用于檢測神經(jīng)母細(xì)胞瘤微小殘留的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型公開了一種用于檢測神經(jīng)母細(xì)胞瘤微小殘留的試劑盒，包括盒體、盒蓋和設(shè)置在盒體內(nèi)的襯墊，所述襯墊上設(shè)有小孔，裝有熒光標(biāo)記的單克隆抗體CD45的試劑管、裝有熒光標(biāo)記的單克隆抗體CD9的試劑管、裝有熒光標(biāo)記的單克隆抗體CD81的試劑管、裝有熒光標(biāo)記的單克隆抗體CD56的試劑管、裝有紅細(xì)胞裂解液的試劑管和裝有PBS緩沖液的試劑管被設(shè)置在所述小孔內(nèi)。該試劑盒結(jié)構(gòu)簡單、設(shè)計(jì)合理，在使用時(shí)檢測速度快、操作方法簡單，檢測靈敏度高，適于在臨床廣泛推廣應(yīng)用。
【專利說明】用于檢測神經(jīng)母細(xì)胞瘤微小殘留的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種用于檢測神經(jīng)母細(xì)胞瘤微小殘留的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma, NB)是兒童最常見的頡外腫瘤，是嬰幼兒最常見的腫瘤。有將近一半的神經(jīng)母細(xì)胞瘤發(fā)生在2歲以內(nèi)的嬰幼兒。神經(jīng)母細(xì)胞瘤屬于神經(jīng)內(nèi)分泌性腫瘤，可以起源于交感神經(jīng)系統(tǒng)的任意神經(jīng)脊部位。其最常見的發(fā)生部位是腎上腺，但也可以發(fā)生在頸部、胸部、腹部以及盆腔的神經(jīng)組織。對(duì)于神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)病原因尚不清楚。一些遺傳易感因素被發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)病相關(guān)。家族型神經(jīng)母細(xì)胞瘤被證明與間變淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)的體細(xì)胞突變(somaticmutation)所導(dǎo)致。此外,在神經(jīng)母細(xì)胞瘤還發(fā)現(xiàn)有許多分子突變。N_myc基因的擴(kuò)增突變?cè)谏窠?jīng)母細(xì)胞瘤也很常見。其擴(kuò)增類型呈雙向分布:在一個(gè)極端為3-10倍擴(kuò)增，在另一個(gè)極端為100-300倍擴(kuò)增。N-myc基因的擴(kuò)增突變往往與腫瘤的擴(kuò)散相關(guān)。LMOl基因被證明與腫瘤的惡性程度相關(guān)。目前認(rèn)為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的病因是以上因素互相作用導(dǎo)致的。
[0003]目前，神經(jīng)母細(xì)胞瘤的診斷及檢測方法主要有影像學(xué)檢測法、骨髓形態(tài)學(xué)檢測法、檢測尿VMA/AVA，VMA及HVA、骨髓或組織活檢；這些診斷、檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)如下:
[0004]影像學(xué)檢測法:間位腆代芐胍與放射性物質(zhì)如碘-131或者是碘-123耦聯(lián)后，即可作為放射性藥物而用于神經(jīng)母細(xì)胞瘤的診斷以及療效監(jiān)測。但不能判斷腫瘤病理類型，而且碘-131、碘-123耦聯(lián)有放射性對(duì)身體有害。
[0005]骨髓形態(tài)學(xué)檢測法:能見到密集成巢或小葉性分布，成菊花狀、環(huán)狀，其細(xì)胞成分不一，分化程度不等，但單個(gè)彌散分布的NB細(xì)胞體積形態(tài)與急淋、急粒細(xì)胞相似，不仔細(xì)觀察極易誤診。而且通常只看200-500個(gè)細(xì)胞，檢測靈敏度低。
[0006]檢測尿VMA/AVA，VMA及HVA:神經(jīng)母細(xì)胞瘤時(shí)兒茶酚胺合成增加，故其代謝物尿VMA/HVA增加。可用分光光度法、層析法檢測，但尿液中有大量的化合物，尤其是苯酣類、酸性酣和芳香環(huán)化合物的代謝物。能干擾結(jié)果，而且分光光度法特異性較差。
[0007]骨髓或組織活檢:免疫組化學(xué)檢查顯微鏡下，神經(jīng)母細(xì)胞瘤呈現(xiàn)為藍(lán)染的小圓形細(xì)胞，菊花形排列。腫瘤細(xì)胞圍繞神經(jīng)氈(neuropil)呈菊花形排列，其他還有一些神經(jīng)母細(xì)胞瘤所特異的免疫組化染色，用以與其他腫瘤(尤因肉瘤，淋巴瘤等)進(jìn)行鑒別診斷。但操作復(fù)雜，對(duì)患者損傷較大。
[0008]臨床急需一種檢測速度快，而且靈敏度高的檢測技術(shù)的出現(xiàn)，更有利于患者的及時(shí)診治。
實(shí)用新型內(nèi)容
[0009]為了解決上述技術(shù)問題，本實(shí)用新型的目的在于提供一種用于檢測神經(jīng)母細(xì)胞瘤微小殘留的試劑盒，可以快速、簡便、高靈敏度地檢測神經(jīng)母細(xì)胞瘤微小殘留。[0010]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本實(shí)用新型采取的技術(shù)方案是:一種用于檢測神經(jīng)母細(xì)胞瘤微小殘留的試劑盒，包括盒體(I)、盒蓋(2)和設(shè)置在盒體(I)內(nèi)的襯墊(3)，所述襯墊(3)上設(shè)有小孔，裝有熒光標(biāo)記的單克隆抗體CD45的試劑管(4)、裝有熒光標(biāo)記的單克隆抗體CD9的試劑管(5)、裝有熒光標(biāo)記的單克隆抗體CD81的試劑管(6)、裝有熒光標(biāo)記的單克隆抗體CD56的試劑管(7)、裝有紅細(xì)胞裂解液的試劑管(8)和裝有PBS緩沖液的試劑管(9)被設(shè)置在所述小孔內(nèi)。
[0011]其中，上述單克隆抗體使用不同的熒光標(biāo)記；優(yōu)選地，單克隆抗體⑶45使用PerCP標(biāo)記，單克隆抗體CD9使用FITC標(biāo)記，單克隆抗體CD81使用PE標(biāo)記，單克隆抗體CD56使用APC標(biāo)記。
[0012]其中，所述紅細(xì)胞裂解液和所述PBS緩沖液均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑。
[0013]其中，所述襯墊(3)上設(shè)有6個(gè)小孔，所述小孔在所述襯墊(3)上分成兩排平行排列。
[0014]通過以上技術(shù)方案，本實(shí)用新型的有益效果如下:
[0015](I)本實(shí)用新型的試劑盒結(jié)構(gòu)簡單、設(shè)計(jì)合理，方便攜帶、保存，不易受污染。
[0016](2)本實(shí)用新型的試劑盒在使用時(shí)，檢測速度快、操作方法簡單，檢測靈敏度高，檢測中受檢測者主觀因素的影響小，特別是可以準(zhǔn)確檢測已經(jīng)確診并經(jīng)過治療之后殘留的神經(jīng)母細(xì)胞瘤病灶，適于在臨床廣泛推廣應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為本實(shí)用新型的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0018]在該圖中，1-盒體，2-盒蓋，3-襯墊，4-裝有熒光標(biāo)記的單克隆抗體⑶45的試劑管，5-裝有熒光標(biāo)記的單克隆抗體CD9的試劑管，6-裝有熒光標(biāo)記的單克隆抗體CD81的試劑管，7-裝有熒光標(biāo)記的單克隆抗體CD56的試劑管，8-裝有紅細(xì)胞裂解液的試劑管，9-裝有PBS緩沖液的試劑管。
[0019]圖2是是正常人⑶56、⑶9、⑶81表達(dá)情況的示意圖；
[0020]圖3是神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者治療之后⑶56、⑶9、⑶81表達(dá)情況的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步描述，本實(shí)用新型的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本實(shí)用新型的范圍構(gòu)成任何限制。
[0022]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0023]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0024]如圖1所示，本實(shí)用新型提供了一種用于檢測神經(jīng)母細(xì)胞瘤微小殘留的試劑盒，包括盒體1、盒蓋2和設(shè)置在盒體I內(nèi)的襯墊3，所述襯墊3上設(shè)有6個(gè)小孔，所述小孔在所述襯墊3上分成兩排平行排列,裝有熒光標(biāo)記的單克隆抗體CD45的試劑管4、裝有熒光標(biāo)記的單克隆抗體CD9的試劑管5、裝有熒光標(biāo)記的單克隆抗體CD81的試劑管6、裝有熒光標(biāo)記的單克隆抗體CD56的試劑管7、裝有紅細(xì)胞裂解液的試劑管8和裝有PBS緩沖液的試劑管9被設(shè)置在所述小孔內(nèi)。[0025]其中，單克隆抗體⑶45使用PerCP標(biāo)記，單克隆抗體⑶9使用FITC標(biāo)記，單克隆抗體⑶81使用PE標(biāo)記，單克隆抗體⑶56使用APC標(biāo)記；優(yōu)選的，上述熒光標(biāo)記的單克隆抗體均購自BD公司。
[0026]其中，所述紅細(xì)胞裂解液購自美國BD公司，所述PBS緩沖液購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。
[0027]檢測步驟如下:
[0028](I)取兩支流式專用管，分別編號(hào)為I號(hào)管和2號(hào)管，向I號(hào)管加入CD45-PerCP20 ii 1，向 2 號(hào)管加入 CD45_PerCP20 y 1、CD9-FITC20 y 1、CD81_PE20ii 1、CD56-APC5 uI ；
[0029](2)對(duì)待檢測的骨髓標(biāo)本進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)至3X107/ml，向每個(gè)管內(nèi)分別加入待檢測的骨髓標(biāo)本70iU，低速渦旋混勻，2°C至8°C避光孵育20分鐘；
[0030](3)向每個(gè)管內(nèi)分別加入紅細(xì)胞裂解液1ml，低速渦旋混勻，在2°C至8°C避光裂解紅細(xì)胞10分鐘；
[0031](4)裂解結(jié)束后立即以1500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，離心結(jié)束后棄上清，然后向各管內(nèi)加入Iml PBS，低速渦旋混勻，以1500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘；離心結(jié)束后棄上清，向各管內(nèi)加入0.5ml PBS重懸，低速渦旋混勻，24h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測；
[0032](5)在檢測時(shí)，調(diào)節(jié)好個(gè)通道電壓，使淋巴細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度在104，收集Pl門內(nèi)細(xì)胞100萬，應(yīng)用BD FACSDive軟件分析數(shù)據(jù)。
[0033]檢測結(jié)果如下:
[0034]數(shù)據(jù)以散點(diǎn)圖形式顯示，如出現(xiàn)成群⑶45陰性⑶56陽/強(qiáng)陽的細(xì)胞群，表明有神經(jīng)母細(xì)胞殘留細(xì)胞。
[0035]如圖2和圖3所示，圖2是是正常人⑶56、CD9、CD81表達(dá)情況，未見CD45陰性⑶56陽/強(qiáng)陽的細(xì)胞，圖3是神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者治療之后⑶56、⑶9、⑶81表達(dá)情況，見大量CD45陰性CD56陽/強(qiáng)陽的細(xì)胞。
[0036]上面已經(jīng)舉例說明了本實(shí)用新型的實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本實(shí)用新型的精神和范圍下可以對(duì)本實(shí)用新型技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本實(shí)用新型的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測神經(jīng)母細(xì)胞瘤微小殘留的試劑盒，其特征在于:包括盒體(I)、盒蓋(2)和設(shè)置在盒體(I)內(nèi)的襯墊(3)，所述襯墊(3)上設(shè)有小孔，裝有熒光標(biāo)記的單克隆抗體CD45的試劑管(4)、裝有熒光標(biāo)記的單克隆抗體CD9的試劑管(5)、裝有熒光標(biāo)記的單克隆抗體CD81的試劑管(6)、裝有熒光標(biāo)記的單克隆抗體CD56的試劑管(7)、裝有紅細(xì)胞裂解液的試劑管(8)和裝有PBS緩沖液的試劑管(9)被設(shè)置在所述小孔內(nèi)。
2.按照權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述單克隆抗體使用不同的熒光標(biāo)記，其中，單克隆抗體CD45使用PerCP標(biāo)記，單克隆抗體CD9使用FITC標(biāo)記，單克隆抗體CD81使用PE標(biāo)記，單克隆抗體⑶56使用APC標(biāo)記。
3.按照權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述襯墊(3)上設(shè)有6個(gè)小孔，所述小孔在所述襯墊(3 )上分成兩排平行排列。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK203535054SQ201320688913
【公開日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月4日
【發(fā)明者】王顯鳳, 秦曉明, 吳純斌, 劉麗媛, 王緒華, 梁超, 方國偉, 黃士昂, 陳忠 申請(qǐng)人:北京海思特臨床檢驗(yàn)所有限公司