一種用于玉米赤霉烯酮富集凈化的免疫磁珠及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及玉米赤霉烯酮樣本的富集凈化處理工藝，具體涉及一種用于玉米赤霉 烯酮富集凈化的免疫磁珠及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 玉米赤霉稀酮（Zearalenone，ZEN)為一種白色結(jié)晶，又稱F-2毒素，是由禾谷鐮刀 菌等菌種產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物。ZEN主要污染玉米、高粱、小麥、大麥等糧谷類作物及其制 品。Toshitsugu對(duì)19個(gè)國(guó)家和地區(qū)的谷物、食品及飼料中所含的ZEN進(jìn)行了調(diào)查發(fā)現(xiàn)，包 括中國(guó)、阿根廷、加拿大、波蘭及也門等眾多國(guó)家和地區(qū)的樣品均有不同程度的污染。借助 被污染的乳制品、肉制品等動(dòng)物源性食品，ZEN及其代謝產(chǎn)物可以進(jìn)入人體，給人類的健康 造成威脅。ZEN對(duì)動(dòng)物及人類危害主要表現(xiàn)在影響和破壞生長(zhǎng)發(fā)育及生殖系統(tǒng)方面，人畜誤 食含有該毒素的食物后，會(huì)引起雌性激素中毒癥，造成生殖系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p傷。此外，ZEN及 其衍生物對(duì)肝臟系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)均有很大的危害，并且有引發(fā)腫瘤的可能性。Schoental R 在進(jìn)行致癌試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組大鼠出現(xiàn)由致癌劑處理而誘發(fā)的腫瘤；此外，試驗(yàn)組和對(duì)照 組大鼠還發(fā)生了乳腺纖維瘤、腺瘤、腺癌、垂體腺癌、睪丸間質(zhì)腫瘤以及子宮纖維瘤等。在其 他致癌試驗(yàn)中也有類似情況發(fā)生，這些腫瘤所涉及的器官表明，它們可能與動(dòng)物飼料中的 雌激素物質(zhì)有關(guān)。因此認(rèn)為，它們是由污染飼料的ZEN或其代謝產(chǎn)物引起的。
[0003] 目前大多數(shù)國(guó)家對(duì)食品、谷物、飼料中的玉米赤霉烯酮含量都有十分嚴(yán)格的規(guī)定。 例如澳大利亞規(guī)定谷物中玉米赤霉稀酮的含量不能超過(guò)0. 05mg/kg ;意大利規(guī)定在谷物和 谷類產(chǎn)品中玉米赤霉稀酮的含量不能超過(guò)〇. lmg/kg ;而在法國(guó)，植物油和谷類當(dāng)中玉米赤 霉稀酮的含量必須低于〇. 2mg/kg。中國(guó)則規(guī)定小麥、玉米中的玉米赤霉稀酮含量不得超過(guò) 0.06mg/kg〇
[0004] 目前食品中玉米赤霉烯酮的主要提取方法包括有機(jī)溶劑萃取法、免疫親和層析法 等。有機(jī)溶劑萃取法是目前最普遍的提取方法，但有機(jī)溶劑的萃取存在過(guò)程復(fù)雜、毒性大、 所需時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)，而且由于最終提取物中可能存在其他熒光物質(zhì)、色素、結(jié)構(gòu)類似物，從 而對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生干擾；免疫親和層析提高了試樣的凈化效果，同時(shí)可顯著減少有毒有害 試劑的使用，但樣品前處理較復(fù)雜，所用設(shè)備價(jià)格昂貴，對(duì)操作人員的技術(shù)要求也比較高， 不適合于大批量樣本檢測(cè)及大范圍推廣的應(yīng)用。
[0005] 免疫磁珠分離技術(shù)（Immunomagnetic bead-based separation，IMS)是近年來(lái)發(fā) 展起來(lái)的一項(xiàng)新的免疫學(xué)技術(shù)。免疫磁珠 （Immunomagnetic bead，IMB)既可結(jié)合活性蛋白 質(zhì)抗體，又可被磁鐵吸引，經(jīng)過(guò)處理后，可將抗體結(jié)合在磁珠上，使之成為抗體的載體，磁珠 上抗體與特異性抗原物質(zhì)結(jié)合后，則形成抗原-抗體-磁珠免疫復(fù)合物，這種復(fù)合物在磁力 作用下發(fā)生力學(xué)移動(dòng)，使復(fù)合物與其它物質(zhì)分離，而達(dá)到分離特異性抗原的目的。免疫磁 珠（MB)是一個(gè)平臺(tái)，凡是利用抗原抗體結(jié)合原理進(jìn)行工作的領(lǐng)域都可以應(yīng)用，并且已在 醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的骨髓移植、分離干細(xì)胞、細(xì)胞器、癌細(xì)胞、激素、病原菌以及毒素等方面取得 了顯著成績(jī)。近年來(lái)MB以其高度的敏感性和特異性被廣泛應(yīng)用于食品、水、生物樣品、環(huán) 境等標(biāo)本中真菌毒素的分離和檢測(cè)工作中，顯示出良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
[0006] 在分離真菌毒素方面，頂B可有效地收集、濃縮大量樣品中的少量真菌毒素，可避 免有機(jī)溶劑萃取法、免疫親和層析法提取時(shí)存在的缺點(diǎn)。對(duì)目的毒素的富集具有高分離 率、高特異性、高穩(wěn)定性、無(wú)污染、無(wú)毒性、操作簡(jiǎn)便、樣品用量少且不會(huì)破壞毒素結(jié)構(gòu)等優(yōu) 點(diǎn)，與常規(guī)方法相比，不需要多加純化步驟去除雜質(zhì)，可直接對(duì)真菌毒素產(chǎn)生富集分離純化 的效果，并可在2_5h內(nèi)完成。并且磁珠上偶聯(lián)的抗體可準(zhǔn)確識(shí)別真菌毒素上的特征基團(tuán)， 從而減少漏檢，減少安全隱患。
[0007] 本發(fā)明利用磁珠與抗體的偶聯(lián)原理對(duì)可富集玉米赤霉烯酮的免疫磁珠的制備工 藝及應(yīng)用條件進(jìn)行了優(yōu)化，大大提高了對(duì)玉米赤霉烯酮的富集能力和檢測(cè)靈敏度，同時(shí)憑 借免疫磁珠自身的快速方便、價(jià)格低廉的特點(diǎn)，將其應(yīng)用于谷物及飼料中玉米赤霉烯酮的 分離與富集，可以進(jìn)一步提高快速檢測(cè)玉米赤霉烯酮的效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種用于玉米赤霉烯酮富集 凈化的免疫磁珠及其制備方法和應(yīng)用，以解決玉米赤霉烯酮樣品凈化分離操作復(fù)雜、分離 效率低、存在較大安全隱患的技術(shù)問(wèn)題。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：提供一種用于玉米赤霉烯酮富 集凈化的免疫磁珠，所述免疫磁珠上偶聯(lián)有玉米赤霉烯酮單克隆抗體；所述玉米赤霉烯酮 單克隆抗體是用玉米赤霉烯酮人工抗原免疫白鼠所得到的；所述玉米赤霉烯酮人工抗原是 玉米赤霉烯酮半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物，其分子結(jié)構(gòu)式如式I所示：
[0011] 所述玉米赤霉烯酮半抗原是按照如下方法制備得到的：
[0012] IlOmg 對(duì)苯二胺，溶入 15ml 0· 2mol/L 的 HCl 水溶液中，0-4°C下滴加 70mg NaNO2 的2ml水溶液，避光反應(yīng)0. 5-1小時(shí)，然后緩慢滴加 I IOmg玉米赤酶烯酮在2ml 0. 5mol/L醋 酸鈉水溶液中的混合物。避光反應(yīng)1-3小時(shí)。加入適量濃鹽酸酸化，產(chǎn)生沉淀，離心，水洗， 乙酸乙酯提取，除去溶劑后得到玉米赤酶烯酮的偶氮衍生物，得到玉米赤霉烯酮半抗原，得 率 65%。
[0013] 所述玉米赤霉烯酮人工抗原是按照如下方法制備得到的：
[0014] 取半抗原20mg用2ml水溶解，得到溶液A，取戊二醛50 μ 1逐滴加入到溶液A中， 室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h。取BSA50mg用4ml水溶解，得到溶液B，將溶液A緩慢加入到溶液B中， 室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過(guò)夜。加入NaBH 430mg還原，用0. 02mol/L的PBS透析三天，每天更換透析 液三次，得到所述玉米赤霉烯酮人工抗原。
[0015] 所述玉米赤霉烯酮半抗原的分子結(jié)構(gòu)式如式II所示：
[0017] 本發(fā)明還提供了一種上述免疫磁珠的制備方法，是以粒徑2. 8 μπι的羧基磁珠為 載體，羧基磁珠末端具有反應(yīng)活性的羧基基團(tuán)，在經(jīng)活化劑H)C-NHS組合處理后，活化磁珠 可與玉米赤霉稀酮單克隆抗體進(jìn)行偶聯(lián)，制備成能夠富集凈化玉米赤霉稀酮的免疫磁珠；
[0018] 上述免疫磁珠的制備方法具體描述如下：
[0019] (1)清洗：取IOOyL羧基磁珠于離心管中，用IOOyL含0.05%吐溫-20的ρΗ5·0、 25mmol/L的MES溶液洗滌2次，磁分離后移除上清；
[0020] (2)活化：用 4°C貯存的 pH5. 0、25mmol/L MES 溶液分別配制 50mmol/L 的 EDC、NHS 溶液；分別加入50 μ L新配制的EDC和NHS溶液到裝有磁珠的離心管中，渦旋混勾，室溫活 化30min，磁分離后移除上清，同（I)MES溶液洗滌2-3次；
[0021] (3)偶聯(lián)：將玉米赤霉烯酮單克隆抗體溶解到60 μ L pH5. 0、25mmol/L MES溶液 中，用所述MES溶液調(diào)節(jié)總體積至100 μ L，輕柔加入到已活化磁珠中，室溫偶聯(lián)30min或 4°C偶聯(lián)2h，期間使磁珠保持混勻狀態(tài)；
[0022] ⑷封閉：磁分離后移除上清，加入100 μ L ρΗ7· 4的TRIS溶液反應(yīng)15min封閉磁 珠；
[0023] (5)保存：磁分離后移除上清，用IOOyL含0. 1 %-0.3 %牛血清白蛋白（BSA)、 0. 1 %吐溫-20的TRIS溶液洗滌封閉好的磁珠3-5次，磁分離后移除上清，將磁珠復(fù)溶于含 0· 1% -0· 5% BSA、0. 01% -0· 1%吐溫-