Pik3ca基因突變檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因突變檢測。具體地說，本發(fā)明涉及PIK3CA基因突變檢測試劑盒， 該試劑盒可用于檢測與癌癥有關(guān)的PIK3CA基因突變。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤在中國發(fā)病率近年來呈逐年上升趨勢，每年新增患者達(dá)170萬人以 上。肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，死亡率居各類惡性腫瘤之首，其中非小細(xì)胞肺癌 (Non-small cell lung cancer，NSCLC)的發(fā)病率最高，約占全部肺癌的80%。結(jié)直腸癌是 消化道惡性腫瘤，發(fā)病率位于常見腫瘤的第四位。乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，我國每年 新發(fā)乳腺癌約18萬例。
[0003] 美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA)批準(zhǔn)將靶向人表皮生長因子受體（EGFR)酪氨酸 激酶的TKI類藥物吉非替尼（Gefitinib，商品名為易瑞沙，Iressa)和厄洛替尼（Erlotinib， 商品名為特羅凱，Tarceva)用于非小細(xì)胞肺癌的治療；將靶向人表皮生長因子受體（EGFR) 的藥物西妥昔單抗（Cetuximab，商品名為愛必妥，Erbitux)和帕尼單抗（Panitumumab，商 品名為維克替比，Vectibix)用于結(jié)直腸癌的治療；將靶向人表皮生長因子受體2(HER2)的 藥物曲妥珠單抗（Trastuzumab，商品名赫賽汀，Herceptin)用于乳腺癌的治療?；跉W美 國家腫瘤患者在靶向藥物選擇前進行基因檢測的理論和實踐已經(jīng)成熟，中國臨床治療指導(dǎo) 委員會也陸續(xù)將基因檢測加入關(guān)聯(lián)疾病的治療指南中。研究發(fā)現(xiàn)，PIK3CA基因9、20外顯 子突變與靶向EGFR或HER2的TKI類藥物、單抗類藥物耐藥有關(guān)；靶向攜帶突變的PIK3CA 的藥物也在研究當(dāng)中[1'2]。
[0004] IA類磷脂酰肌醇-3激酶的催化亞基（phosphatidylinositol-4， 5-bisphosphate3_kinase，catalyticsubunitalpha，PIK3CA)編碼I類憐脂醜肌醇-3-激 酶，定位于3q26,長34kb，包含20個外顯子，編碼1068種氨基酸，該組氨基酸產(chǎn)生一組長 124kD的蛋白。生理情況下，基因PIK3CA在正常腦、肺、乳腺、胃腸、宮頸、卵巢等組織中均 有表達(dá)，具有調(diào)控體細(xì)胞增殖、分化、存活等許多重要的生理功能，但多以非激活的形式存 在，通常不易檢測到，而其突變后基因及其蛋白均可過度表達(dá)，可被檢測到 [3]。研究表明， PIK3CA基因的突變不僅可以引起PI3Ks的催化活性增強，并且可促使細(xì)胞癌變[4]。目前， PIK3CA已被證實是一種癌基因，其突變包括基因的擴增、缺失和體細(xì)胞性的錯義突變等。研 究發(fā)現(xiàn)，約30%的人類實體腫瘤中存在癌基因PIK3CA的突變，其突變的比例在結(jié)腸癌、成 膠質(zhì)細(xì)胞瘤、胃癌、乳腺癌和肺癌中分別約為32 %、27 %、25 %、25 %和4 %，然而在膽道系 統(tǒng)的腫瘤和彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中，PIK3CA的突變則比較少見[5]。
[0005] PIK3CA的突變約4/5發(fā)生在9外顯子（E542K、E545D、E545K突變位點）和20外 顯子（H1047R、H1047L)這兩個熱點區(qū)域。其突變不僅可以減少細(xì)胞的凋亡，還可以促進腫 瘤的浸潤、提高其下游激酶PI3Ks的活性。關(guān)于PIK3CA突變這兩個熱點區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)，激 酶區(qū)和螺旋區(qū)的突變可能通過不同的機制引起酶功能性的改變。不同區(qū)域的突變，分別通 過與PI3Ks的調(diào)節(jié)亞單位p85和RAS-GTP相互作用的不同機制導(dǎo)致PI3Ks的活化[6]。
[0006] 另外，在對所有突變位點檢測的研究中發(fā)現(xiàn)包含有PIK3CA突變的細(xì)胞均具有高 的酶活性和轉(zhuǎn)化能力。這些結(jié)果都顯示具有PIK3CA突變的細(xì)胞其分子生物學(xué)功能和細(xì)胞 生物學(xué)特性都發(fā)生了改變，PIK3CA突變能夠通過上調(diào)PI3K的活性并進一步激活其下游分 子AKT等，進而對細(xì)胞的生存、增殖、粘附等過程進行調(diào)控。因而認(rèn)為，PIK3CA突變可能參 與調(diào)控細(xì)胞癌變的過程[7]。
[0007] 研究發(fā)現(xiàn)，攜帶PIK3CA突變可能導(dǎo)致肺癌患者對吉非替尼的耐藥M，導(dǎo)致乳腺癌 患者對曲妥珠單抗的耐藥 [9 11]，導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者對西妥昔單抗和帕尼單抗的耐藥[12 14]。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明針對以下檢測位點設(shè)計了檢測試劑盒：
[0009] 表1.突變檢測位點
[0010]
[0011] 具體地說，本發(fā)明涉及一種PIK3CA基因突變檢測試劑盒，其包含：
[0012] (1)內(nèi)參檢測試劑，其包含內(nèi)參基因特異性引物、內(nèi)參基因特異性探針及dNTP溶 液；
[0013] (2)PIK3CA突變檢測試劑，其包含PIK3CA基因突變型特異性引物、PIK3CA基因突 變型特異性探針、內(nèi)控基因特異性引物、內(nèi)控基因特異性探針及dNTP溶液；
[0014]⑶TaqDNA聚合酶；和
[0015] (4)PIK3CA陽性質(zhì)控品，其包含內(nèi)參基因、PIK3CA基因突變型及內(nèi)控基因片段。
[0016] 更具體地說，上述試劑盒中所述內(nèi)參檢測試劑中內(nèi)參基因特異性引物為SEQID NO:1和SEQIDNO:2;所述內(nèi)參檢測試劑中內(nèi)參基因特異性探針為SEQIDNO:14;所述 PIK3CA突變檢測試劑中的PIK3CA基因突變型選自：PM1，即PIK3CA基因9號外顯子1624G > A;PM2,即PIK3CA基因9號外顯子1633G>A;PM3,即PIK3CA基因9號外顯子1635G> T;PM4,即PIK3CA基因20號外顯子3140A>G;和PM5,即PIK3CA基因20號外顯子3140A > T。本發(fā)明的試劑盒可用于檢測PM1、PM2、PM3、PM4和PM5中的至少一種突變。
[0017] 所述PIK3CA突變檢測試劑中PIK3CA基因突變型特異性引物如下：針對PM1突變 的引物為SEQIDN0:5和SEQIDN0:8;針對PM2突變的引物為SEQIDN0:6和SEQID NO:8;針對PM3突變的引物為SEQIDNO:7和SEQIDNO:8;針對PM4突變的引物為SEQ IDNO:9 和SEQIDNO:11 ;針對PM5 突變的引物為SEQIDNO:10 和SEQIDNO:11 ;其中 所述PIK3CA突變檢測試劑中PIK3CA基因突變型特異性探針選自SEQIDN0:12或SEQID NO:13 ;所述PIK3CA突變檢測試劑中內(nèi)控基因特異性引物為SEQIDNO:3和SEQIDNO: 4 ;所述PIK3CA突變檢測試劑中內(nèi)控基因特異性探針為SEQIDNO:15 ;所述探針的5'端連 接FAM基團，3'端連接BHQ1基團；所述dNTP溶液的終濃度為400μΜ;所述內(nèi)參基因序列為 SEQIDΝο:16;所述內(nèi)控基因序列為SEQIDΝο:17;所述PIK3CA基因序列為SEQIDNo: 18 或SEQIDNo: 19。
[0018] 將本發(fā)明的試劑盒用于在肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌患者中進行PIK3CA基因突變檢 測，可準(zhǔn)確預(yù)測對應(yīng)靶向藥物（如吉非替尼、曲妥珠單抗、西妥昔單抗等）治療的有效性，便 于臨床用藥選擇，顯著提高治療效果，使患者最大程度受益；同時，還可以避免不合理用藥 造成的病人醫(yī)療費用負(fù)擔(dān)及社會醫(yī)療資源浪費，減少不必要的時效損失以及經(jīng)濟損失。
【附圖說明】
[0019] 圖1顯示PM1突變檢測的結(jié)果，其中野生型基因組DNA含量為20ng/l·! 1，突變型基 因組DNA含量為lOng/μ1，并且分別含10、5、1、0. 5%突變。
[0020] 圖2顯示PM2突變檢測的結(jié)果，其中野生型基因組DNA含量為20ng/l·! 1，突變型基 因組DNA含量為lOng/μ1，并且分別含10、5、1、0. 5%突變。
[0021] 圖3顯示PM3突變檢測的結(jié)果，其中野生型基因組DNA含量為20ng/l·! 1，突變型基 因組DNA含量為lOng/μ1，并且分別含10、5、1、0. 5%突變。
[0022] 圖4顯示PM4突變檢測的結(jié)果，其中野生型基因組DNA含量為20ng/l·! 1，突變型基 因組DNA含量為lOng/μ1，并且分別含10、5、1、0. 5%突變。
[0023] 圖5顯示PM5突變檢測的結(jié)果，其中野生型基因組DNA含量為20ng/l·! 1，突變型基 因組DNA含量為lOng/μ1，并且分別含10、5、1、0. 5%突變。
【具體實施方式】
[0024] 1.實驗方法
[0025] 米用實時突光PCR技術(shù)。通過ARMS(amplificationrefractorymutationsystem) 方法檢測基因突變。即采用引物3'端識別突變的方式，結(jié)合TaqMan探針?biāo)獍l(fā)光檢測基 因突變。
[0026] 試劑盒中含有內(nèi)參基因檢測，以及內(nèi)控基因檢測。內(nèi)參基因（Internal Reference，IR)是區(qū)別于待檢基因PIK3CA的管家基因。通過檢測內(nèi)參基因的擴增情況（FAM 通道），可分析待檢DNA是否能被正常擴增，從而排除DNA純度、濃度不佳，或者含有PCR抑 制劑等造成PCR檢測失敗的原因。本試劑盒在PIK3CA基因各突變類型檢測體系中同時設(shè)置 了內(nèi)控基因（InternalControl, 1C)檢測體系。兩種體系在同一PCR管中同時進行反應(yīng)。 內(nèi)控基因也是區(qū)別于待檢基因PIK3CA的管家基因。將識別PIK3CA基因突變模板的探針修 飾為FAM熒光基團，而將識別內(nèi)控基因模板的探針修飾為HEX熒光基團。通過檢測內(nèi)控基 因擴增情況（HEX通道），可分析待檢DNA是否能被正常擴增，從而排除漏加試劑或樣本、樣 本含有PCR抑制劑等造成PCR檢測失敗的原因。
[0027] 2.試劑盒組成（表2):
[0028]
[0029] 2. 1IR、PM1~5檢測試劑、TaqDNA聚合酶（表3):
[0030]
[0031] 2. 2陽性質(zhì)控品（PC):
[0032] 人工克隆至pMD18T