一種陰道炎病原體基因即時檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種陰道炎病原體基因即時檢測試劑盒,特別涉及一種不依賴于高能 能量分子的恒溫擴增技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 陰道炎是婦產(chǎn)科患者最常見疾病,每年約有500~1000萬女性罹患此病,而75%的婦 女在一生中至少患病1次。傳統(tǒng)的陰道炎診斷方法主要依賴于患者主訴、陰道檢查以及實驗 室檢查。陰道炎的癥狀缺乏特異性,因此在缺乏實驗室確診依據(jù)時,依據(jù)患者主訴和其他檢 查難以確診。多數(shù)陰道炎患者即使反復感染,依然無法確認發(fā)病原因,且陰道炎患者多為混 合感染,因此陰道炎的確診十分困難。陰道炎最常見類型為細菌性陰道炎、真菌性陰道炎和 滴蟲性陰道炎,三者約占所有陰道炎的80%~90%。細菌性陰道炎(BV)是一種由陰道加特納菌 和一些壓氧菌的混合感染,導致陰道內(nèi)微生態(tài)平衡失調(diào),引起的陰道分泌物增多,白帶有魚 腥臭味及外陰瘙癢灼熱的綜合征??煞譃槭妊獥U菌性陰道炎、棒狀桿菌陰道炎、壓氧菌性陰 道病炎、加特納菌性陰道炎等。本病也可通過性接觸傳染,在性關(guān)系混亂的人群中發(fā)病率較 高。念珠菌性陰道炎也稱霉菌性陰道炎,是由念珠菌感染引起。其發(fā)病率僅次于細菌性陰道 病。念珠菌性陰道炎多見于幼女、孕婦、糖尿病患者,以及絕經(jīng)后曾用較大劑量雌激素治療 的患者。滴蟲性陰道炎是由毛滴蟲引起,寄生人體的毛滴蟲有陰道毛滴蟲、人毛滴蟲和口腔 毛滴蟲,分別寄生于泌尿生殖系統(tǒng)、腸道和口腔,與皮膚病有關(guān)的是陰道毛滴蟲,引起滴蟲 性陰道炎。
[0003]長期陰道炎可能導致不孕;影響日常生活的質(zhì)量;會影響到胎兒的發(fā)育,導致早產(chǎn) 或者流產(chǎn);誘發(fā)其他疾病,如生殖器感染,盆腔炎、子宮內(nèi)膜炎、夫妻生活痛等;所以及時檢 測及定期檢測陰道炎致病病原體具有預防和治療的積極意義?;诓≡wDNA直接進行檢 測,相比涂片敏感性大大提尚,可以極大提升陽性檢出率。
[0004]陰道炎致病病原體DNA的檢測常用到傳統(tǒng)PCR技術(shù),檢測程序需要設(shè)置多個循環(huán), 每個循環(huán)包括核酸的變性、退火、延伸,這導致PCR在技術(shù)應用上有幾點限制:第一,PCR技 術(shù)需要昂貴的實驗室儀器,同時儀器要具備精細的溫度控制程序和加熱模板,從而實現(xiàn)很 高的溫度下的DNA模板鏈的變性,較低的溫度下引物探針退火延伸模板,這樣重復溫度變 化幾十個循環(huán)之后實現(xiàn)模板量的放大。由于每一個循環(huán)時間都較短,儀器必須能快速準確 升降溫度,這就需要銀制或金制的加熱模塊,增加了儀器研制的成本。第二,PCR擴增體系 中的聚合酶必須具有耐受高溫的能力,否則必須在每一個循環(huán)中重新加入新酶,以實現(xiàn)下 一循環(huán)的擴增,這樣極容易造成污染也加大了成本。第三,在PCR循環(huán)中,每一個循環(huán)引物 退火的時間都很短(幾秒到十幾秒)這就要求引物必須快速找到模板上同源匹配的區(qū)段,以 實現(xiàn)延伸。這就要求PCR體系必須有過量的PCR引物。過量的引物會與模板錯配,錯誤引 發(fā)擴增,引物二聚體等等,進而抑制PCR擴增,特別是在模板量低的情況,會使這種情況加 劇。
[0005]本發(fā)明恒溫擴增技術(shù)主要利用重組酶的活性,不進行核酸解鏈和退火即可在恒溫 條件下(如37°C)進行核酸的擴增,與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比,因此不需要昂貴的儀器,也避免 了高溫對酶的損耗。同時恒溫擴增技術(shù)在體系中不需要加入過量的引物,降低了引物與模 板錯配或生成引物二聚體的可能性。另外,恒溫擴增體系有多重工具酶匹配進行有效擴增, 擴增效率遠遠高于傳統(tǒng)PCR技術(shù),所用時間更短,最短可以在5min內(nèi)實現(xiàn)。最后,相對于目前 其他恒溫擴增技術(shù)平臺相比,本發(fā)明所用的重組酶依賴擴增技術(shù)平臺是新一代核酸檢測的 利器,在檢測的時效性,便捷性和技術(shù)參數(shù)等多個方面都優(yōu)于其它恒溫擴增技術(shù)平臺,通過 試劑的有效匹配,甚至可以在人體腋下進行擴增反應。在該技術(shù)平臺上,除了可以開發(fā)基于 小型便攜式設(shè)備用于醫(yī)療檢測機構(gòu)如醫(yī)院急診科、婦產(chǎn)科、手術(shù)室;社區(qū)服務(wù)中心和基層醫(yī) 療機構(gòu);檢驗檢疫疾病防控機構(gòu)的分子診斷產(chǎn)品,還可以開發(fā)出適合家庭使用的分子診斷 產(chǎn)品,使我國不同區(qū)域即便存在經(jīng)濟條件參差不齊的情況下,也可以展開全國性病毒性疾 病、腫瘤和遺傳性疾病的定期和快速普查。這是一個非常巨大的潛在市場,其經(jīng)濟價值和社 會效益不可估量。當前我們已經(jīng)開發(fā)適用于醫(yī)療機構(gòu)和家庭使用的HIV檢測產(chǎn)品和宮頸癌 HPV檢測產(chǎn)品。隨著平臺的不斷成熟,可進一步拓展到食品安全、檢驗檢疫、防恐等多個領(lǐng) 域。
[0006] 本發(fā)明陰道炎病原體基因即時檢測試劑盒將恒溫擴增技術(shù)應用到陰道炎病原微 生物的檢測上,縮短了反應時間,降低了體系對反應條件的要求,大大地提高了檢測的效 率,也不需要人為主觀判讀結(jié)果,同時檢測結(jié)果不受混合感染的干擾,因此能更準確的提示 混合感染的類型,非常有利于臨床的快速診斷和對癥治療。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種陰道炎病原體基因即時檢測試劑盒,包括反應液,啟 動液,反應酶系,陰道炎病原體特異性引物及探針。
[0008] 陰道炎病原體基因即時檢測試劑盒反應液的具體組分如下:
作為上述反應液的進一步改進,Tris-HCl的pH為7.0~9.0,優(yōu)選pH為8.3。
[0009] 陰道炎病原體基因即時檢測試劑盒啟動液的具體組分如下:
作為上述啟動液的進一步改進,氯化鎂的優(yōu)選濃度為10mM。
[0010] 陰道炎病原體基因即時檢測試劑盒反應酶系的具體組分如下:
作為上述反應酶系的進一步改進,重組酶選自E.coliRecT蛋白;λ·菌體β蛋白;啤酒 酵母SepI/STPi3;啤酒酵母DPA蛋白;啤酒酵母STPa蛋白;粟酒裂殖酵母ρ14()/ΕΧ〇II蛋白以及 RrpI、HPP-I、v-SEP、ICP8蛋白。
[0011] 陰道炎病原體基因即時檢測試劑盒特異性引物及探針序列如下:
作為本發(fā)明方法的進一步改進,恒溫擴增的溫度為35~42°C,優(yōu)選擴增溫度為37°C。
[0012] 本發(fā)明的有益效果: 本發(fā)明的恒溫擴增體系,不依賴于ATP、磷酸肌酸等高能能量分子,相對現(xiàn)有的恒溫擴 增體系,其組成更為簡單,成本更為低廉,使用更為方便。
[0013]本發(fā)明的恒溫擴增體系適用于復雜模板的擴增,擴增速度快且穩(wěn)定,可以在15 min以內(nèi)完成擴增反應,擴增的靈敏度和準確性高,不易出現(xiàn)錯配,擴增效果好。
[0014]本發(fā)明的恒溫擴增體系使用熒光實時定量技術(shù),應用范圍更廣,適用于市面上大 多數(shù)熒光定量擴增儀。
[0015]本發(fā)明同時檢測3種陰道炎常見的致病病原體,其中念珠菌屬檢測包括6種常見致 病念珠菌種:白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌、乳酒念珠 菌。對比常規(guī)檢測的培養(yǎng)方法,時間更短,靈敏度高受培養(yǎng)條件限制少,人為誤操作幾率低。 [00 16]【附圖說明】: 圖1至圖9依次分別為實施例1至實施例9的熒光結(jié)果圖,圖中熒光曲線的標號對應實施 例中反應管的標號。
[0017]
【具體實施方式】
[0018] -種陰道炎病原體基因即時檢測試劑盒,采用了一種不依賴于高能能量分子的恒 溫擴增技術(shù)。試劑盒成分包括反應液,啟動液,反應酶系,陰道炎病原體特異性引物及探針, 各成分的具體組分如下:
下面結(jié)合具體的實驗,進一步說明陰道炎病原體基因即時檢測試劑盒的優(yōu)勢,但并非 限制本發(fā)明。
[0019] 實驗樣本來源: 以陰道炎患者陰道分泌物中分離的陰道滴蟲、陰道加德納菌、白色念珠菌、光滑念珠 菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌、乳酒念珠菌經(jīng)提取得到的核酸溶液作為樣本; 以混合感染陰道滴蟲-陰道加德納菌、陰道滴蟲-白色念珠菌、陰道加德納菌-白色念珠 菌的患者陰道分泌物提取得到的核酸溶液作為混合感染樣本; 以外購金黃色葡萄球菌、卷曲乳桿菌、詹式乳桿菌、惰性乳桿菌、支原體菌株經(jīng)提取得 到的核酸溶液作為特異性實驗的樣本; 以正常人陰道分泌物提取物為陰性對照樣本。
[0020]實施例1(8種陰道炎常見的致病病原體的檢測): 取11個200ul反應管,分別標記為反應管1~11。在反應管1~11中分別加入20ul反應液、 5ul反應酶系;在反應管1、2中加入上游引物1(200ηΜ)、下游引物1(200ηΜ)、熒光探針1 (150nM);在反應管3、4中加入上游引物2(200nM)、下游引物2(200nM)、熒光探針2(150nM); 在反應管5~11中加入上游引物3 (200nM)、下游引物3 (200nM)、熒光探針3 (150nM)。在反應管 1中加入陰道滴蟲樣本2ul,反應管3中加入陰道加德納菌樣本2ul、反應管5~10分別加入白 色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌、乳酒念珠菌樣本2ul,反應 管2,、4、11都分別加入陰性對照樣本2ul。各反應管均用滅菌水補足體系到45ul,振蕩混勻 后各管再分別加入5ul啟動液(各管的終體積為50ul)。
[0021]選擇熒光定量PCR儀進行擴增及收集熒光,具體上機條件為:37°C,30s,30個循環(huán), 每個循環(huán)都搜集熒光。
[0022] 實施例2(非最優(yōu)擴增溫度條件的檢測): 同實施例1,不同處在于上機條件改為:35°C,30s,30個循環(huán),每個循環(huán)都收集熒光。結(jié) 果如圖2。
[0023] 實施例3(非最優(yōu)擴增溫度條件的檢測): 同實施例1,不同處在于上機條件改為:42°C,30s,30個循環(huán),每個循環(huán)都收集熒光。結(jié) 果如圖3。
[0024] 實施例4(特異性實驗): 按照實施例1配