專利名稱：一種抗流行性感冒病毒藥物的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物的篩選方法，具體地，涉及抗流感病毒藥物的篩選方法。
背景技術(shù)：
流行性感冒(簡稱流感)是由流行性感冒病毒(influenza)引起的急性呼吸道傳 染病，主要經(jīng)空氣飛沫傳播。是目前人類尚不能有效控制的世界性傳染性疾病。每年引致 相當(dāng)高的發(fā)病率和死亡率，而且不時(shí)會(huì)出現(xiàn)流感流行或局部爆發(fā)。我國被世界公認(rèn)為是流 感的多發(fā)地。目前，臨床上預(yù)防和治療病毒性流感的手段主要有藥物治療和疫苗。由于流感病 毒為多節(jié)段負(fù)鏈RNA病毒，具有極強(qiáng)的重組變異和抗原漂移特點(diǎn)，從而嚴(yán)重制約了目前流 感疫苗的免疫保護(hù)作用和抗病毒化學(xué)藥物的治療效果?？沽鞲胁《舅幬飫t主要設(shè)計(jì)為作用 于病毒的蛋白質(zhì)，如奧司他韋、扎那米韋、金剛烷胺、金剛乙胺和新近研發(fā)的鹽酸阿比多爾 等，這些藥物具有較強(qiáng)的特異性，但也面臨巨大挑戰(zhàn)。目前臨床批準(zhǔn)使用的抗流感藥物有阻斷流感病毒基質(zhì)2 (M2)離子通道活性的金 剛烷胺類化合物(金剛烷胺和金剛乙胺)和阻斷病毒神經(jīng)氨酸酶已上市與其受體結(jié)合的神 經(jīng)氨酸酶抑制劑(扎那米韋，zanamivir、奧司米韋(oseltamivir，商品名“達(dá)菲”)。金剛 烷胺類藥物主要通過干擾M2離子通道活性來抑制流感病毒的復(fù)制。但金剛烷胺類藥物對(duì)B 型流感無效，而且存在神經(jīng)毒性、長期用藥易產(chǎn)生耐藥毒株等缺陷，這限制了金剛烷胺類藥 物在臨床上的廣泛應(yīng)用。流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑流感病毒NA是流感病毒的另一種主要結(jié)構(gòu)蛋白，具 有唾液酸酶活性，能切割糖蛋白、糖脂和寡居糖蛋白通過酮基連接的唾液酸。NA抑制劑不 僅抑制A型流感病毒，而且能抑制B型流感病毒，除了治療外它還能對(duì)流感起預(yù)防作用，其 抗流感的保護(hù)率是74%。目前兩種流感病毒NA抑制劑扎那米韋(zanamivir)、奧司米韋 (oseltamivir)已上市。其中奧司米韋(商品名“達(dá)菲”)對(duì)治療高致病性禽流感病毒感染 有相當(dāng)好的療效，但隨后有報(bào)道顯示“達(dá)菲”的耐藥突變株已經(jīng)出現(xiàn)。由于目前應(yīng)用的抗流感藥物主要針對(duì)病毒顆粒中變異性較強(qiáng)的基因靶點(diǎn)，使得病 毒總是能很快適應(yīng)和逃避來自藥物施加的選擇壓力，而產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)藥物對(duì)宿主細(xì)胞 還存在毒副作用大的問題。因此，亟待尋找新的抗流感病毒藥物靶標(biāo)，發(fā)展新型抗病毒藥 物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種篩選抗流感病毒藥物的方法，具體地講是一種針對(duì)流感 病毒復(fù)制前形成的流感病毒RNA聚合酶復(fù)合物為靶點(diǎn)的抗流感病毒藥物篩選方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先構(gòu)建了一種流感病毒RNA聚合酶活性依賴的表達(dá)載 體，該表達(dá)載體帶有依賴流感病毒RNA聚合酶活性表達(dá)的報(bào)告基因。這里的報(bào)告基因可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)報(bào)告基因，優(yōu)選為熒光素酶基因或者熒光蛋白基因，例如綠熒光蛋白(GFP)、紅熒光蛋白(DsRec^)以及深藍(lán)螢光蛋白 (CFP)，更優(yōu)選為黃熒光蛋白?？梢酝ㄟ^檢測細(xì)胞的熒光值方便地進(jìn)行觀察。進(jìn)一步，本發(fā)明將上述表達(dá)在于與表達(dá)流感病毒RNA聚合酶PA、PBU PB2亞基和 NP蛋白的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，構(gòu)建得到穩(wěn)定表達(dá)IUuc的細(xì)胞。上述細(xì)胞可通過如下方法構(gòu)建引入內(nèi)部核糖體結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建報(bào)告基因和抗性 基因雙蛋白表達(dá)載體。利用抗性基因的表達(dá)依賴于流感病毒RNA聚合酶活性的特點(diǎn)，建立 穩(wěn)定表達(dá)流感病毒RNA聚合酶PA、PB1、PB2亞基、NP蛋白和RLuc的細(xì)胞系。利用該細(xì)胞系 建立基于穩(wěn)定表達(dá)的流感病毒RNA聚合酶活性分析方法，并對(duì)其進(jìn)行可行性評(píng)價(jià)和藥物篩 選?；诖?，本發(fā)明的藥物篩選方法是將添加待測樣品至上述的細(xì)胞；檢測細(xì)胞報(bào) 告基因表達(dá)產(chǎn)物量的變化，選擇能使報(bào)告基因表達(dá)產(chǎn)物量下降的樣品。當(dāng)然，以上篩選得到的樣品還應(yīng)當(dāng)是對(duì)細(xì)胞內(nèi)正常蛋白表達(dá)(例如actin，或許 CMV啟動(dòng)子下表達(dá)的RLuc)沒有影響的樣品。本發(fā)明篩選方法選擇流感病毒RNA聚合酶復(fù)合物作為靶點(diǎn)，解決了病毒高變異導(dǎo) 致的耐藥性問題，且與目前臨床應(yīng)用的抗流感病毒藥物無交叉耐藥性。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例11、表達(dá)載體的構(gòu)建；應(yīng)用PCR擴(kuò)增真核細(xì)胞表達(dá)載體pRluc_N2 (PerkinElmer)中的Rluc基因片段。 所用引物所用引物上游引物 5 ‘ -GATTCAATTCAGCTACCATAATGATGCAGAGAGGCAATTTTGGTA C-3'，下游引物 5' -CAAAATTGCCTCTCTGCATCATTATGCTAGCTGAATTG-3'，。反應(yīng)體系
2xEasyPfu PCR SuperMix模板DNA 上游引物(ΙΟμΜ)下游引物(ΙΟμΜ)ddH2025 μ Ιμ 2μ12μ120μ1總體積50μ1反應(yīng)條件94°C45s,68°C 90s，共 30 個(gè)循環(huán)。將IUuc片段插入到流感病毒M片段表達(dá)載體pWSN-M (Kawaoka博士惠贈(zèng))的克隆 位點(diǎn)BsmB I中，得到質(zhì)粒pFLU-Rluc，表達(dá)熒光蛋白。
2、細(xì)胞培養(yǎng)取細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶后，棄舊培養(yǎng)基，用含0. 25 %胰酶和 0. 02% EDTA的消化液消化。待細(xì)胞變圓，棄消化液，立即加入含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng) 基(HyClone)，用吸管輕輕吹打瓶底，使細(xì)胞完全脫離瓶底且使之分散為單細(xì)胞懸液。血球 計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，IOcm細(xì)胞培養(yǎng)皿接種2. 4 X IO6個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)染。3、細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染步驟按Lipofectamine 2000 Qnvitrogene)的說明書進(jìn)行。具體操作如下 用1. 5ml高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒，pffSN-PBl (Kawaoka博士惠贈(zèng)，表達(dá)流感病毒PBl)、 PWSN-PB2 (Kawaoka博士惠贈(zèng)，表達(dá)流感病毒PB2)和pWSN-PA (Kawaoka博士惠贈(zèng)，表達(dá)流 感病毒PA)質(zhì)粒用量為l.Oyg，pWSN-NP(Kawaoka博士惠贈(zèng)，表達(dá)流感病毒NP)質(zhì)粒用量 為1. 5 μ g，而pFLU-Rluc質(zhì)粒的用量為4. Ομ g。用1. 5ml高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋60 μ 1 Lipofectamine2000o室溫孵育5min，將含有轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和Lipofectamine 2000的培養(yǎng)基輕 輕混勻(總體積為3ml)，室溫孵育25min，加到IOcm培養(yǎng)皿的細(xì)胞培養(yǎng)上清中。轉(zhuǎn)染后，37°C，5%的CO2培養(yǎng)12h。然后吸去舊的培養(yǎng)基，用含0. 25 %胰酶和0.02% EDTA的消化液消化，棄消化液，立即加入含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，輕輕吹打， 使細(xì)胞分散為單細(xì)胞懸液。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，用培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為2. 5X105個(gè)/ ml,四周白色不透明、底部透明、平底的96孔板(Costar)每孔接種150 μ 1細(xì)胞懸液。4、樣品制備化合物樣品10mg純品化合物溶到Iml DMSO中，50% DMSO稀釋到lmg/ml，取1.5 μ 1作用于150 μ 1細(xì)胞體系，使其終濃度為10 μ g/ml。發(fā)酵液樣品菌種發(fā)酵，從斜面上挑取一小塊培養(yǎng)物種入盛有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的 250ml三角瓶中，28°C、190rpm旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)4d。取IOml發(fā)酵液用IOml的丙酮抽提，揮干 后，用Iml的DMSO溶解。取IOyl加IOyl水倍比稀釋，取1.5μ1作用于150μ1細(xì)胞體系。5、樣品活性檢測96孔板培養(yǎng)1 后，按以下分組進(jìn)行操作。陰性對(duì)照組加入1. 5 μ 1 RLuc質(zhì)粒于細(xì)胞培養(yǎng)上清中，該組反映pFLU-Rluc質(zhì)粒 表達(dá)的RLuc激活的熒光蛋白對(duì)細(xì)胞的作用。陽性藥對(duì)照組加1. 5 μ 1的500 μ M TMC-125于150 μ 1的細(xì)胞體系中，使TMC-125 的終濃度為5 μ Μ。該組反映TMC-125抑制流感病毒RNA聚合酶的程度。樣品實(shí)驗(yàn)組加藥篩選的樣品1. 5 μ 1于150 μ 1的細(xì)胞體系中。該組反映篩選樣 品抑制RNA聚合酶的程度。繼續(xù)培養(yǎng)1 后，吸去舊的培養(yǎng)基，每孔加入150yLPBS清洗細(xì)胞后，4°C離 心棄去PBS，加入20 μ L細(xì)胞裂解液，離心吸出上清轉(zhuǎn)到測量板中，加入熒光底物，用 480nm(±10nm)激發(fā)光，520nm(士 10歷)處發(fā)射光，檢測Luc強(qiáng)度。與陰性對(duì)照比較得出結(jié)果。結(jié)果，陽性藥物對(duì)照組的熒光強(qiáng)度顯著弱于陰性對(duì)照組，表明TMC-125抑制流感 病毒RNA聚合酶。從組合化學(xué)庫共篩選4000個(gè)樣品，其中初篩陽性化合物30個(gè)，陽性率為 0. 75%。
序列表<110>中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物技術(shù)研究所<120> 一種抗流行性感冒病毒藥物的篩選方法<130>KHP09113516. 6<160>2<170>PatentIn version 3. 5<210>1<211>46<212>DNA<213>人工序列<400>1gattcaattc agctaccata atgatgcaga gaggcaattt tggtac 46<210>2<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>2caaaattgcc tctctgcatc attatgctag ctgaattg38
權(quán)利要求
1.一種由以下載體共轉(zhuǎn)染得到的表達(dá)流感病毒RNA聚合酶PA、PBl、PB2亞基和NP蛋 白以及至少一種報(bào)告基因的細(xì)胞1)表達(dá)流感病毒RNA聚合酶PA、PB1、PB2亞基和NP蛋白 的質(zhì)粒載體A ；2)流感病毒RNA聚合酶活性依賴的表達(dá)載體B，該表達(dá)載體B帶有依賴流感 病毒RNA聚合酶活性表達(dá)的報(bào)告基因。
2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其特征在于，所述表達(dá)載體B在報(bào)告基因的上下游分別具 有流感病毒M蛋白非編碼片段。
3.如權(quán)利要去1或2所述的細(xì)胞，其特征在于，所述報(bào)告基因?yàn)镽luc、GFP、DsRed2或CFP。
4.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其特征在于，所述表達(dá)載體B為pFLU-RLuc。
5.一種篩選抗流感藥物的方法，其是將添加待測樣品至權(quán)利要求1 4任一項(xiàng)所述的 細(xì)胞；檢測細(xì)胞報(bào)告基因表達(dá)產(chǎn)物量的變化，選擇能使報(bào)告基因表達(dá)產(chǎn)物量下降的樣品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗流感病毒藥物的篩選方法，為通過將待測樣品添加至表達(dá)流感病毒RNA聚合酶及其活性依賴的報(bào)告基因的融合蛋白細(xì)胞，考察報(bào)告基因編碼產(chǎn)物的量，來判斷樣品對(duì)RNA聚合酶的阻斷作用，并進(jìn)一步判斷初選的樣品是否為RNA聚合酶活性抑制劑，從而篩選出抗流感病毒的藥物。本發(fā)明的篩選方法選擇流感病毒RNA聚合酶復(fù)合物作為靶點(diǎn)，解決了病毒高變異導(dǎo)致的耐藥性問題，且與目前臨床應(yīng)用的抗流感病毒藥物無交叉耐藥性。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102051345SQ200910237158
公開日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2009年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月9日
發(fā)明者劉振龍, 岑山, 張全, 李曉宇, 楊亮, 賈平平, 魏曉露 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所