專利名稱：一種抗cd20單克隆抗體結(jié)合活性的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗CD20單克隆抗體結(jié)合活性的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，單克隆抗體及其導(dǎo)向治療非霍奇金氏淋巴瘤的臨床試驗(yàn)研究取得了重大進(jìn)展，其中被廣泛使用且富有成效的是抗⑶20的單克隆抗體制劑。美國(guó)Genentech和IDEC公司開發(fā)的抗⑶20單克隆抗體利妥昔單抗(Rituximab,商品名Rituxan)于1997年獲得FDA批準(zhǔn)上市，是第一個(gè)用于治療B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的單克隆抗體藥物。Rituxan為IgGl (kappa)嵌合性單抗,含有鼠抗人⑶20單抗重鏈和輕鏈的可變區(qū)，人IgGl (Kappa)重鏈、輕鏈的恒定區(qū)及人IgGl的Fe部分，能與細(xì)胞表面CD20分子高親和力結(jié)合，從而導(dǎo)致被結(jié)合的淋巴細(xì)胞的清除。由于其在非霍奇金淋巴瘤治療中表現(xiàn)出較好的療效和較低的毒副作用，已經(jīng)成為美國(guó)銷售額最大的抗腫瘤藥物之一。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抗CD20單克隆抗體與抗原的親和力提高時(shí)，抗體的特異性增強(qiáng)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果也會(huì)顯著提高。因此在抗CD20單克隆抗體的研制過(guò)程中，如何建立評(píng)價(jià)親和力強(qiáng)弱的結(jié)合活性檢測(cè)方法用于篩選出高親和力的抗⑶20單抗顯得非常重要，這在抗CD20單克隆抗體的研究開發(fā)，質(zhì)量控制乃至臨床應(yīng)用中都具有重要的意義。從目前文獻(xiàn)報(bào)道看，檢測(cè)抗CD20單克隆抗體結(jié)合活性的方法主要有兩種1、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)，主要將高表達(dá)⑶20的細(xì)胞直接包被，經(jīng)固定后，進(jìn)行ELISA檢測(cè)。這種方法缺點(diǎn)是操作過(guò)程復(fù)雜、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，而且CD20膜蛋白比較容易受到細(xì)胞固定液的破壞，導(dǎo)致抗原與抗體的結(jié)合力降低，不能真實(shí)反映抗原抗體的結(jié)合活性，只能簡(jiǎn)單地鑒別陰、陽(yáng)性結(jié)果。2、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法一種是競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合檢測(cè)法，采用熒光標(biāo)記的抗CD20單抗與待測(cè)樣品競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合細(xì)胞表面的CD20，由標(biāo)記抗體的熒光強(qiáng)度來(lái)判斷待測(cè)樣品與抗原的親和力。這種方法缺點(diǎn)是①、熒光標(biāo)記效率難以標(biāo)準(zhǔn)化，如果標(biāo)記不完全，易導(dǎo)致未標(biāo)記上的抗CD20單抗與待測(cè)樣品一起與標(biāo)記上熒光的抗CD20單抗競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合細(xì)胞表面抗原，不能真實(shí)反應(yīng)抗原抗體結(jié)合效率；②、該方法是一種競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)，只能反映待測(cè)樣品與參考品的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合細(xì)胞表面CD20能力的強(qiáng)弱，而且該方法在穩(wěn)定性，重復(fù)性，可靠性方面也缺乏系統(tǒng)性的研究，不能真實(shí)地對(duì)待測(cè)樣品的結(jié)合活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。另一種是間接檢測(cè)法，雖然也采用商品化突光標(biāo)記的FITC ant1-Human IgG進(jìn)行檢測(cè),但是方法尚未標(biāo)準(zhǔn)化,多用于研發(fā)階段的單抗篩選，即鑒別陰、陽(yáng)性結(jié)果，缺乏對(duì)方法進(jìn)行專屬性，準(zhǔn)確性，重復(fù)性等方面的相關(guān)評(píng)價(jià)，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)也存在不同，難以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的方法中存在的上述不足，提供了一種能夠快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高效地進(jìn)行抗CD20單克隆抗體藥物篩選和結(jié)合活性分析的檢測(cè)方法，該方法能夠滿足方法驗(yàn)證過(guò)程中對(duì)專屬性，精密度包括重復(fù)性，日間差，人員操作誤差，線性和范圍，準(zhǔn)確性以及耐用性等方面的要求，對(duì)于抗CD20單克隆抗體的研究開發(fā)，質(zhì)量控制乃至臨床應(yīng)用都具有重要的意義。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種抗⑶20單克隆抗體結(jié)合活性的檢測(cè)方法，包括下列步驟a細(xì)胞培養(yǎng)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期高表達(dá)CD20的細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞密度及活率，調(diào)整至0. 5-2. OX IO6個(gè)/ml活細(xì)胞密度，加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，陰性對(duì)照孔以加入完全培養(yǎng)基；b參考品及待測(cè)樣品稀釋取參考品及待測(cè)樣品，根據(jù)標(biāo)示濃度，用完全培養(yǎng)基先稀釋至預(yù)稀釋濃度，再進(jìn)行系列梯度稀釋，得到11個(gè)稀釋度；C加樣將稀釋好的系列梯度濃度的參考品及待測(cè)樣品以500 U I/孔依次加入已鋪好細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板中，陰性對(duì)照孔加入完全培養(yǎng)基。完成后將細(xì)胞培養(yǎng)板放置于37°C，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育0. 5-lh ；d收獲細(xì)胞收獲細(xì)胞至離心管內(nèi)，用Iml預(yù)冷的洗液洗滌細(xì)胞I次，2000r/min離心5分鐘，棄上清液，收集細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于100 ill預(yù)冷的洗液中；e染色加入FITC標(biāo)記的Mouse ant1-Human IgG, 10 ii I/孔,4°C避光冰浴孵育
0.5-lh ；f洗滌用Iml預(yù)冷的洗液洗滌細(xì)胞2次，2000r/min離心5分鐘，棄上清液，收集細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于Iml預(yù)冷的洗液中；g流式細(xì)胞儀測(cè)定將細(xì)胞轉(zhuǎn)入流式管，以陰性對(duì)照細(xì)胞設(shè)置陰性門和陽(yáng)性門的分界線，記錄各管細(xì)胞的平均突光強(qiáng)度(Mean Channel Fluorescence, MCF);以LogC-MCF進(jìn)行曲線擬合，得出參考品和待測(cè)樣品的EC5tl值，計(jì)算兩者EC5tl值的比值得出待測(cè)樣品相對(duì)參考品的結(jié)合活性。本發(fā)明采用的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期高表達(dá)⑶20的細(xì)胞為人Burkitt' s淋巴瘤細(xì)胞Raji細(xì)胞。本發(fā)明采用的完全培養(yǎng)基是RPMI1640完全培養(yǎng)基，即在RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加10% FBS和1%雙抗(鏈霉素與青霉素)。更進(jìn)一步的，在實(shí)施步驟b中，所述參考品和待測(cè)樣品合適的預(yù)稀釋濃度是10-20 u g/ml。所述參考品和待測(cè)樣品為抗人⑶20單克隆抗體。更進(jìn)一步的，在實(shí)施步驟b中，所述參考品和待測(cè)樣品的系列梯度稀釋是2倍系列梯度稀釋。更進(jìn)一步的，在實(shí)施步驟d、f中，所述洗液是含1% FBS的PBS溶液。本發(fā)明細(xì)胞與待測(cè)單抗若不在24孔板內(nèi)培養(yǎng)，改成在流式管或者EP管中進(jìn)行抗原抗體孵育，缺點(diǎn)細(xì)胞容易沉降，堆積在管底，這樣就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞表面抗原與待測(cè)抗體的結(jié)合不充分，而在24孔中，板底面積大，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的細(xì)胞密度，正好鋪滿24孔板底面積的80%左右，而且細(xì)胞能夠均勻分散，這樣就有利于抗⑶20單抗到達(dá)細(xì)胞表面的⑶20表位，細(xì)胞表面的抗原與待測(cè)抗體可以充分結(jié)合。該方法專屬性好，特異性強(qiáng)；精密度高，重復(fù)性，日間差以及人員操作誤差RSD均小于10%，根據(jù)線性、精密度以及準(zhǔn)確度的驗(yàn)證結(jié)果，可知測(cè)定范圍為80% 120%。參考品和待測(cè)樣品的曲線擬合常數(shù)R2均大于0.95。因此，采用本發(fā)明的方法能夠快速，準(zhǔn)確，高效的進(jìn)行抗CD20單克隆抗體結(jié)合活性分析，這對(duì)于抗CD20單克隆抗體的研究開發(fā)，質(zhì)量控制乃至臨床應(yīng)用都具有重要的意義。


圖1 :流式熒光直方圖疊加圖，其中Plotl為陰性對(duì)照細(xì)胞，Plot 2為抗⑶20單抗與Raji細(xì)胞表面的CD20產(chǎn)生特異性結(jié)合的陽(yáng)性細(xì)胞；圖2 :參考品和同型對(duì)照Human IgGl的結(jié)合活性曲線擬合圖；圖3 :參考品和待測(cè)樣品的結(jié)合活性曲線擬合圖；圖4 :抗CD20單克隆抗體結(jié)合活性方法驗(yàn)證(線性和范圍)_線性擬合圖；圖5 -M⑶20單克隆抗體結(jié)合活性ELISA檢測(cè)法4參數(shù)擬合圖；圖6 :參考品結(jié)合活性曲線擬合圖-不同樣品稀釋濃度范圍。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。下列實(shí)施例涉及到的材料和試劑，實(shí)驗(yàn)條件和方法如下I材料和試劑材料參考品Rituxan (Biogen-1DEC公司產(chǎn)品，批號(hào):B6027)，待測(cè)樣品(抗人0)20單克隆抗體，嘉和生物藥業(yè)有限公司制備)，Human IgGl Remicade (Johnson&Johnson公司產(chǎn)品)。試劑RPMI1640培養(yǎng)基粉末(購(gòu)于GIBC0，Cat. No. 31800-022)，鏈霉素/青霉素雙抗(購(gòu)于 GIBC0, Cat. No. 15070-063)，F(xiàn)BS (購(gòu)于 GIBC0, Cat. No. 10099-141)，F(xiàn)ITC Mouseant1-Human IgG (購(gòu)于 BD 公司，Cat. No. 555786)。細(xì)胞株Raji細(xì)胞株(購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，目錄號(hào)TCHu 44)。2抗⑶20單克隆抗體結(jié)合活性檢測(cè)過(guò)程I)細(xì)胞鋪板取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raji細(xì)胞，用RPMI1640完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，并計(jì)算細(xì)胞密度及活率，調(diào)整活細(xì)胞密度至0. 5-2. 0 X IO6個(gè)/ml，以500 ii I/孔加A 24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，陰性對(duì)照孔以500 u I/孔加入完全培養(yǎng)基。2)參考品及待測(cè)樣品稀釋取參考品及待測(cè)樣品，根據(jù)標(biāo)不濃度，用RPMI1640完全培養(yǎng)基預(yù)稀釋至10-20 y g/ml，再進(jìn)行2倍系列梯度稀釋，得到11個(gè)稀釋度。3)加樣將稀釋好的系列梯度濃度的參考品及待測(cè)樣品以500 Ul/孔依次加入鋪好細(xì)胞的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，陰性對(duì)照孔以500 u I/孔加入完全培養(yǎng)基。完成后將細(xì)胞培養(yǎng)板放置于37°C, 5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育0. 5-lh。4)收獲細(xì)胞收獲細(xì)胞至無(wú)菌的1. 5ml EP管，用Iml預(yù)冷的洗液洗滌細(xì)胞I次，2000r/min離心5分鐘，棄上清液，收集細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于100 U I預(yù)冷的洗液中。
5)染色加入FITC標(biāo)記的Mouse ant1-Human IgG, 10 U I/孔，4°C避光冰浴孵育0.5-lh。6)洗滌用Iml預(yù)冷的洗液洗滌細(xì)胞2次，2000r/min離心5分鐘，棄上清液，收集細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于Iml預(yù)冷的洗液中。7)流式細(xì)胞儀測(cè)定將細(xì)胞轉(zhuǎn)入流式管中，以陰性對(duì)照細(xì)胞設(shè)置陰性門和陽(yáng)性門的分界線，記錄各管細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。8)結(jié)果分析以LogC-MCF進(jìn)行曲線擬合，得出參考品和待測(cè)樣品的EC5tl值，曲線
擬合常數(shù)R2，按照下列公式計(jì)算待測(cè)樣品的結(jié)合活性
權(quán)利要求
1.ー種抗CD20單克隆抗體結(jié)合活性的檢測(cè)方法，包括下列步驟 a細(xì)胞培養(yǎng)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期高表達(dá)CD20的細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞密度及活率，調(diào)整至0. 5-2. OX IO6個(gè)/ml活細(xì)胞密度，加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，陰性對(duì)照孔以加入完全培養(yǎng)基； b參考品及待測(cè)樣品稀釋取參考品及待測(cè)樣品，根據(jù)標(biāo)示濃度，用完全培養(yǎng)基先稀釋至預(yù)稀釋濃度，再進(jìn)行系列梯度稀釋，得到11個(gè)稀釋度； c加樣將稀釋好的系列梯度濃度的參考品及待測(cè)樣品以500 Ul/孔依次加入已鋪好細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板中，陰性對(duì)照孔加入完全培養(yǎng)基；完成后將細(xì)胞培養(yǎng)板放置于37°C，5%ニ氧化碳培養(yǎng)箱中孵育0. 5-lh ； d收獲細(xì)胞收獲細(xì)胞至離心管內(nèi)，用Iml預(yù)冷的洗液洗滌細(xì)胞I次，2000r/min離心5分鐘，棄上清液，收集細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于100 ill預(yù)冷的洗液中； e染色加入FITC標(biāo)記的Mouse ant1-Human IgG, 10 u I/孔,4 °C避光冰浴孵育0.5-lh ； f洗滌用Iml預(yù)冷的洗液洗滌細(xì)胞2次，2000r/min離心5分鐘，棄上清液，收集細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于Iml預(yù)冷的洗液中； g流式細(xì)胞儀測(cè)定將細(xì)胞轉(zhuǎn)入流式管，以陰性對(duì)照細(xì)胞設(shè)置陰性門和陽(yáng)性門的分界線，記錄各管細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，以LogC-MCF進(jìn)行曲線擬合，得出參考品和待測(cè)樣品的EC50值，計(jì)算兩者EC5tl值的比值得出待測(cè)樣品相對(duì)參考品的結(jié)合活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述針對(duì)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期高表達(dá)CD20的細(xì)胞是人Burkitt' s淋巴瘤細(xì)胞Raji。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述完全培養(yǎng)基是含10%FBS和1%鏈霉素與青霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于在步驟b中，所述參考品和待測(cè)樣品為抗人⑶20單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于在步驟b中，所述預(yù)稀釋濃度是10-20u g/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于在步驟b中，所述系列梯度稀釋是2倍系列梯度稀釋。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述洗液為PBS溶液或生理鹽水。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述洗液是含1%-2% FBS的PBS溶液。
9.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述細(xì)胞培養(yǎng)板為24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗CD20單克隆抗體結(jié)合活性的檢測(cè)方法。本發(fā)明公開了一種抗CD20單克隆抗體結(jié)合活性的檢測(cè)方法，包括下列步驟a取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期高表達(dá)CD20的細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整至合適活細(xì)胞密度進(jìn)行鋪板；b將參考品及待測(cè)樣品進(jìn)行系列梯度稀釋后，依次加入鋪好細(xì)胞的培養(yǎng)板中培養(yǎng)一段時(shí)間；c收集細(xì)胞，加入FITC標(biāo)記的二抗孵育一段時(shí)間；d用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果得出待測(cè)樣品結(jié)合活性。本發(fā)明所述檢測(cè)方法滿足專屬性、精密度、線性和范圍、準(zhǔn)確性以及耐用性等驗(yàn)證方面的要求，能夠有效地應(yīng)用于抗CD20單克隆抗體結(jié)合活性的檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N15/14GK103033621SQ201110302889
公開日2013年4月10日 申請(qǐng)日期2011年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月9日
發(fā)明者劉培培, 王少雄, 呂品, 陳香 申請(qǐng)人:嘉和生物藥業(yè)有限公司