高效降解玉米赤霉烯酮的解淀粉芽孢桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株解淀粉芽孢桿菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 玉米赤霉稀酮（263抑1611〇116,2￡1'〇又稱(chēng)？-2毒素，其化學(xué)名為6-(1〇-羥基-6-氧 基碳烯基-雷鎖酸-y-內(nèi)酯，是一種具有二羥基苯甲酸內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的雌激素類(lèi)真菌毒 素，通常由禾谷鐮刀菌（Fusariumgraminearum)、黃色鐮刀菌（Fusariumculmorum)、克地 鐮刀菌（Fusariumcrookwellense)等多種鐮刀霉菌產(chǎn)生并釋放到環(huán)境中。ZEN是世界上 污染范圍最廣泛的一種真菌毒素，在歐洲、南美洲、北美洲、亞洲、非洲以及大洋洲等世界各 地的谷物以及農(nóng)副產(chǎn)品中都能檢測(cè)到ZEN的存在。ZEN是由Baldwin等最先從發(fā)霉玉米中 分離得到，現(xiàn)已知其存在11種以上的衍生物。ZEN在玉米中可以11. 8mg/kg的極高濃度出 現(xiàn)，在燕麥、小麥、大麥和高粱中也被廣泛檢出。ZEN-般通過(guò)污染的植物飼料等進(jìn)入食物 鏈，從而奶制品、牛肉和羊肉等中也可能以較高濃度出現(xiàn)，某些食物中ZEN的污染量甚至高 達(dá)289mg/kg。長(zhǎng)期以來(lái)，有關(guān)ZEN污染危害的報(bào)道很多，其具有類(lèi)雌激素活性，能引起種豬 等家畜或家禽生殖周期紊亂、家畜家禽早熟，給種植養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大損失。ZEN還具有強(qiáng)致 癌性，導(dǎo)致動(dòng)物和人乳腺癌、食管癌等發(fā)病率增加，成為現(xiàn)今癌癥發(fā)病率節(jié)節(jié)上升的原因之 一。目前ZEN的檢測(cè)方法已較為成熟，但有關(guān)ZEN去除、轉(zhuǎn)化等方面的問(wèn)題迫在眉睫。
[0003]迄今為止，國(guó)內(nèi)外玉米赤霉烯酮的脫除方法主要有物理處理、化學(xué)方法和生物法 三大類(lèi)。雖然物理、化學(xué)法處理脫毒有一定程度的效果，但其仍然存在著很多不足，比如脫 毒效果不理想，可能造成若干重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失，化學(xué)脫毒劑殘留，成本較高，等等。利用 生物手段進(jìn)行真菌毒素的降解則是近年來(lái)科技界研究的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)。生物方法是在溫和的 條件下進(jìn)行處理，從而使毒素的毒性減小，具有對(duì)原料的感官性狀、適口性、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)影響 較小等優(yōu)點(diǎn)。目前大部分國(guó)家對(duì)食品、谷物、飼料當(dāng)中的ZEN含量都作了十分嚴(yán)格的規(guī)定， 例如澳大利亞規(guī)定谷物中ZEN的含量不能超過(guò)50ng/g，意大利規(guī)定在谷物和谷類(lèi)產(chǎn)品當(dāng)中 ZEN的含量不能超過(guò)100ng/g，而在法國(guó)，植物油和谷類(lèi)當(dāng)中ZEN的含量必須低于200ng/g。
[0004] 綜上所述，為解決農(nóng)產(chǎn)品、飼料原料及飼料中ZEN污染問(wèn)題，有必要從自然資源中 分離篩選安全、高效降解玉米赤霉烯酮的微生物菌種，進(jìn)一步研究其生物特性，毒素降解特 性及降解機(jī)制，研發(fā)適用于飼料行業(yè)的玉米赤霉烯酮微生物脫毒劑，保證動(dòng)物產(chǎn)品的食品 安全，減少種植業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失?，F(xiàn)有技術(shù)中，"一株食品級(jí)黑曲霉及其在玉米赤霉 烯酮降解的應(yīng)用"（中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)CN103937681A)中，將黑曲霉在適宜條件下培養(yǎng)5d，向 其中加入終濃度為2ug/ml的玉米赤霉烯酮，48小時(shí)，降解率達(dá)到89. 56% 一株銅綠假單 胞菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的應(yīng)用"（中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)CN103981134A)中，將該銅綠假 單胞菌適宜條件下和終濃度為2yg/ml玉米赤霉烯酮培養(yǎng)72小時(shí)，降解率92. 75% 一株 解淀粉芽孢桿菌及其在降解玉米赤霉烯酮中的應(yīng)用"（中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)CN103981133A)中， 將該株解淀粉芽孢桿菌在適宜條件下培養(yǎng)24小時(shí)，和終濃度為5yg/ml玉米赤霉烯酮加入 MM培養(yǎng)基共培養(yǎng)72小時(shí)，降解率為95. 99 %。
[0005] 與現(xiàn)有技術(shù)比較，本技術(shù)采用土壤中定向篩選得到的高效降解玉米赤霉烯酮的解 淀粉芽孢桿菌ASAGF142,能夠在短時(shí)間內(nèi)（4小時(shí)）將20yg/ml玉米赤霉烯酮完全降解，降 解率100%，具有降解速度快、降解完全的優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一株能快速高效降解玉米赤霉烯酮的解淀粉芽 孢桿菌及其應(yīng)用。
[0007] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明提供一株用于高效降解玉米赤霉烯酮的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)，命名為ASAGF142 ;該菌株是從安徽憲湖地區(qū)種植玉米的土壤中分離 得到，現(xiàn)已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北 辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏編號(hào)為：CGMCCNO. 9464， 分類(lèi)學(xué)命名為：解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens)，保藏日期為2014年7月 16日。與其它生物的情況一樣，本發(fā)明具有降解玉米赤霉烯酮活性的菌株ASAGF142仍然可 能發(fā)生突變或變異。因此，可以利用本領(lǐng)域已知的物理和化學(xué)方法得到該菌株的突變株，例 如，可以通過(guò)用化學(xué)藥劑如亞硝基胍（NTG)及其它化學(xué)誘變劑，或用物理方法如紫外、C〇6。 輻照處理得到其突變株，這些誘變突變株，只要保留了降解玉米赤霉烯酮這樣一個(gè)能力特 征，也屬于本發(fā)明的一部分。
[0009] 本發(fā)明還提供一種菌劑，它的活性成分為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)ASAGF142(保藏編號(hào)為CGMCCNo. 9464)或其衍生的突變株。本發(fā)明提 供上述菌劑可以為液態(tài)菌劑也可以為固態(tài)菌劑，并通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)中已公開(kāi)的制備方法來(lái)制 備。具體地，本發(fā)明提供上述菌劑的制備方法，該方法包括：
[0010] (1)將保藏編號(hào)為CGMCCNo. 9464的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)ASAGF142或其衍生的突變株在固體培養(yǎng)基上活化；
[0011] ⑵將活化后的菌株接種于種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，制得種子液；
[0012] (3)將所述種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至穩(wěn)定期，制得液態(tài)菌劑。
[0013] 進(jìn)一步地，本發(fā)明還可以將上述液態(tài)菌劑直接噴霧干燥，或?qū)⒁簯B(tài)菌劑與吸附劑 混合后干燥，制得固態(tài)菌劑。其中，所述液態(tài)菌劑與吸附劑的重量比為1:2-10,所述吸附劑 可以是玉米芯粉、麩皮、淀粉、硅藻土、凹凸棒土、蛭石、輕質(zhì)碳酸鈣或泥炭中的一種或幾種。
[0014] 進(jìn)一步地，在上述制備方法中，用來(lái)培養(yǎng)解淀粉芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基（FM)可以 有多種形式的，但是綜合考慮生產(chǎn)成本、細(xì)胞生物量、脫毒活性等方面，優(yōu)選某些培養(yǎng)基，例 如，解淀粉芽孢桿菌ASAGF142優(yōu)選碳源為乳糖，但也可以選用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、甘油、 果糖、半乳糖、糖蜜等。解淀粉芽孢桿菌ASAGF142優(yōu)選氮源為牛肉膏，但也可以選用酵母 膏、蛋白胨、酵母提取物、玉米漿等?？蓳饺肱囵B(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)無(wú)機(jī)鹽有能夠產(chǎn)生下列離子的 常規(guī)可溶性鹽：鋅離子、鈉離子、鎂離子、鈣離子、鐵離子、氯離子、碳酸根離子、硫酸根離子、 硝酸根離子等。
[0015] 進(jìn)一步地，所述的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基（FM)需要121°C高溫濕熱滅菌后冷卻 至30~35°C使用。
[0016] 進(jìn)一步地，所述活化后的菌種按種子罐中種子培養(yǎng)基的0.5~10%接種量接種入 種子罐；所述種子液按發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基的0. 5~10%接種量接種入發(fā)酵罐。
[0017] 進(jìn)一步地，發(fā)酵培養(yǎng)條件為：無(wú)菌空氣的通氣量為1:0. 5~1. 2,攪拌速度為50~ 300轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度約30~37°C，液態(tài)菌劑中活細(xì)胞數(shù)量至少達(dá)到IO7CFUAiI。
[0018] 本發(fā)明要求保護(hù)所述解淀粉芽孢桿菌ASAGF142、其衍生的突變株及上述菌劑在降 解玉米赤霉稀酮中的應(yīng)用。
[0019] 具體地，在降解玉米赤霉烯酮時(shí)，采用如下（a)或（b)方式中的任一種：
[0020] (a).將液態(tài)菌劑按照質(zhì)量比1:1的配比噴施于玉米赤霉烯酮污染的谷物或者飼 料及飼料原料或其它農(nóng)副產(chǎn)品，降解玉米赤霉烯酮，所述液態(tài)菌劑的活細(xì)胞數(shù)量至少達(dá)到 IO7CFlVml0
[0021] (b).將固態(tài)菌劑按照質(zhì)量百分含量為1-5%的添加量加入到谷物或者飼料原料 及飼料中，混合均勻，降解玉米赤霉烯酮，所述固態(tài)菌劑的活細(xì)胞數(shù)量至少達(dá)到l〇sCFU/g。
[0022] 所述谷物為玉米、大麥、稻谷、小麥或高梁。所述飼料原料及飼料為玉米、大麥、稻 谷、小麥或高梁等飼料原料及它們加工而成的飼料。所述其它農(nóng)副產(chǎn)品為農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn) 物如酒糟、果渣、淀粉渣等。
[0023] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明提供的保藏編號(hào)為CGMCCNo. 9464的解淀粉芽孢桿菌 對(duì)玉米赤霉烯酮有高效快速的降解作用。使用保藏編號(hào)為CGMCCNo. 9464的解淀粉芽孢桿 菌生產(chǎn)降解玉米赤霉烯酮的固態(tài)或液態(tài)微生物菌劑，可以直接作為飼料添加劑加入飼料中 使用，也可以將微生物菌劑接種到飼料原料或飼料中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵去除玉米赤霉烯酮，具 有生產(chǎn)使用成本低、簡(jiǎn)單、易操作，菌種安全，玉米赤霉烯酮降解安全、高效等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明 提供的菌株和菌劑可以用于谷物、飼料、飼料原料中玉米赤霉烯酮的去除，對(duì)于解決飼料及 其原料中毒素污染問(wèn)題，提高糧食利用率，保證畜牧業(yè)的安全生產(chǎn)和動(dòng)物產(chǎn)品的食品安全、 提高畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)效益具有重要的意義。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖IASAGF142在ZEN濃度為20yg/mL的FM(發(fā)酵培養(yǎng)基）中4小時(shí)后毒素降解 效果。
[0025] 圖2ASAGF142液體反應(yīng)體系下，降解效果。
[0026] 圖3ASAGF142液態(tài)菌劑對(duì)谷物中玉米赤霉烯酮的降解效果。
[0027] 圖4ASAGF142固態(tài)菌劑對(duì)谷物中玉米赤霉烯酮的降解效果。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但并不是限定本發(fā)明。下述實(shí)施例 中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō) 明，均為常規(guī)生化試劑供應(yīng)商購(gòu)買(mǎi)得到。
[0029] 實(shí)施例1解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens)ASAGF142的獲得與鑒 定
[0030] 從安徽蕪湖地區(qū)玉米地里采集土樣，通過(guò)96微孔板為培養(yǎng)載體，首先采用5次連 續(xù)玉米赤霉烯酮毒素