專利名稱：：抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物高通量篩選模型的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明屬于藥物領域，涉及抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物高通量篩選模型。
背景技術(shù)：
：組織因子(tissuefactor,簡稱TF)，即凝血因子III，為單鏈跨膜糖蛋白，屬于細胞因子超家族成員，是生理性止、凝血過程及多種病理性血栓形成的啟動因子[1]。TF既是凝血因子VD(FVD)在細胞表面的受體，又是FVD或FW(a)的輔因子。當血管破損后或在病理情況下，血液暴露于能表達TF的細胞表面，受體TF即與其配體VD或VDa形成復合物，進而同時激活凝血因子X和IX，激活的FXa和FIXa進一步激活凝血酶原(FII)，F(xiàn)lla使纖維蛋白原變成纖維蛋白，從而完成凝血的級聯(lián)反應，導致血液凝固。許多心血管疾病如動脈粥樣硬化(AS)、急性冠脈綜合征以及某些疾病的血栓栓塞性并發(fā)癥都與TF密切相關W。同時，TF的生物學作用的多樣性已經(jīng)得到證實，除了其在凝血過程中的作用以外，TF還承擔了信號受體和其他非凝血功能，使得它在系統(tǒng)性炎癥3、敗血癥、動脈粥樣硬化、腫瘤的血管發(fā)生及轉(zhuǎn)移等疾病中都起重要作用[4]，并且與胚胎的正常發(fā)育有關[5]。這就使TF或TF/FVn(a)復合物成為抗凝、抗血栓及抗腫瘤藥物等發(fā)現(xiàn)的一個很有吸引力的新靶點。因而從天然化合物中尋找TF抑制劑或其先導化合物可能會有深遠的意義。腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多階段的腫瘤細胞與宿主細胞相互作用的復雜的生物學過程，與腫瘤治療的遠期效果密切相關。大致步驟是①原發(fā)灶腫瘤細胞的增殖及游離；②腫瘤細胞浸潤血管基底膜、游走至血管內(nèi)；③與轉(zhuǎn)移部位血管內(nèi)皮細胞粘附，并穿過血管內(nèi)皮細胞、游走至血管外；④轉(zhuǎn)移至靶器官并增殖，形成轉(zhuǎn)移灶。腫瘤的轉(zhuǎn)移涉及多方面的細胞外、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑，并有多種細胞因子、生物信號分子的參與。近年來的臨床觀察和體內(nèi)外實驗研究均證實[6]:高表達TF的實體瘤(如直腸癌)細胞轉(zhuǎn)移能力強，且由轉(zhuǎn)移病灶建立的亞系表達TF的能力較母系細胞高。用TF單抗阻斷TF受體功能后，可使侵襲至SCID小鼠肺部血管的腫瘤細胞數(shù)減少，肺轉(zhuǎn)移灶減少。有學者將低表達和高表達TF的黑色素瘤細胞系分別注射至SCID小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射高表達TF細胞的小鼠有86%出現(xiàn)癌細胞轉(zhuǎn)移，而注射低表達TF細胞的小鼠僅5%出現(xiàn)癌轉(zhuǎn)移，且這種作用可被TF抗體取消m。經(jīng)研究證實，TF可調(diào)節(jié)腫瘤血管的生成和抗血管生成之間的平衡。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)高表達TF的轉(zhuǎn)染細胞和未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞比較，高表達TF的轉(zhuǎn)染細胞生長速度快，腫瘤體積大且血管豐富，低表達TF者則相反，并發(fā)現(xiàn)高表達TF的腫瘤細胞其有絲分裂活性增強，VEGF轉(zhuǎn)錄增強，具有抗血管生成作用的凝血酶敏感蛋白(TSP)轉(zhuǎn)錄減弱f81。因此，TF可能是促進腫瘤血管形成的直接誘因，而惡性腫瘤誘導血管生成是其惡性特征之一，也是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的先決條件。高通量藥物篩選(HTS)是近十年國際藥業(yè)研究發(fā)展過程中興起的一門新興技術(shù)，它已經(jīng)被世界各大醫(yī)藥公司廣泛用于藥物先導物的篩選。通過對種類繁多的合成及天然化合物作針對各種藥物靶體的篩選，從中尋找最佳的先導化合物，進而用于新型藥物的開發(fā)。其特點是規(guī)模大、速度快、成本相對較低，縮短新藥開發(fā)周期[15'2<)]。研究發(fā)現(xiàn)TF與腫瘤的生成、浸潤和轉(zhuǎn)移相關，但目前尚未有利用的細胞水平組織因子高通量藥物篩選模型進行篩選抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的報導。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是建立一種能夠用于篩選抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的組織因子抑制劑高通量藥物篩選模型。本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實現(xiàn)的一種抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物高通量篩選模型，該模型的篩選方法是MDA-MB-435細胞接種于培養(yǎng)板，培養(yǎng)液中分別加入待篩化合物，以不加任何抑制劑為對照，共同培養(yǎng)適當時間后反復冰融，得細胞裂解液；細胞裂解液加入含CaCl2的人凝血酶原復合物溶液共同孵育，加入發(fā)色底物，于405nm測定吸光度，計算TF抑制率，抑制率大于20%的化合物為陽性化合物。所述抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物高通量篩選模型，其中MDA-MB-435細胞接種時的細胞密度為2~4X106/ml;培養(yǎng)基為含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基；凝血酶原復合物濃度在0.008~0.012g/ml:細胞裂解液加入人凝血酶原復合物溶液共同孵育的時間為1520min。所述抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物高通量篩選模型，其中發(fā)色底物為S-2222，發(fā)色底物濃度為0.5mM。所述抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物高通量篩選模型，其中MDA-MB-435細胞接種時的細胞密度為4X10ml;凝血酶原復合物濃度在0.008g/ml;細胞裂解液加入人凝血酶原復合物溶液共同孵育時間為15min。所述抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物高通量篩選模型，該模型的具體篩選方法是生長良好的MDA-MB-435細胞按4xl06/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔180^1細胞液，培養(yǎng)至細胞狀態(tài)良好，貼壁80%左右，吸干培養(yǎng)基，空白孔及對照組分別加入20(HU新鮮培養(yǎng)基，給藥孔分別加入新鮮培養(yǎng)基和2(^1待篩選化合物，放入37'C孵箱共同培養(yǎng)6h，反復凍融3次，取細胞裂解液；1^細胞裂解液與2^濃度為0.01g/ml的人凝血酶原復合物溶液在384孔板中、37'C下共同孵育15min,然后每孔加入2C^l濃度為0.5mM的37'C預熱的S-2222，37'C溫育3min，用微孔板測讀儀以405nm測定吸光度，計算抑制率；以不加任何抑制劑的為陰性對照，初篩化合物終濃度為lxlO—SM，加入化合物后抑制率大于20%的，為陽性化合物。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明選用人乳腺癌細胞MDA-MB-435成功建立了快速穩(wěn)定、靈敏度高、操作簡便的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物篩選模型，具有微量、準確的特點，適用于高通量篩選抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物。圖1:生長良好的435細胞；圖2:不同細胞密度對測定的影響；圖3:凝血酶原復合物不同濃度對測定的影響；圖4:不同孵育時間對實驗的影響；圖5:不同CaCl2濃度對實驗的影響；圖6:不同EDTA濃度對實驗的影響；圖7:不同發(fā)色底物濃度對實驗的影響；圖8:九種細胞TF活性測定。具體實施例方式以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的闡述。實施例1材料和方法1.儀器<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2.材料和試劑MDA-MB-435(人乳腺癌細胞，中國醫(yī)學科學研究院基礎所細胞庫)、IM-3(人肝癌細胞，中山醫(yī)院肝癌研究所)、LLC細胞(熒光標記Lewis肺癌細胞，南京大學模式動物中心)、SGC-7901(人胃癌細胞，醫(yī)科院基礎所細胞庫)、BGC-823(人胃癌細胞，醫(yī)科院基礎所細胞庫)、HL-60(人白血病細胞，醫(yī)科院基礎所細胞庫)、A549(人肺癌細胞，醫(yī)科院基礎所細胞庫)、L-02(人肝細胞，醫(yī)科院基礎所細胞庫)、Bel-7402細胞(人肝癌細胞，醫(yī)科院基礎所細胞庫)DMEM培養(yǎng)基，1640培養(yǎng)基等(GIBCO公司)。細胞培養(yǎng)常規(guī)試劑(胰蛋白酶，批號1013S04，AMRESCO分裝，南京生興生物技術(shù)有限公司；氨芐青霉素，批號0321S05，AMRESCO分裝，南京生興生物技術(shù)有限公司；鏈霉素，批號0307S05CA，AMRESCO分裝，南京生興生物技術(shù)有限公司；碳酸氫鈉，分析純，批號021010767，南京化學試劑一廠)。新生小牛血清(GIBCO公司)。人凝血酶原復合物(華蘭生物工程股份公司)。S-2222(Sigma)CaCl2，EDTA均為化學純。3.溶液配制3.1:培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)基將lOgDMEM干粉溶于卯OmL三蒸水中，加入NaHC033.7g，氨芐青霉素0.1183g，鏈霉素0.1g，緩慢攪拌4h,調(diào)節(jié)pH至7.2，稀釋至1L,抽濾除菌，分裝時加入10%小牛血清，4'C保存。1640培養(yǎng)基將10g1640干粉溶于900mL三蒸水中，加入NaHC032.0g，氨節(jié)青霉素0.1183g，鏈霉素0.1g，緩慢攪拌4h,調(diào)節(jié)pH至7.2,稀釋至1L，抽濾除菌，分裝時加入10%小牛血清，4'C保存。3.2:PBS(pH7.2)稱取KCI0.2g,KH2P040.2g，NaCl8g,Na2HP04'12H202.08g,依次溶于1000ml三蒸水中，高壓滅菌，4'C保存。3.3:消化液稱取胰蛋白酶1.25g，溶于500ml滅菌PBS中，室溫攪拌4小時，過濾除菌，得胰蛋白酶溶液。稱取EDTA0.1g，溶于500mLPBS中，攪拌至溶解，高溫滅菌，得EDTA溶液。將EDTA溶液和胰蛋白酶溶液按體積比1:l混合，4'C保存。4.實驗步驟4.1實驗條件的確定4丄I細胞密度對實驗的影響以細胞密度為橫坐標，OD405為縱坐標，細胞密度以10"ml為單位，選定測量范圍0.5~8，測定此范圍內(nèi)不同細胞密度下的吸光度值，來選取最合適的細胞密度。4丄2凝血酶原復合物的濃度對實驗的影響以凝血酶原復合物濃度為橫坐標，OD405為縱坐標，濃度以g/L為單位，選定測量范圍6~20，測定此范圍內(nèi)不同凝血酶原復合物濃度下的吸光度值，來選取最合適的凝血酶原復合物濃度。4丄3孵育時間對實驗的影響以時間為橫坐標，OD4()5為縱坐標，孵育時間以min為單位，選定測量范圍1035min，測定此范圍內(nèi)不同孵育時間下的吸光度值，來選取最合適的孵育時間。4丄4CaCl2濃度對實驗的影響以CaCl2濃度為橫坐標，OD405為縱坐標，濃度以mmol/L為單位，選定測量范圍50~200,測定此范圍內(nèi)不同CaCl2濃度下的吸光度值，來選取最合適的CaCl2濃度。4.1.5EDTA濃度對測定的影響以EDTA濃度為橫坐標，OD405為縱坐標，濃度以mmol/L為單位，選定測量范圍50200，測定此范圍內(nèi)不同EDTA濃度下的吸光度值，來選取最合適的EDTA濃度。4丄6不同發(fā)色底物濃度對實驗的影響以S-2222濃度為橫坐標，OD4Q5為縱坐標，濃度以mmol/L為單位，選定測量范圍0.0625-1，測定此范圍內(nèi)不同發(fā)色底物濃度下的吸光度值，來選取最合適的發(fā)色底物濃度。4.2細胞株的篩選選取生長狀態(tài)良好，成指數(shù)生長的九種細胞(MDA-MB-435、IM-3、LLC、SGC-7901、BGC-823、HL-60、A549、L-02、Bel-7402)，按4><106/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔細胞液，培養(yǎng)至細胞狀態(tài)良好，貼壁80%左右，反復凍融3次，取細胞裂解液，采用下文介紹的發(fā)色底物法來測定九種細胞的TF活性，選取合適的細胞進行本實驗。4.3細胞的培養(yǎng)4.3.1細胞復蘇從液氮罐中取出細胞凍存管，迅速放入37'C水浴中，并不時搖動，在lmin內(nèi)使其完全融化。經(jīng)75%乙醇消毒凍存管外壁后，于室溫下1000rmin"離心5min,棄去上層液，加入1mlDMEM+10%小牛血清培養(yǎng)基重懸，轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶中，再加入培養(yǎng)基(MDA-MB-435、IM-3用DMEM培養(yǎng)基，其余細胞用1640培養(yǎng)基，下同)10ml左右，吹勻，37'C、5。/。C02培養(yǎng)細胞至貼壁后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。4.3.2細胞傳代MDA-MB-435細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育，23天換液一次。待細胞長滿細胞培養(yǎng)瓶底時倒去培養(yǎng)基，加入含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液，37'C消化至細胞成片脫落(顯微鏡下細胞由皺變圓)，再加入含血清培養(yǎng)基終止反應，反復吹打使細胞懸浮，快速轉(zhuǎn)移至10ml無菌有帽離心管中，1000rmin—'離心5min，棄上層液，加入5ml培養(yǎng)基重懸細胞，并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，37°C、5%<:02培養(yǎng)至細胞貼壁后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。4.3.3MDA-MB-435常規(guī)細胞形態(tài)觀察取培養(yǎng)瓶中生長至融合的MDA-MB-435細胞，換上新鮮培養(yǎng)基，用倒置相差顯微鏡觀察細胞生長情況。結(jié)果顯示如圖1，細胞均勻鋪滿瓶底，排列整齊，胞槳飽滿，生長良好。取第20~30代細胞用于試驗。4.4加藥MDA-MB-435細胞按4xl06/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔180^1細胞液，培養(yǎng)至細胞狀態(tài)良好，貼壁80%左右，吸干培養(yǎng)基，空白孔及對照組(陰性對照不加藥)分別加入200pl新鮮培養(yǎng)基，給藥孔分別加入18(^1新鮮培養(yǎng)基和2(^1lxl(T5M的各種待篩選化合物，放入37'C孵箱共同培養(yǎng)6h，反復凍融3次，取細胞裂解液。4.5TF促凝活性的測定(發(fā)色底物法)4.5.1基本原理根據(jù)TF-VIIa復合物活化的Xa可以使發(fā)色底物(chromogenicsubstrate,S-2222)分解為多肽和對硝基苯胺(pNA),后者在405nm處有吸收高峰，用微孔板測讀儀測定405nm處的OD值，該值能反映TF的活性水平W。該方法靈敏、簡單、快速，是國際上公認的測定TF活性的方法。原理如下TF+FVHra2+，F(xiàn)VDapH7.3，F(xiàn)XCa2+，F(xiàn)VHaFXapH7.3S-2222_FYa,peptide(多肽)+pNApH8.4另外，結(jié)合參考文獻及實際情況，本實驗設計采用商品化的人凝血酶原復合物(PPSB)作為因子VD、X的來源16，71。4.5.2步驟細胞裂解液(18^1)與人凝血酶原復合物溶液(2nl，0.01g/ml，含有CaCl25mmol/l)在384孔板中、37'C下共同孵育15min，然后每孔加入37'C預熱的Chromogen^substrate(20^1，0.5mM，含25mmol/LEDTA)，37'C溫育3min，用微孔板測讀儀以405nm測定吸光度[6'8。(CaCl2、EDTA皆為終濃度)步驟如下細胞裂解液U8pl)+凝血酶原復合物溶液(2jil，0.01g/ml，含有CaCl2,5mmo1/1)37°C15minChromogenicsubstrate(20(^1，0,5mM，含25mmol/LEDTA)37。CmmA4054.6數(shù)據(jù)處理本實驗以不加任何抑制劑的為陰性對照，初篩化合物終濃度為lxlO—5M。將加入化合物后抑制率大于20%的，定義為具有抑制活性，以+表示。陰性對照組OD值-藥敏組OD值TF抑制率％=-x100%陰性對照組OD值.5.實驗結(jié)果5.1實驗條件的確定5丄1細胞密度對實驗的影響細胞密度會直接影響測定結(jié)果的陰性值，繼而影響活性化合物的篩選。根據(jù)實驗，確定合適的細胞密度為2~4X106/ml。結(jié)果見圖-2。5丄2凝血酶原復合物的濃度對實驗的影響實驗測定，適宜的凝血酶原復合物濃度在0.0080.012g/ml范圍內(nèi)，本實驗采用的濃度為0.008g/ml。結(jié)果見圖-3。5丄3孵育時間對實驗的影響孵育時間會直接影響TF-VDa復合物的形成，接著影響因子Xa的激活，時間太短反應不完全，會使模型的靈敏度下降，而反應時間太長，也將難以反映抑制劑的真實效應。實驗發(fā)現(xiàn)1520min的反應時間較為合適，見圖-4。實驗孵育時間為15min。5丄4CaCl2濃度對實驗的影響從圖-5中可以清楚的看出，當CaCh濃度為100mmol/L時在405nm處的吸光度最大，本實驗正是采用了這個濃度。5丄5EDTA濃度對測定的影響從圖-6中可以看出，EDTA濃度為50或10Ommo1/1時的吸光度測定值均較高，本實驗使用50rnmo1/1的EDTA濃度。5丄6不同發(fā)色底物濃度對實驗的影響從圖-7可以看出，發(fā)色底物濃度為0.5mM時的吸光度值(OD4G5)較大，實驗靈敏度較高，且濃度大小合適，不易造成浪費，故以后的實驗均采用0.5mM的發(fā)色底物濃度。以上實驗分別對細胞密度、孵育時間及各種試劑的使用濃度等條件進行了優(yōu)化，結(jié)果見表l。表l:實驗各影響因素的條件優(yōu)化<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>5.2細胞株的篩選(九種細胞TF活性測定)通過對LLC、SGC-7901、MDA-MB-435、BGC-823、HL-60、A549、L-02、IM-3、Bd-7402九種細胞TF促凝活性的測定，篩選出TF活性高、具有高轉(zhuǎn)移能力的人乳腺癌細胞MDA-MB-435作為建模所用細胞株。(LLC為小鼠肺癌細胞，所以不優(yōu)先選擇)篩選結(jié)果如表-2和圖-8:表2:九種細胞TF活性測定<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>實施例2按實施例1方法采用最適條件對不同化合物進行篩選，結(jié)果見表2、3。最適條件為細胞采用MDA-MB-435，細胞接種時的細胞密度為4X106/ml;凝血酶原復合物濃度在0.008g/ml;細胞裂解液加入人凝血酶原復合物溶液共同孵育時間為15min。發(fā)色底物為S-2222,發(fā)色底物濃度為0.5mM,CaCl2最適濃度為100mmol/L，EDTA最適濃度為50mmol/L。操作方法生長良好的MDA-MB-435細胞按4><106/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔180pl細胞液，培養(yǎng)至細胞狀態(tài)良好，貼壁80%左右，吸干培養(yǎng)基，空白孔及對照組分別加入20(^1新鮮培養(yǎng)基，給藥孔分別加入18(^1新鮮培養(yǎng)基和20pl待篩選化合物，放入37。C孵箱共同培養(yǎng)6h，反復凍融3次，取細胞裂解液；18nl細胞裂解液與2pl濃度為0.01g/ml的人凝血酶原復合物溶液在384孔板中、37'C下共同孵育15min，然后每孔加入20^d濃度為0.5mM的37。C預熱的S-2222，37'C溫育3min，用微孔板測讀儀以405nm測定吸光度，計算抑制率；以不加任何抑制劑的為陰性對照，初篩化合物終濃度為lxlO'SM，加入化合物后抑制率大于20%的，為陽性化合物。表2、部分初篩結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>說明a:lxl(T5M，b:lxl(T6M，c:lxl(T7M，d:lxl(T8M。編號為104967的化合物是姜黃素；編號為104147的化合物是小檗堿；DT-13為短葶山麥冬皂苷C;其余的編號化合物的結(jié)構(gòu)與名稱由樣品提供者控制。由于TF可調(diào)節(jié)腫瘤血管的生成和抗血管生成之間的平衡，高表達TF的腫瘤細胞轉(zhuǎn)移能力強，因此，篩選得到的TF抑制率較高的化合物可作為抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥進行進一步的研究。對照例:用Bel-7402做篩選模型篩選DT13結(jié)果見表4(其他實驗方法及條件相同)，結(jié)果表明采用Bel-7402細胞建模與采用MDA-MB-435細胞相比靈敏性低，不利于抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的篩選。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>權(quán)利要求1、一種抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物高通量篩選模型，其特征在于該模型的篩選方法是MDA-MB-435細胞接種于培養(yǎng)板，培養(yǎng)液中分別加入待篩化合物，以不加任何抑制劑為對照，共同培養(yǎng)適當時間后反復冰融，得細胞裂解液；細胞裂解液加入含CaCl2的人凝血酶原復合物溶液共同孵育，加入發(fā)色底物，于405nm測定吸光度，計算TF抑制率，抑制率大于20％的化合物為陽性化合物。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物高通量篩選模型，其特征在于MDA-MB-435細胞接種時的細胞密度為24X10"ml;培養(yǎng)基為含10。/。小牛血清的DMEM培養(yǎng)基；凝血酶原復合物濃度在0.0080.012g/ml;細胞裂解液加入人凝血酶原復合物溶液共同孵育的時間為1520min。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物高通量篩選模型，其特征在于發(fā)色底物為S-2222,發(fā)色底物濃度為0.5mM。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物高通量篩選模型，其特征在于MDA-MB-435細胞接種時的細胞密度為4X106/ml;凝血酶原復合物濃度在0.008g/ml;細胞裂解液加入人凝血酶原復合物溶液共同孵育時間為15min。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物高通量篩選模型，其特征在于該模型的篩選方法是生長良好的MDA-MB-435細胞按4xl(^/ml接種于96孔培養(yǎng)板，每孔180^1細胞液，培養(yǎng)至細胞狀態(tài)良好，貼壁80%左右，吸干培養(yǎng)基，空白孔及對照組分別加入200nl新鮮培養(yǎng)基，給藥孔分別加入18(^1新鮮培養(yǎng)基和2(^1待篩選化合物，放入37'C孵箱共同培養(yǎng)6h，反復凍融3次，取細胞裂解液；181^1細胞裂解液與2^濃度為0.01g/ml的人凝血酶原復合物溶液在384孔板中、37'C下共同孵育15min,然后每孔加入20pl濃度為0.5mM的37匸預熱的S-2222,37。C溫育3min，用微孔板測讀儀以405nm測定吸光度，計算TF抑制率；以不加任何抑制劑的為陰性對照，初篩化合物終濃度為lx10—5M,加入化合物后抑制率大于20%的，為陽性化合物。全文摘要本發(fā)明屬于藥物領域，公開了抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物高通量篩選模型。該模型的篩選方法是MDA-MB-435細胞接種于培養(yǎng)板，培養(yǎng)液中分別加入待篩化合物，以不加任何抑制劑為對照，共同培養(yǎng)適當時間后反復冰融，得細胞裂解液；細胞裂解液加入含CaCl₂的人凝血酶原復合物溶液共同孵育，加入發(fā)色底物，于405nm測定吸光度，計算抑制率，抑制率大于20％的化合物為陽性化合物。本發(fā)明選用人乳腺癌細胞MDA-MB-435成功建立了快速穩(wěn)定、靈敏度高、操作簡便的抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物篩選模型，具有微量、準確的特點，適用于高通量篩選抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物。文檔編號G01N21/00GK101376907SQ20081015644公開日2009年3月4日申請日期2008年10月10日優(yōu)先權(quán)日2008年10月10日發(fā)明者余伯陽,立孫,寇俊萍,張陸勇,偉施,袁勝濤申請人:中國藥科大學