體金標(biāo)記物；四環(huán)素類藥物特異性抗體可為四環(huán)素類藥物單克隆抗體或四環(huán)素類藥物多克隆抗體；反應(yīng)膜上包括檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)；當(dāng)四環(huán)素類藥物特異性抗體為四環(huán)素類藥物單克隆抗體時(shí)，檢測區(qū)包被四環(huán)素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控區(qū)包被羊抗鼠抗抗體；當(dāng)四環(huán)素類藥物特異性抗體為四環(huán)素類藥物多克隆抗體時(shí)，檢測區(qū)包被四環(huán)素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控區(qū)包被羊抗兔抗抗體。所述四環(huán)素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物是由四環(huán)素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血藍(lán)蛋白、甲狀腺蛋白、人血清白蛋白。所述四環(huán)素類藥物特異性抗體-膠體金標(biāo)記物中的四環(huán)素類藥物特異性抗體是以四環(huán)素半抗原-載體蛋白作為免疫原制備獲得。所述四環(huán)素類藥物為四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素和土霉素。所述保護(hù)膜粘貼樣品吸收墊上，為檢測端，上面有MAX標(biāo)記線。所述檢測區(qū)位于靠近有MAX標(biāo)記的保護(hù)膜的一端，所述質(zhì)控區(qū)位于遠(yuǎn)離有MAX標(biāo)記的保護(hù)膜的一端。所述底板可為PVC底板或其他硬質(zhì)不吸水的材料；所述樣品吸收墊可為吸濾紙或?yàn)V油紙；所述吸水墊為吸水紙；所述反應(yīng)膜可為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜；所述保護(hù)膜為PE材質(zhì)保護(hù)膜。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備上述試劑盒的方法，其包括步驟:I)制備凍干有四環(huán)素類藥物特異性抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑，將微孔試劑加上微孔塞；2)制備具有包被四環(huán)素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測區(qū)和包被抗抗體的質(zhì)控區(qū)的反應(yīng)膜；3)將2)制備好的反應(yīng)膜與樣品吸收墊、吸水墊、保護(hù)膜、底板組裝成試紙；4)將I)和3)制備好的凍干有四環(huán)素類藥物特異性抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑、試紙組裝成試劑盒。具體地說，步驟包括:I)合成四環(huán)素半抗原:取1.1-2.2g四環(huán)素，四環(huán)素的用量優(yōu)選為1.lg，0.37-0.75g 4-哌啶甲酸，4-哌啶甲酸的用量優(yōu)選為0.37g，2-5ml 37%甲醛，甲醛的用量優(yōu)選為2ml，在50-100ml乙醇中混合，乙醇的用量優(yōu)選為50ml，在60%微波強(qiáng)度下反應(yīng)3_5分鐘；除去溶劑后，反相柱層析分離，得到黃色固體。2)將四環(huán)素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)，制備四環(huán)素類藥物-載體蛋白偶聯(lián)物；3)用四環(huán)素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物免疫小鼠，將小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞通過融合、篩選，得到分泌四環(huán)素類藥物單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株或用四環(huán)素半抗原-載體蛋白免疫兔，得到四環(huán)素類藥物多克隆抗體；4)提取小鼠IgG或兔IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠IgG抗體或羊抗兔抗抗體；5)用檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金；6)將制備的四環(huán)素類藥物特異性抗體加入到制備的膠體金中，得到四環(huán)素類藥物特異性抗體-膠體金標(biāo)記物；7)將四環(huán)素類藥物特異性抗體-膠體金標(biāo)記物凍干在微孔試劑中后，將微孔試劑加上微孔塞；8)將樣品吸收墊用含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在緩沖液中的終濃度為0.5%體積百分含量)、pH為7.2、0.lmol/L磷酸鹽緩沖液浸泡2h，37°C下烘干2h ；9)在底板上按順序粘貼上樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊和保護(hù)膜；10)將制備好的微孔試劑、試紙組裝成試劑盒，2 8°C條件下保存12個(gè)月。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種應(yīng)用上述試劑盒檢測牛奶樣品中四環(huán)素類藥物殘留的方法，它包括步驟:(I)用試劑盒進(jìn)行檢測；(2)分析檢測結(jié)果。 用本發(fā)明上述任一所述試劑盒進(jìn)行檢測。本發(fā)明中用試劑盒檢測時(shí)，將待檢牛奶樣品溶液滴加于微孔試劑中，混勻后，孵育5min,將標(biāo)有MAX標(biāo)記線端向下，插入孵育后的微孔試劑，待檢樣品液與微孔中的金標(biāo)抗體結(jié)合后一起向反應(yīng)膜擴(kuò)散；若待檢樣品液中四環(huán)素類藥物的含量高，則擴(kuò)散過程中待檢樣品液中的四環(huán)素類藥物可與金標(biāo)抗體相結(jié)合，進(jìn)而完全封閉金標(biāo)抗體上四環(huán)素類藥物的抗原結(jié)合點(diǎn)，阻止金標(biāo)抗體與反應(yīng)膜上四環(huán)素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物結(jié)合，檢測區(qū)不顯色，而抗抗體則可與金標(biāo)抗體結(jié)合，質(zhì)控區(qū)顯色；若待檢樣品液中四環(huán)素類藥物的含量低或無，則金標(biāo)抗體上的抗原結(jié)合位點(diǎn)不能被封閉，進(jìn)而金標(biāo)抗體會(huì)與反應(yīng)膜上四環(huán)素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)抗原結(jié)合，檢測區(qū)顯色，同時(shí)抗抗體也可與金標(biāo)抗體結(jié)合，質(zhì)控區(qū)顯色。如果質(zhì)控區(qū)不顯色，則試紙失效。如圖4所示。陽性:當(dāng)質(zhì)控區(qū)(C)顯示出條帶，而檢測區(qū)⑴不顯示，判為陽性，用“ + ”表示。陰性:當(dāng)質(zhì)控區(qū)(C)和檢測區(qū)⑴均顯示出條帶，判為陰性，用表示。無效:當(dāng)質(zhì)控區(qū)(C)不顯示條帶，試紙失效。本發(fā)明的試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低、操作簡單、檢測時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。其中，采用高特異性的四環(huán)素類藥物單克隆抗體，保證了檢測結(jié)果的可靠性；將金標(biāo)抗體凍干在微孔試劑中，在檢測過程中，能夠使金標(biāo)抗體與待檢樣品液充分接觸，充分反應(yīng)，增加整個(gè)體系的反應(yīng)靈敏度，不需要將牛奶樣品稀釋直接將樣品滴加于微孔試劑中，操作更簡單。用本發(fā)明試劑盒檢測四環(huán)素類藥物的方法，簡便、快速、直觀、準(zhǔn)確、適用范圍廣、成本低、易推廣使用。


圖1為試紙剖面結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為試紙俯視圖。圖3為微孔試劑圖。圖4為試紙檢測結(jié)果判定圖。圖5為四環(huán)素半抗原合成圖。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1檢測四環(huán)素類藥物的試劑盒的構(gòu)成一、試紙(稱作試紙條)(圖1)所述試紙是由底板、樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊、保護(hù)膜組成；所述樣品吸收墊1、反應(yīng)膜2、吸水墊3和保護(hù)膜7依次按順序粘貼在底板6上，樣品吸收墊的末端與反應(yīng)膜相連，反應(yīng)膜的末端與吸水墊相連，樣品吸收墊的始端與底板的始端對齊，吸水墊的末端與底板的末端對齊；所述試紙樣品吸收墊端粘貼有保護(hù)膜，保護(hù)膜7覆蓋在樣品吸收墊上的檢測端，在檢測端保護(hù)膜上印有MAX字樣(圖2);所述反應(yīng)膜上有檢測區(qū)4和質(zhì)控區(qū)5，均呈與所述試紙條的長相垂直的條帶狀，檢測區(qū)位于靠近有MAX標(biāo)記的保護(hù)膜的一端，質(zhì)控區(qū)位于遠(yuǎn)離有MAX標(biāo)記的保護(hù)膜的一端。檢測區(qū)包被有四環(huán)素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控區(qū)包被有羊抗鼠抗抗體；所述底板為PVC底板；所述樣品吸收墊為吸濾紙；所述吸水墊為吸水紙；所述反應(yīng)膜為硝酸纖維素膜；所述保護(hù)膜為PE材質(zhì)保護(hù)膜。二、微孔試劑(圖3)所述微孔試劑上凍干有四環(huán)素類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，凍干量0.20 0.25 μ g/mL ；所述微孔試劑具有微孔塞9。將上述微孔試劑、試紙組裝成試劑盒，在2 8°C環(huán)境中保存，有效期12個(gè)月。
實(shí)施例2實(shí)施例1中所述試劑盒的制備方法一、試劑盒的制備該試劑盒的制備方法主要包括以下步驟:I)制備凍干有四環(huán)素類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑，將微孔試劑加上微孔塞；2)制備具有包被四環(huán)素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測區(qū)和包被羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控區(qū)的反應(yīng)膜；3)將2)制備好的反應(yīng)膜與樣品吸收墊、吸水墊、保護(hù)膜、底板組裝成試紙；4)將I)和3)制備好的凍干有四環(huán)素類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑和試紙組裝成試劑盒。下面分步詳細(xì)敘述:(一 )各部件的制備1.四環(huán)素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的合成與鑒定(I)四環(huán)素半抗原的制備(路線如圖5)取1.1g四環(huán)素,0.37g 4-哌唳甲酸，2ml 37%甲醒,在50ml乙醇中混合,在60%微波強(qiáng)度下反應(yīng)3-5分鐘；除去溶劑后，反相柱層析分離，得到黃色固體。(2)免疫原的制備將四環(huán)素半抗原與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到免疫原，具體步驟方法如下:I)取IOmg四環(huán)素半抗原用Iml 二甲基甲酰胺(DMF)溶解,冷卻至10°C,加入10 μ I氯甲酸異丁酯，10°c攪拌反應(yīng)30min,得到溶液A ；2)取 40mg BSA 用 3ml 50mmol/L Na2CO3 溶解，與溶液 A 混合，10°C 反應(yīng) 4h，然后4°C過夜，得到溶液B ;3)溶液B用0.01mol/L PBS 4°C透析3天，每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)，得到免疫原，分裝，于-20°C保存?zhèn)溆谩?3)包被原的制備將四環(huán)素半抗原與卵清白蛋白(OVA)偶聯(lián)得到包被原，具體步驟方法如下:I)取18mg四環(huán)素半抗原溶解于2ml DMF中；2)取25mg碳化二亞胺(EDC)用0.2ml水充分溶解后加入上述步驟I)的溶液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A ；3)稱取OVA 36mg,使之充分溶解在8ml PBS (pH 7.2)中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h，得到溶液B ；4)溶液B用0.01mol/L PBS 4°C透析3天，每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)，得到包被原，分裝，于-20°C保存?zhèn)溆谩?4)四環(huán)素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的鑒定將載體蛋白、四環(huán)素半抗原、四環(huán)素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物用pH7.4的PBS配成0.5mg/mL的溶液，以0.01mol/L pH7.4PBS調(diào)零，用紫外分光光度計(jì)在波長200 800nm范圍內(nèi)掃描，得到載體蛋白、四環(huán)素半抗原、四環(huán)素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的吸收曲線。三者出現(xiàn)不同的吸收曲線，表明四環(huán)素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成功。2.四環(huán)素類藥物單克隆抗體的制備
(I)動(dòng)物免疫將步驟I得到的免疫原注入Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為150 μ g/只，使其產(chǎn)生
抗血清。(2)細(xì)胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按8: I (數(shù)量配比)比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，篩選得到穩(wěn)定分泌四環(huán)素類藥物單克隆抗體的四環(huán)素類藥物單克隆雜交瘤細(xì)胞株。(3)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇將雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成IX IO9個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37 °C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。(4)單克隆抗體的制備與純化增量培養(yǎng)法:將雜交瘤細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37°C條件下進(jìn)行培養(yǎng)，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養(yǎng)液進(jìn)行純化，得到單克隆抗體，_20°C保存。所述細(xì)胞培養(yǎng)基為向RPM1-1640培養(yǎng)基中添加小牛血清和碳酸氫鈉，使小牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為20% (質(zhì)量百分含量)，使碳酸氫鈉在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為0.2% (質(zhì)量百分含量)；所述細(xì)胞培養(yǎng)基的pH為7.4。3.羊抗鼠抗抗體的制備以羊作為免疫動(dòng)物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。4.四環(huán)素類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備(I)膠體金的制備用雙蒸去離子水將1%氯金酸(購于sigma公司，產(chǎn)品目錄號T09041)稀釋成0.01 % (質(zhì)量百分含量)，取IOOml置于錐形瓶中，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰，在持續(xù)高溫、持續(xù)攪拌下加入2.5ml 1%檸檬酸三鈉(購于廣州化學(xué)試劑廠，產(chǎn)品目錄號BGl 1-AR-01KG)，繼續(xù)勻速攪拌加熱至溶液呈透亮的紅色時(shí)停止，冷卻至室溫后用去離子水恢復(fù)到原體積，4°C保存。制備好的膠體金外觀純凈、透亮、無沉淀和漂浮物。(2)四環(huán)素類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備在磁力攪拌下，用0.lmol/L碳酸鉀調(diào)膠體金的pH值至8.2，按每毫升膠體金溶液中加入50 100 μ g抗體的標(biāo)準(zhǔn)向膠體金溶液中加入上述四環(huán)素類藥物單克隆抗體，繼續(xù)攪拌混勻lOmin，加入5%牛血清白蛋白(BSA)使其在膠體金溶液中的終濃度為1% (體積百分含量)，靜置lOmin。12000rpm，4°C離心60min，棄上清液，沉淀用復(fù)溶緩沖液洗滌兩次，用體積為初始膠體金體積1/10的復(fù)溶緩沖液將沉淀重懸，得到的四環(huán)素類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物溶液的濃度為50 μ g/mL,置4°C備用。復(fù)溶緩沖液:含牛血清白蛋白(BSA) 0.1 % 0.3 % (體積百分含量)、吐溫-800.05% 0.2% (質(zhì)量百分含量)、ρΗ7.2的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液。5.將四環(huán)素類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干到微孔試劑上向微孔試劑微孔板中加入100 μ I四環(huán)素類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，放入冷凍干燥機(jī)中，在冷阱溫度為-70°C條件下，預(yù)凍4h后，再凍干14h，即可取出，得到凍干有四環(huán)素類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑，將微孔試劑加上微孔塞。四環(huán)素類藥物單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干量0.20 0.25 μ g/mL。
6.樣品吸收墊的制備將樣品吸收墊置于含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在緩沖液中的終濃度為0.5%(體積百分含量))、pH7.2,0.lmol/L磷酸鹽緩沖液中浸泡2h，37°C烘2h備用。7.反應(yīng)膜的制備包被過程:用磷酸緩沖液將四環(huán)素半抗原-卵清白蛋白偶聯(lián)物稀釋到10mg/mL，用Biodot點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的檢測區(qū)(T)，包被量為l.0yg/cm2;用0.0lmol/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液將羊抗鼠IgG抗體稀釋到200 μ g/mL，用Biodot點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的質(zhì)控區(qū)(C)，包被量為l.0yg/cm2。將包被好的反應(yīng)膜置于37°C條件下干燥2h，備用。(二)各部件的組裝1.試紙的組裝將所述樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊、保護(hù)膜依次按順序粘貼在所述底板上；樣品吸收墊的末端與反應(yīng)膜的始端相連，反應(yīng)膜的末端與吸水墊的始端相連，樣品吸收墊的始端與底板的始端對齊，吸水墊的末端與底板的末端對齊；在組裝好的試紙的樣品吸收墊上粘貼保護(hù)膜，保護(hù)膜上印有MAX標(biāo)記線。2.試劑盒的組裝將上述步驟I得到的試紙、微孔試劑組裝成試劑盒，在2 8°C的環(huán)境中貯存，有效期12個(gè)月。實(shí)施例3牛奶樣品中四環(huán)素類藥物的檢測1.用試劑盒檢測從原包裝中取出試劑桶(若低溫存放需要預(yù)先平衡至室溫)，打開后取出所需數(shù)目的微孔試劑和試紙條，并做好標(biāo)記；吸取待檢牛奶樣品，用微量移液器移取200 μ I于微孔中，緩慢抽吸且充分與微孔中試劑混勻，室溫(20°c -25°C )孵育5min ;將標(biāo)記好的試紙條插入微孔中一印有“MAX”線端朝下，使之充分浸入溶液中；室溫(20°C -250C )孵育5min后,取出試紙條,判定結(jié)果。2.檢測結(jié)果分析(圖4)陽性:當(dāng)質(zhì)控區(qū)(C)顯示出條帶，檢測區(qū)(T)不顯示，判為陽性，用“ + ”表示，如圖4(a);陰性:當(dāng)質(zhì)控區(qū)(C)和檢測區(qū)⑴均顯示出條帶，判為陰性，用表示，如圖4(b)；無效:當(dāng)質(zhì)控區(qū)(C)不顯示條帶，試紙失效，如圖4(c)和(d)所示。實(shí)施例4試劑盒技術(shù)參數(shù)的確定1.靈敏度試驗(yàn)將四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、金霉素、土霉素標(biāo)準(zhǔn)品(購自Sigma公司)稀釋為以下濃度:四環(huán)素 0、20、40、80μ g/L，強(qiáng)力霉素 0、20、40、80μ g/L，金霉素 0、20、40、80μ g/L，土霉素 O、40,80,160 μ g/L ;所用稀釋液為pH7.2、0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液。用試劑盒進(jìn)行檢測，結(jié)果為:當(dāng)四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0、20μ g/L，強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0、20μ g/L,金霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0、20 μ g/L, 土霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0、40 μ g/L時(shí),試紙條上顯示出肉眼可見的兩條紅色條線，呈陰性；當(dāng)四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品濃度為40、80 μ g/L,強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度為40、80μ g/L,金霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度為40、80μ g/L, 土霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度為80、160μ g/L時(shí)，試紙條質(zhì)控區(qū)顯色，但檢測區(qū)不顯色，呈陽性，表明本試劑盒對四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、金霉素、土霉素檢測靈敏度分別為40 μ g/L、40 μ g/L、40 μ g/L、80 μ g/L ο2.假陽性率、假陰性率試驗(yàn)取已知四環(huán)素含量大于40 μ g/L的牛奶陽性樣品20份和四環(huán)素含量小于40 μ g/L的牛奶陰性樣品20份，用3個(gè)批次生產(chǎn)的試劑盒分別進(jìn)行檢測，計(jì)算其陰陽性率。結(jié)果見表1、表2。
權(quán)利要求
1.一種檢測四環(huán)素類藥物的試劑盒，其特征在于包括微孔試劑和試紙，所述試紙包括反應(yīng)膜、樣品吸收墊、吸水墊、保護(hù)膜、底板，所述反應(yīng)膜上有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，檢測區(qū)包被有四環(huán)素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控區(qū)包被有抗抗體，所述微孔試劑中凍干有四環(huán)素類藥物特異性抗體-膠體金標(biāo)記物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述試紙由樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊、保護(hù)膜依次粘貼在底板上組成，所述微孔試劑上具有微孔塞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述保護(hù)膜粘貼在樣品吸收墊上，為檢測端，上面有MAX標(biāo)記線。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述檢測區(qū)位于靠近有MAX標(biāo)記的保護(hù)膜的一端，所述質(zhì)控區(qū)位于遠(yuǎn)離有MAX標(biāo)記的保護(hù)膜的一端。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述四環(huán)素半抗原是通過四環(huán)素與4-哌啶甲酸利用曼尼希反應(yīng)，在四環(huán)素的酰胺的胺基上引入了 N-甲基-4-哌啶甲酸基團(tuán)所得到的衍生物。其分子結(jié)構(gòu)如下:
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述四環(huán)素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物由四環(huán)素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清白蛋白、血藍(lán)蛋白、甲狀腺蛋白、人血清白蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述四環(huán)素藥物特異性抗體-膠體金標(biāo)記物中的四環(huán)素藥物特異性抗體是以四環(huán)素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原制備獲得，所述四環(huán)素類藥物特異性抗體可為四環(huán)素類藥物單克隆抗體或四環(huán)素類藥物多克隆抗體。
8.一種制備權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述試劑盒的方法，其包括步驟: 1)制備凍干有四環(huán)素類藥物特異性抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑，將微孔試劑加上微孔塞； 2)制備具有包被四環(huán)素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測區(qū)和包被抗抗體的質(zhì)控區(qū)的反應(yīng)膜； 3)將2)制備好的反應(yīng)膜與樣品吸收墊、吸水墊、保護(hù)膜、底板組裝成試紙； 4)將I)和3)制備好的凍干有四環(huán)素類藥物特異性抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑和試紙組裝成試劑盒。
9.一種檢測牛奶樣品中四環(huán)素類藥物殘留的方法，其包括步驟: 1)用權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的試劑盒進(jìn)行檢測； 2)分析檢測結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測四環(huán)素類藥物的試劑盒及方法。試劑盒包括微孔試劑和試紙，所述微孔試劑中凍干有膠體金標(biāo)記的四環(huán)素類藥物特異性抗體，所述四環(huán)素類藥物特異性抗體可為四環(huán)素類藥物單克隆抗體或四環(huán)素類藥物多克隆抗體；所述試紙由樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊、保護(hù)膜、底板依次連接組成，所述反應(yīng)膜上包括檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，檢測區(qū)包被有四環(huán)半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控區(qū)包被有抗抗體。用本發(fā)明試劑盒檢測四環(huán)素類藥物的方法簡單、快速、直觀、準(zhǔn)確、適用范圍廣、成本低、易推廣使用。
文檔編號G01N33/558GK103105490SQ201110356478
公開日2013年5月15日 申請日期2011年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月11日
發(fā)明者萬宇平, 馮才偉, 孫震, 馮靜, 馮月君, 余厚美, 羅曉琴, 劉福林, 劉琳, 張荃 申請人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司