專利名稱：：人5-HT₇受體啟動子序列的制作方法人5-HT7受體啟動子序列本申請為分案申請，原申請的申請日為2003年5月26日，申請?zhí)枮?3812246.4(PCT/EP03/05511),發(fā)明名稱為"人5-HT7受體啟動子序列"。本發(fā)明涉及分離的人5-HT7受體啟動子區(qū)。本發(fā)明還涉及調(diào)節(jié)人5-HT7受體表達(dá)的試劑的篩選方法，因此本發(fā)明對于治療5-羥色胺介導(dǎo)反應(yīng)相關(guān)性醫(yī)學(xué)病癥具有潛在的應(yīng)用價值，這些醫(yī)學(xué)病癥例如精神分裂癥、抑郁癥、偏頭痛、情感障礙、睡眠障礙和胃腸功能失調(diào)。發(fā)明背景就介導(dǎo)細(xì)胞活性的受體補(bǔ)體而論，5-羥色胺(5-HT)系統(tǒng)可能是脊推動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中最多樣化神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)。迄今為止，已有14種5-羥色胺(5-HT)受體被克隆出來，并被分為7個5-HT受體亞型。除5-HT3受體(一種配體門控的離子通道)外，5-HT受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)超家族。其中，5-HT7受體是最近才被克隆出來的，盡管由于它獨(dú)特的藥理學(xué)性質(zhì)，人們一直猜想其存在。原位雜交和配體-結(jié)合方法已繪制出5-H丁7受體在CNS中的分布，并揭示其在丘腦、下丘腦和海馬中分布最豐富，而在大腦皮質(zhì)和扁桃體中水平較低(Vanhoenacker等，2000)。盡管這項(xiàng)研究深入了解了5-HT7受體的定位，但有關(guān)這些受體的生理作用的報道卻比較少?；诜沁x擇性配體的研究提出了5-HT7受體在調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律中的作用(Lovenberg等，1993;Ying和Rusak,1997)以及與睡眠障礙和抑郁癥的相關(guān)性。在慢性抗抑郁治療后，5-HT7樣結(jié)合位點(diǎn)的負(fù)調(diào)節(jié)進(jìn)一步支持這一作用。RT/PCR研究已幫助鑒定出在其預(yù)測細(xì)胞內(nèi)羧基末端中結(jié)構(gòu)上有差異的四種哺乳動物5-HT7剪接變異體(Vanhoenacker等，2000)。5-羥色胺受體的表達(dá)通常具有高度組織特異性，研究的案例中，每一個5-羥色胺受體家族成員似乎都具有腦中區(qū)域表達(dá)特征性的模式。這種受限制的表達(dá)模式可能是控制介導(dǎo)針對5-羥色胺的特異性生物反應(yīng)的臨界點(diǎn)。直到最近才證明5-H丁7受體是在涉及晝夜節(jié)律上的區(qū)即交叉上核(SCN)中表達(dá)。8-OH-DPAT是一種對5-HT7受體具有高親和性的5-HU敫動劑，用8-OH-DPAT進(jìn)行的研究也改變了倉鼠的晝夜節(jié)律(Ehlen等，2001)。這些結(jié)果表明5-HT7受體在睡眠調(diào)節(jié)中的潛在作用。按照這種限制性的表達(dá)模式，5-HT7受體成為研究其基因調(diào)節(jié)的一個有趣的候補(bǔ)者。在這一方面，已有研究表明5-HT7受體在體內(nèi)(LeCorre等，1997;Yau等1997)和體外(Shimizu等，1997)受到類固醇負(fù)調(diào)節(jié)。這種負(fù)調(diào)節(jié)在情感障礙中發(fā)揮作用，因此鑒定了有關(guān)調(diào)節(jié)序列元件是重要的。同樣，在慢性抗抑郁治療后，會出現(xiàn)5-HT7受體的負(fù)調(diào)節(jié)(Sleight等,1995;Mullins等，1999)。這一結(jié)果和其它的初步結(jié)果(Harsing等，Soc.NeuroscAbstr.380.1,2001)揭示出5-HT7受體的突觸前作用，因此該受體可能還參與控制5-羥色胺釋放的負(fù)反饋循環(huán)。就這方面而言，改善目前可利用的5-HT7受體拮抗劑的選擇性將會是有益的。5-HT7啟動子調(diào)節(jié)機(jī)制的闡明將使得能夠干預(yù)5-HT7受體的形成，并促使產(chǎn)生千擾5-HT7受體功能的藥物的新篩選策略。發(fā)明概迷本發(fā)明提供一種基本純化的5-HT7受體基因啟動子區(qū)，其核苷酸序列示于圖1(SEQIDNO:1)。本發(fā)明還涉及對人5-HT7受體啟動子的轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)節(jié)序列元件的鑒定，以及其在鑒定調(diào)節(jié)5-HT受體基因表達(dá)的化合物的篩選方法中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種含有編碼基因產(chǎn)物、與5-HT7受體啟動子區(qū)或其調(diào)節(jié)序列元件有效連接的核酸分子。本發(fā)明還提供這樣的方法在基于細(xì)胞的篩選試驗(yàn)中，使用與5-HT7受體啟動子或其調(diào)節(jié)序列元件有效連接的基因例如報道基因，鑒定能夠調(diào)節(jié)與5-HT7受體啟動子或其調(diào)節(jié)序列元件有效連接的基因表達(dá)水平的有效試劑。這類有效試劑可以按照本發(fā)明的方法進(jìn)行鑒定，即將含有與5-HT7受體啟動子或其調(diào)節(jié)序列元件有效連接的基因的核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞中；測定所述基因在含有該基因的細(xì)胞中表達(dá)的對照水平；使含有該基因的細(xì)胞與假定的有效試劑接觸；然后測定所述基因在接觸了該試劑的細(xì)胞中表達(dá)的試驗(yàn)水平，其中該表達(dá)試驗(yàn)水平相對于表達(dá)對照水平的差異將所述試劑鑒定為有效試劑。按照本發(fā)明方法所筌定的有效試劑可以是例如降低或抑制細(xì)胞中5-HT7受體基因表達(dá)的藥物，因此，該有效試劑可用于治療那些需要控制突觸前自身受體水平的疾病，例如抑郁癥。有效試劑還可以是例如增加5-HT7受體基因表達(dá)的藥物，因此，該有效試劑可用于治療以5-羥色胺反應(yīng)降j氐為特征的疾病。附圖簡述圖l說明預(yù)測的人5-HT7受體的"最小啟動子"區(qū)(SEQIDNo:l)。下劃線序列表示可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。粗體序列表示鄰接轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(I)的富含GC的區(qū)域。圖2是表示人5-HT7受體基因結(jié)構(gòu)的圖譜。外顯子用灰色矩形表示，內(nèi)含子用實(shí)線表示。短水平箭頭表示表(I)中用于檢查人5-HT7受體的內(nèi)含子-外顯子組構(gòu)部分的引物。短垂直箭頭表示翻譯起始密碼子ATG下游內(nèi)含子-外顯子邊界位置。圖3—表(II)中的啟動子序列引物對用來產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，將其克隆到ZeroBlunt克隆載體pCR2.1TOPO(Invitrogen)中；隨后該克隆片段分別通過NcoI/HindHI消化估計大小為1014bp片段，而通過Ncol/Xhol消化估計大小為2027bp片段和3011bp片段，最后被再克隆到類似消化的pGL3-basic螢光素酶報道載體(Promega)中。所得重組質(zhì)粒分別被命名為10001uc、20001uc和30001uc。圖4是一幅條形圖，顯示HEK293T細(xì)胞在用150ng不同啟動子構(gòu)建體瞬時轉(zhuǎn)染后所獲得的相對螢光素酶值。該luc+構(gòu)建體含有83bp增強(qiáng)子片段(SEQIDNo:2)。圖5是恰好位于翻譯起始密碼子ATG上游的人5-HT7受體啟動子序列片段(SEQIDNo:5)。下劃線序列是83bpNcoI-片段(SEQIDNo:2)?？騼?nèi)序列是包含AP2-結(jié)合基序的30bp寡核苷酸序列(SEQIDNo:4)，如水平箭頭所指。還標(biāo)出了轉(zhuǎn)錄因子NRSF、SREB、Myf5和c-ETS的可能結(jié)合基序。圖6A是一幅條形圖，顯示1.5mM異戊巴比妥或苯巴比妥對HEK293T細(xì)胞的相對螢光素酶值影響，該HEK293T細(xì)胞事先已用150ng的20001uc+和10001uc+啟動子構(gòu)建體進(jìn)行了瞬時轉(zhuǎn)染。用CMVluc作為對照載體。轉(zhuǎn)染后的24小時周期內(nèi)，測量用所述巴比妥鹽處理的細(xì)胞的螢光素酶活性。圖6B是一幅條形圖，顯示對HEK293T細(xì)胞的時程實(shí)驗(yàn)，該HEK293T細(xì)胞事先已用150ng的載體20001uc+和10001uc+瞬時轉(zhuǎn)染并且用1.5mM苯巴比妥進(jìn)行了處理，誘導(dǎo)時間范圍從1.5小時至52小時。圖7是一幅條形圖，顯示用150ng具有不同長度的5-HT7啟動子構(gòu)建體瞬時轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞和NS20Y細(xì)胞的相對螢光素酶值。圖8是人5，UTR區(qū)或小鼠5，UTR區(qū)的序列比對，在該區(qū)域內(nèi)啟動子活性增加最多(271bp-653bp)。矩形框和橢圓形框分別表示推定的Egr-l和Spl/MAZ的結(jié)合位置。圖9A是一幅條形圖，顯示用富含GC的區(qū)2331uc和不同濃度的轉(zhuǎn)錄因子CMV-Spl轉(zhuǎn)染的NS20Y細(xì)胞的相對螢光素酶值(灰色條)。不同濃度的由Spl結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Spl-BD)構(gòu)成的顯性失活構(gòu)建體顯示對5-HT7啟動子活性有負(fù)效應(yīng)(黑色條)。圖9B是一幅條形圖，顯示用富含GC的區(qū)2331uc和不同濃度的轉(zhuǎn)錄因子CMV-Egr-l轉(zhuǎn)染的NS20Y細(xì)胞的相對螢光素酶值(灰色條)。不同濃度的由Zn-Egr-l(Zn-Egr-1由Egrl的Zn指結(jié)構(gòu)域構(gòu)成)構(gòu)成的顯性失活構(gòu)建體對5-HT7啟動子活性有負(fù)效應(yīng)(黑色條)。圖IOA是一幅條形圖，顯示用F10001uc構(gòu)建體和不同濃度的轉(zhuǎn)錄因子Spl和/或Egr-1轉(zhuǎn)染的NS20Y細(xì)胞的相對螢光素酶值。當(dāng)Spl保持恒定在500ng時，濃度遞增的Egr-1對啟動子活性有負(fù)效應(yīng)(白色條)。圖IOB是一幅條形圖，顯示用F10001uc構(gòu)建體和不同濃度的轉(zhuǎn)錄因子Spl和/或Egr-1轉(zhuǎn)染的NS20Y細(xì)胞的相對螢光素酶值。當(dāng)Egr-1保持恒定在500ng時，濃度遞增的Spl對啟動子活性有負(fù)效應(yīng)(白色條)。圖IIA是一幅條形圖，顯示用F10001uc構(gòu)建體轉(zhuǎn)染并用不同濃度的光神霉素A處理24小時的NS20Y細(xì)胞的相對螢光素酶值。圖11B顯示光神霉素A(泳道(l)-、泳道(2)10nM、泳道(3)100nM、泳道(4)500nM、泳道(5)1jiM、泳道(6)2jaM、泳道(7)5^iM)對人星形細(xì)胞瘤細(xì)胞系1321-N1的內(nèi)源性5-HT7mRNA水平的影響。詳細(xì)描述本發(fā)明涉及構(gòu)成人5-HT7受體啟動子的核酸分子及所述啟動子的片段，該5-HT7受體啟動子由SEQIDNo:l的核苷酸1-3081組成，所述啟動子的片段具有5-HT7受體啟動子活性。在所述基因這一以前未知的區(qū)域中，鑒定出與調(diào)節(jié)功能一致的差別保守區(qū)，在下文稱為"調(diào)節(jié)元件，，或"調(diào)節(jié)序列元件"。所述序列(也稱為效應(yīng)元件)的特征部分在于它們調(diào)節(jié)連鎖基因的表達(dá)，并由于轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合或釋放而被激活。調(diào)節(jié)元件和轉(zhuǎn)錄因子的多個實(shí)例是本文中公開的或者是本領(lǐng)域已知的。本文中公開的5-HT7受體啟動子包括例如調(diào)節(jié)增強(qiáng)子，在下文稱為83bpNcoI-片^:。5-HT7受體啟動子序列(圖1)的位置-27至-110(SEQIDNo:2)所示的序列對所述啟動子序列的調(diào)節(jié)活性有正效應(yīng)。在一個進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供圖1的5-HT7啟動子序列的位置-50至-80(SEQIDNo.:4)的AP2結(jié)合基序。本發(fā)明還包括巴比妥鹽誘導(dǎo)型元件，在下文稱為BARBIE。在瞬時轉(zhuǎn)染試驗(yàn)中，在巴比妥鹽例如苯巴比妥或異戊巴比妥存在下，顯示5-HT7受體啟動子序列的位置-925至-939(SEQIDNo:3)所示的序列阻抑5-HT7受體啟動子活性。本發(fā)明還包括一個富含GC的基序。顯示鑒定為5-H丁7啟動子位置-404至-637(SEQIDNo:6)的序列在轉(zhuǎn)錄因子Egr-l和Spl的影響下具有5-HT7啟動子調(diào)節(jié)活性。本發(fā)明說明書中所涉及的"負(fù)核苷酸位置"是位于翻譯用ATG起始密碼子上游5-HT7受體啟動子區(qū)(圖l)內(nèi)的核苷酸位置，其中A等于位置l，而前面的核苷酸等于位置-1。預(yù)期對5-HT7受體調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié)對以下疾病具有治療價值精神分裂癥、抑郁癥、情感障礙和睡眠障礙、偏頭痛、IBS和胃腸功能失調(diào)。因此，在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的人5-HT7受體啟動子區(qū)，所述5-HT7受體啟動子區(qū)包含選自以下的序列(a)SEQIDNo:l的核苷酸1-3081、位置-110至-1124所示的核苷酸序列(10001uc構(gòu)建體的邊界序列)、位置-27至-1124所示的核苷酸序列(10001uc+構(gòu)建體的邊界序列)、位置-1至-U24所示的核苷酸序列(F10001uc構(gòu)建體的邊界序列)、位置-110至-2137所示的核苷酸序列(20001uc構(gòu)建體的邊界序列)、位置-27至-2137所示的核苷酸序列(20001uc+構(gòu)建體的邊界序列)、位置-1至-2137所示的核苷酸序列(F20001uc構(gòu)建體的邊界序列)、位置-110至-3081所示的核苷酸序列(30001uc構(gòu)建體的邊界序列)、位置-27至-3081所示的核苷酸序列(30001uc+構(gòu)建體的邊界序列)、位置-27至-3081所示的核苷酸序列(30001uc+構(gòu)建體的邊界序列)或SEQIDNO:1中位置-404至-637所示的核苷酸序列(2331uc構(gòu)建體的邊界序列)，或其顯示5-HT7受體啟動子活性的片段；(b)(a)的互補(bǔ)鏈；和(c)能夠在嚴(yán)格性雜交條件下與(a)或(b)所定義的核香酸序列雜交的核苷酸序列。"啟動子區(qū)"是指有效控制一個或多個基因轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)，依據(jù)依賴DNA的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)的存在，以及依據(jù)同一分子上相互作用來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的其它DNA序列的存在，對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。"分離的"當(dāng)涉及核酸時是指多核苷酸，包括從天然來源分離的或合成的RNA或DNA。本發(fā)明的分離的核酸在它們在自然中不以純的或獨(dú)立的狀態(tài)存在的意義上是獨(dú)特的。術(shù)語"分離的"的應(yīng)用說明，已從其正常細(xì)胞環(huán)境中分離出天然存在的序列。因此，所述序列可能存在于無細(xì)胞溶液中，或被置于不同的細(xì)胞環(huán)境或核酸序列中。"嚴(yán)格性"雜交條件是在6XSSC中約45。C雜交，然后在65。C,用0.2XSSC、0.P/。SDS洗滌一次或多次。本發(fā)明的另一方面是一種包含如上定義的人5-HT7受體啟動子區(qū)的重組DNA分子。在所述重組DNA分子中，人5-HT7受體啟動子區(qū)可以與編碼可檢測產(chǎn)物的核酸分子例如人5-HT7受體基因或報道基因有效連接。本文所用的術(shù)語"有效連接的，，是指使啟動子與基因在正確讀框內(nèi)功能性融合，以表達(dá)處于該啟動子控制之下的基因。本文所用的術(shù)語"報道基因，，是指編碼可以用簡單、便宜的方法或試劑鑒定的基因產(chǎn)物、并且可以與人5-HT7受體啟動子區(qū)或其活性片段有效連接的基因?？梢杂脠蟮阑蛑T如螢火蟲螢光素酶報道基因、卩-半乳糖苷酶4艮道基因、堿性磷酸酶報道基因、細(xì)菌氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶報道基因或綠色熒光蛋白報道基因等在依照本發(fā)明的篩選試驗(yàn)中測定轉(zhuǎn)錄活性(參見例如Goeddd(主編)，MethodsEnzymol.，第185巻:SanDiego:AcademicPress,Inc.(1990);另見Sambrook，參見上文)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述報道基因是螢火蟲愛光素酶基因或綠色熒光蛋白基因。本發(fā)明還提供一種包含如上定義的重組DNA分子的載體以及用所述載體或一般用依照本發(fā)明的重組DNA分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。術(shù)語"載體"是指外源DNA的任何載體，所述載體可用于將DNA轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中，以由所述宿主細(xì)胞復(fù)制和/或適當(dāng)表達(dá)所述外源DNA。因此，在一個具體的實(shí)施方案中，所述載體是一種表達(dá)載體如pGL31uc、pBLCAT5(LMBP2451)、pGMCSFlacZ(LMBP2979)、pEGFP或基于pSEAP(DMB3115)，其中LMBP和DMB編號是指這些表達(dá)載體在比利時微生物協(xié)調(diào)保藏中心(BelgianCo-ordinatedCollectionsofMicro-organisms)的保藏號。另一方面，本發(fā)明提供一種用于鑒定能能夠調(diào)節(jié)5-HT7受體啟動子活性的化合物的方法，所述方法包括下述步驟(i)使候選試劑與如上定義的人5-HT7受體啟動子區(qū)接觸；和(ii)確定所述候選試劑是否調(diào)節(jié)所述可檢測產(chǎn)物的表達(dá)，這種調(diào)節(jié)說明該試劑能夠調(diào)節(jié)5-HT7受體啟動子活性。所述可檢測產(chǎn)物或是指5-H丁7受體蛋白，或是指才艮道基因的產(chǎn)物，例如螢光素酶、P-半乳糖苷酶或綠色熒光蛋白?？蓹z測產(chǎn)物的定量方法是本領(lǐng)域公知的，其中包括使用顯色底物(如果表達(dá)產(chǎn)物為酶的話)、使用特異性抗體(在RIA或ELISA測定中)或者測量從與所述啟動子有效連接的基因所轉(zhuǎn)錄的mRNA水平，其中所述mRNA可以用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行直接或間接測定。本文所用的術(shù)語"化合物，，或"試劑，，是指生物學(xué)的或化學(xué)的化合物，例如簡單的或復(fù)雜的有機(jī)分子、肽、蛋白質(zhì)或寡核苷酸。本文所用的"試驗(yàn)化合物"是指在依照本發(fā)明的方法中所用的"化合物"或"試劑，，，以評價所述化合物是否調(diào)節(jié)5-HT7受體啟動子活性或與其"調(diào)節(jié)元件，，相互作用。轉(zhuǎn)染試驗(yàn)對于鑒定調(diào)節(jié)和/或調(diào)控5-HT7受體啟動子活性的有效試劑可以是特別有用的篩選試驗(yàn)。在轉(zhuǎn)染試驗(yàn)中，將編碼與人S-HT7受體啟動子或其活性片段有效連接的基因(例如報道基因)的核酸轉(zhuǎn)染到所需細(xì)胞類型中。在候選試劑存在下，分析報道基因表達(dá)的試驗(yàn)水平，并與表達(dá)的對照水平進(jìn)行比較。報道基因表達(dá)的對照水平是在沒有候選試劑的情況下測定的表達(dá)水平，如果候選試劑所產(chǎn)生的報道基因表達(dá)的試驗(yàn)水平與對照水平不同，則該候選試劑就可被確定為有效試劑。用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法和多種便利的報道基因是本領(lǐng)域眾所周知的(參見例如Goeddel(主編)，MethodsEnzymol.,第185巻，SanDiego:AcademicPress,Inc.(1990);另見Sambrook,參見上文)。因此，所述方法可以例如包括在存在和不存在候選試劑的情況下，用包含人5-HT7受體啟動子的重組DNA分子瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，分析所述宿主細(xì)胞中報道基因的表達(dá)，其中與表達(dá)的對照水平相比，候選試劑如對表達(dá)的試驗(yàn)水平具有作用，那么就表示該試劑具有調(diào)節(jié)5-HT7受體啟動子活性的能力。在本實(shí)驗(yàn)程序中提供了一個具體的實(shí)施方案，其中將不同的5-HT7受體啟動子片段與螢火蟲螢光素酶連接。調(diào)節(jié)5-HT7受體啟動子活性的多肽的鑒定方法可以包括本領(lǐng)域已知的多項(xiàng)技術(shù)，例如用于鑒定與5-HT7受體調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合的蛋白的電泳遷移率變動分析(EMSA)(DignamD.等(1983)Nucl.AcidsResearch11,1475-1489);例如用于鑒定5-HT7受體調(diào)節(jié)區(qū)內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合特異性序列的酵母單雜交系統(tǒng)；用"southwestern"克隆策略進(jìn)行與調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合的蛋白質(zhì)的生物化學(xué)純化(參見例如Hai等(l兆9)Genes&Development3:2083-2090),在此方案中，誘導(dǎo)用"噬菌體文庫"感染的細(xì)菌庫表達(dá)編碼蛋白并用放射性DNA序列從5-HT7受體調(diào)節(jié)區(qū)中探測此細(xì)菌文庫，以鑒定結(jié)合蛋白。再一方面，本發(fā)明提供5-HT7受體啟動子區(qū)的分離的調(diào)節(jié)元件，所述調(diào)節(jié)元件包含選自以下的序列(a)SEQIDNo:1中位置-27至-110(SEQIDNo:2)所示的核苷酸序列，或其顯示5-H丁7受體增強(qiáng)子活性的片段；(b)SEQIDNo:1中位置-925至-939(SEQIDNo:3)所示的核苷酸序列，或其顯示巴比妥鹽誘導(dǎo)型元件活性的片段；(c)SEQIDNo:1中位置-50至-80(SEQIDNo:4)所示的核苷酸序列，或其顯示5-HT7受體啟動子調(diào)節(jié)活性的片段；(d)SEQIDNo:1中位置-404至-637(SEQIDNo:6)所示的核苦酸序列，或其顯示5-HT7受體啟動子調(diào)節(jié)活性的片段；(e)(a)、(b)、(c)或(d)的互補(bǔ)鏈;和(f)能夠在嚴(yán)格性雜交條件下與(a)、(b)、(c)或(d)所定義的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。如上面對5-HT7受體啟動子區(qū)所描述的，本發(fā)明還提供包含前述的調(diào)節(jié)元件之一的重組DNA分子，所述調(diào)節(jié)元件與編碼可檢測產(chǎn)物的核酸分子有效連接。所述可檢測產(chǎn)物可以是5-HT7受體多肽，或者是報道基因，例如螢火蟲螢光素酶基因、堿性磷酸酶基因、細(xì)菌氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、綠色熒光蛋白基因或(3-半乳糖苷酶基因。那些缺少最小啟動子元件、并且同樣地不能夠調(diào)節(jié)其連鎖基因表達(dá)的調(diào)節(jié)元件能夠與包含最小啟動子的報道質(zhì)粒有效連接，這些最小啟動子例如最小的白介素6(IL6)啟動子(phu.IL6P-501uc+畫Plaisance等(1997)MCB17,3733-3743)、最小的E1B啟動子(pMCSLuc-Stratagene)或螢光素酶的TK啟動子(pTKLuc-Promega)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組分子包含選自83bpNcoI-片段(SEQIDNo:2)、BARBIE元件(SEQIDNo:3)或233bp富含GC的基序(SEQIDNo:6)的分離的核酸分子。此外，本發(fā)明提供能夠調(diào)節(jié)5-HT7受體啟動子調(diào)節(jié)元件活性或與其相互作用的化合物的鑒定方法，所述方法包括下述步驟(i)使試驗(yàn)化合物與如上定義的人5-HT7受體啟動子調(diào)節(jié)元件接觸；和(ii)確定所述候選試劑是否調(diào)節(jié)5-HT7受體基因的表達(dá)，這種調(diào)節(jié)說明該試劑能夠調(diào)節(jié)5-HT7受體啟動子調(diào)節(jié)元件的活性或與其相互作用。因此，本發(fā)明提供一種分離的人5-HT7受體增強(qiáng)子區(qū)，所迷人5-HT7受體增強(qiáng)子區(qū)包含選自以下的序列(a)SEQIDNo:1中位置-27至-110(SEQIDNo:2)所示的核普酸序列，或其顯示5-HT7受體增強(qiáng)子活性的片段；(b)SEQIDNo:1中位置-404至-637(SEQIDNo:6)所示的核普酸序列，或其顯示5-HT7受體增強(qiáng)子活性的片段；(c)(a)或(b)的互補(bǔ)鏈；和(d)能夠在嚴(yán)格性雜交條件下與(a)、(b)或(c)所定義的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。"增強(qiáng)子區(qū)"是指有效控制一個或多個基因轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)。如上對人5-HT7受體啟動子區(qū)所描述的，本發(fā)明還提供包含人5-H丁7受體增強(qiáng)子區(qū)的重組DNA分子、包含所述重組DNA分子的載體以及用所述載體或所述重組DNA分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。此外，本發(fā)明提供一種用于鑒定能夠調(diào)節(jié)5-HT7受體啟動子活性的化合物的方法，所述方法包括下述步驟(i)使試驗(yàn)化合物與如上定義的人5-HT7受體增強(qiáng)子區(qū)接觸；和(ii)確定所述試驗(yàn)化合物是否調(diào)節(jié)所述5-HT7受體基因的表達(dá)，這種調(diào)節(jié)說明該試劑能夠調(diào)節(jié)5-HT7受體啟動子活性。技術(shù)人員將會知道，能用已知的步驟履行這一方法。例如可以使用包含一系列突變和缺失的構(gòu)建體"組"能將反應(yīng)與調(diào)節(jié)裝置的單堿基或亞節(jié)的特異性改變聯(lián)系起來。一個簡單的組包括增強(qiáng)子加上啟動子、單獨(dú)的啟動子、增強(qiáng)子加上來源千特殊基因的"最小的"啟動子。如上所述，用以合適的重組DNA分子穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞所進(jìn)行的轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，尤其可用于鑒定有效試劑的篩選試驗(yàn)中。本發(fā)明更進(jìn)一步的方面是包含依照本發(fā)明的核酸分子的載體。所述載體可以是例如那些能夠攜帶依照本發(fā)明的DNA分子并能夠介導(dǎo)DNA分子表達(dá)的復(fù)制型表達(dá)載體。在本文中，術(shù)語"復(fù)制型"表示載體能夠在已導(dǎo)入該載體的給定類型的宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制。載體的實(shí)例是病毒如噬菌體、粘粒、質(zhì)粒和其它重組體載體。用本領(lǐng)域眾所周知的方法將核酸分子插入到載體基因組中。本發(fā)明還包括攜帶依照本發(fā)明的載體的培養(yǎng)宿主細(xì)胞。這種宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞、單細(xì)胞真核細(xì)胞或來源于多細(xì)胞生物的細(xì)胞。因此，這種宿主細(xì)胞可以例如是細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌(五.CO//)細(xì)月包；酵母細(xì)月包，如釀酒酵母(Sacc/zaraw;;c^cerev!'w'ae)或巴斯德畢赤酵母(尸Zc/z/"/7aWonX);或哺乳動物細(xì)胞，如HEK293細(xì)胞。將載體有效導(dǎo)入宿主細(xì)胞中所用的標(biāo)準(zhǔn)方法是熟悉重組DNA技術(shù)的技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法。下面列舉的優(yōu)選細(xì)胞包括HEK293細(xì)胞、NS20Y細(xì)月包或N2A細(xì)月包。因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種用于鑒定能夠調(diào)節(jié)5HT7受體啟動子活性的化合物的方法，所述方法包括(a)使包含依照本發(fā)明的重組DNA分子的宿主細(xì)胞與試驗(yàn)化合物接觸；和(b)確定所述試驗(yàn)化合物是否調(diào)節(jié)所述可檢測產(chǎn)物的表達(dá)水平。上述方法中的重組DNA分子最好包含選自以下的分離的核酸分子(a)SEQIDNo:1中位置-27至-110(SEQIDNo:2)所示的核苷酸序列，或其顯示5-H丁7受體增強(qiáng)子活性的片段；(b)SEQIDNo:1中位置-925至-939(SEQIDNo:3)所示的核苷酸序列，或其顯示巴比妥鹽誘導(dǎo)型元件活性的片段；或(c)SEQIDNo:1中位置-404至-637(SEQIDNo:6)所示的核苷酸序列，或其顯示5-H丁7受體啟動子調(diào)節(jié)活性的片段。因此，本發(fā)明提供一種用于鑒定能夠調(diào)節(jié)5H丁7受體啟動子增強(qiáng)子活性的化合物的方法，所述方法包括(a)使用重組DNA分子轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞與試驗(yàn)化合物接觸，該重組DNA分子包含與可檢測產(chǎn)物有效連接的83bpNcoI-片段(SEQIDNo:2);和本發(fā)明提供一種用于鑒定能夠調(diào)節(jié)5HT:受體啟動子區(qū)內(nèi)巴比妥鹽誘導(dǎo)型元件活性的化合物的方法，所述方法包括(a)使用重組DNA分子轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞與試驗(yàn)化合物接觸，所述重組DNA分子包含與可4僉測產(chǎn)物有效連接的BARBIE元件(SEQIDNo:3);和本發(fā)明提供一種用于鑒定能夠調(diào)節(jié)5H丁7受體啟動子區(qū)內(nèi)巴比妥鹽誘導(dǎo)型元件活性的化合物的方法，所述方法包括(a)使用重組DNA分子轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞與試驗(yàn)化合物接觸，所述重組DNA分子包含與可檢測產(chǎn)物有效連接的富含GC的基序(SEQIDNo:6);和在一個可供選擇的實(shí)施方案中，上述試驗(yàn)包括一個結(jié)合試驗(yàn)，其中將轉(zhuǎn)錄因子作為5HT7受體啟動子調(diào)節(jié)元件的特異性配體使用。因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種用于鑒定能夠調(diào)節(jié)5HT7受體啟動子增強(qiáng)子活性的化合物的方法，所述方法包括(a)在轉(zhuǎn)錄因子存在下，使包含依照本發(fā)明的5-H丁7受體啟動子調(diào)節(jié)元件的重組DNA分子與試驗(yàn)化合物接觸；和(b)確定所述試驗(yàn)化合物是否影響所述轉(zhuǎn)錄因子與所述調(diào)節(jié)元件的結(jié)合。具體地說，本發(fā)明提供一種用于鑒定能夠調(diào)節(jié)5HT7受體啟動子增強(qiáng)子活性的化合物的方法，所述方法包括(a)在轉(zhuǎn)錄因子AP2存在下，使包含83bpNcoI-片段(SEQIDNo:2)的重組DNA分子與試驗(yàn)化合物接觸；和(b)確定所述試驗(yàn)化合物是否影響所述轉(zhuǎn)錄因子與83bp增強(qiáng)子區(qū)(SEQIDNo:2)的結(jié)合。在一個進(jìn)一步的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于鑒定能夠調(diào)節(jié)5HT7受體啟動子增強(qiáng)子活性的化合物的方法，所述方法包括(a)在轉(zhuǎn)錄因子Spl或Egr-l存在下，使包含富含GC的基序(SEQIDNo:6)的重組DNA分子與試驗(yàn)化合物接觸；和(b)確定所述試驗(yàn)化合物是否影響所述轉(zhuǎn)錄因子與所述富含GC的基序(SEQIDNo:6)的結(jié)合。測定轉(zhuǎn)錄因子與其識別位點(diǎn)結(jié)合的方法是本領(lǐng)域已知的，并且包括例如下文實(shí)驗(yàn)部分中所概述的凝膠移位分析。又一方面，本發(fā)明包括一用鑒定能夠調(diào)節(jié)如上定義的核酸分子表達(dá)的試劑的方法，所述方法包括下述步驟(i)使候選試劑與所述核酸分子與接觸；和(ii)確定所述候選試劑是否調(diào)節(jié)所述核酸分子的表達(dá)。例如通過用病毒載體或膠態(tài)分散系統(tǒng)如脂質(zhì)體，將能夠與5-HT7受體基因的控制序列特異性地結(jié)合的反義核酸或siRNA(優(yōu)選10-25個堿基對寡核苷酸)導(dǎo)入細(xì)胞中。該反義核酸或siRNA與細(xì)胞中的靶核普酸序列結(jié)合，并阻止所述靶序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。本發(fā)明特別考慮了硫代磷酸酯和曱基磷酸酯反義寡核香酸的治療用途。或在轉(zhuǎn)錄水平或在翻譯水平上抑制5-HT7受體基因的表達(dá)，可用于產(chǎn)生5-羥色胺介導(dǎo)反應(yīng)相關(guān)的疾病/或病癥的細(xì)胞或動物;模型。又一方面，本發(fā)明提供一種用于鑒定多肽分子的方法，該多肽與參與5-羥色胺介導(dǎo)反應(yīng)相關(guān)的生物途徑的核苷酸序列結(jié)合，所述方法包括下述步驟(a)用與報道基因(如編碼綠色熒光蛋白(GFP)的基因)連接的人5-HT7受體啟動子核苷酸序列轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞系(有關(guān)綜述參見例如Galbraith等(1999)MethodsinCellBiology58:315-341);(b)用多種人cDNA序列如cDNA文庫所包含的序列轉(zhuǎn)染所述宿主細(xì)月包系；(c)鑒定并分離(例如采用FACS細(xì)胞分選法)所述報道基因的表達(dá)水平有改變的細(xì)胞，說明由添加的cDNA編碼的多肽能夠正調(diào)節(jié)或負(fù)調(diào)節(jié)至少一種參與5-羥色胺介導(dǎo)反應(yīng)相關(guān)的生物途徑的基因；(d)用標(biāo)準(zhǔn)方法例如PCR或CRE-LOX介導(dǎo)的方法(參見例如Sauer(1998)Methods14:381-392),從步驟(c)所分離的細(xì)胞中回收cDNA;和(e)鑒定步驟(d)回收的cDNA所表達(dá)的多肽，例如通過對cDNA進(jìn)行測序并將所獲得的序列與序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較。在本發(fā)明說明書中，術(shù)語"標(biāo)準(zhǔn)方法"、"標(biāo)準(zhǔn)方案"和"標(biāo)準(zhǔn)程序，'，當(dāng)用于分子生物學(xué)技術(shù)的情況下，可理解為能在普通實(shí)驗(yàn)室手冊中查找到的方案和程序，例如CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.Ausubel等編著，JohnWileyandSons,Inc.1994和Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,MolecularCloning:Alaboratorymanual,第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室印刷，冷泉港紐約1989。參考后面的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，將能更好地理解本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解，同所附權(quán)利要求書更全面描述的一樣，這些僅用于說明本發(fā)明。另外，在本申請中，引用了不同的出版物。這些出版物的公開內(nèi)容通過引用結(jié)合到本申請中，以更全面描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的現(xiàn)狀。實(shí)驗(yàn)程序人5-HT7受體基因組克隆的鑒定用已知的5-HT75-羥色胺受體的cDNA序列(GI:17864131)搜索NCBI-數(shù)據(jù)庫(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。我們鑒定出一個BAC克隆(GI:14547262):來自10號染色體上RPll-103A2的人DNA序列，是含有5-HT7受體的完全編碼序列的完整序列?；贐AC序列信息，設(shè)計引物以確認(rèn)在得自SangerCentre的BAC克隆中存在5-H丁7外顯子。引物序列示于表l。在起始變性步驟(90。C，5分鐘)后，使用PfuDNA聚合酶(Promega)進(jìn)行PCR的25個循環(huán)(變性步驟94°C1分鐘，退火步驟59°C1分鐘，延伸步驟68。C10分鐘)。采用Cre-LoxP技術(shù)，由RichardWade-Martins進(jìn)行再次克隆到基于EBV的載體中。啟動子構(gòu)建體和質(zhì)粒基于BAC序列，設(shè)計引物以產(chǎn)生三種不同長度的5，側(cè)翼區(qū)(表11)。全部的片段都是按照下面的方案用Pfu聚合酶產(chǎn)生的。進(jìn)行PCR的30次循環(huán)，每次循環(huán)為94。Cl分鐘、48。Cl分鐘、72。C4分鐘。將所得的PCR產(chǎn)物克隆到零點(diǎn)平端克隆載體pCR2.1TOPO(Invitrogen)上，并通過序列分析證實(shí)幾個克隆。對于亞克隆，將一個NcoI/HindE消化的1014bp片段或Ncol/Xhol消化的2027bp片段和3011bp片段連接到一個類似消化的pGL3-basic螢光素酶報道載體(Promega)上。將所得質(zhì)粒分別命名為1000luc、2000luc和3000luc(圖3)。由于這一克隆策略，所有構(gòu)建體都缺少翻譯起始位點(diǎn)正上游的110bp。一個新的83bp片段被成功地亞克隆到三個報道構(gòu)建體中，產(chǎn)生了質(zhì)粒1000luc+、2000luc+和3000luc+。用序列分析證實(shí)所插入的83bp的方向。分別用缺少啟動子區(qū)和增強(qiáng)子區(qū)的pGL3-basic和其中螢光素酶處于強(qiáng)CMV啟動子控制之下的CMVluc作為陰性對照和陽性對照。用pNeogal校正轉(zhuǎn)染效率的變動。在所有這三個質(zhì)粒中，以正確位置和方向插入與在質(zhì)粒1000luc+、2000luc+和3000luc+中所缺少的27bp具有相同身份的接頭序列，產(chǎn)生構(gòu)建體F1000luc、F2000luc和F3000luc。在下文中被稱為233luc構(gòu)建體的233bpluc片段，是用BamHI/Bgll從F1000luc構(gòu)建體中切下233bp產(chǎn)生的。經(jīng)Klenow處理后，將所得的233bp片段克隆到Ncol開放和平端化的pGL3luc載體中，并用序列分析確證序列和方向。細(xì)胞培養(yǎng)和瞬時表達(dá)試驗(yàn)將HEK293T細(xì)胞維持在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基補(bǔ)充了100單位/ml青霉素、100)ig/ml鏈霉素和10%新生小牛血清。將這些細(xì)胞在含5%的C02的濕潤氣氛中維持在37°C。采用標(biāo)準(zhǔn)磷酸鈣共沉淀法，在24孔培養(yǎng)皿中，用150ng啟動子質(zhì)粒和50ngneogal(作為內(nèi)部對照)轉(zhuǎn)染105細(xì)胞/cm2。轉(zhuǎn)染后24小時，細(xì)胞用PBSA洗滌一次，然后在150pL100mM磷酸鉀(pH7.8)、0.2%TritonX-100中進(jìn)行裂解。按照前面介紹的方法(VandenBerghe等，1998),分析該樣品的螢光素酶活性。用GalactoStar(Tropix)作為底物，測定P-半乳糖苷酶活性。對于巴比妥鹽實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24小時，開始用不同的巴比妥鹽進(jìn)行處理。對于CMV-AP2過度轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，采用磷酸鉤方法，用12嗎CMV-AP2質(zhì)粒(R.Tjian贈送)轉(zhuǎn)染3x106HEK293T細(xì)胞。將N2A細(xì)胞和NS20Y細(xì)胞維持在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基中，該Eagle培養(yǎng)基補(bǔ)充了100單位/ml青霉素、100pg/ml鏈霉素、和10%胎牛血清。將這些細(xì)胞在含5%的C02的濕潤氣氛中維持在37。C。使用陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑JetPEI(Qbiogene)，在6孔培養(yǎng)皿中，用500-1OOOng啟動子構(gòu)建體和300ngneogal(作為內(nèi)部對照)轉(zhuǎn)染4x105細(xì)胞。在用Egr畫l、Zn-Egr-l、Spl和BD-Spl的共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中,用JetPEI轉(zhuǎn)染4x105NS20Y細(xì)胞或N2A細(xì)胞，DNA含量示于附圖中(總是用pcDNA3將各孔中的DNA總量校正到相同水平)。細(xì)胞用不同濃度的光神霉素A處理24小時。凝膠移位分析如上所述，用裂解緩沖液制備不同細(xì)胞系的總提取物。通過Ncol消化，從TOPO2138構(gòu)建體中分離出83bp探針。按照以下方案，通過使5'-GAGGTGAAGCCCCGGGGCCGGCAG-3'和5'-CCGGTGCCGGCCCCGGGGCTTCA-3'退火，產(chǎn)生30bp序列，退火方案為94。C10分鐘、70。C10分鐘、5(TC10分鐘、30。C20分鐘和4。C10分鐘。使用KlenowDNA聚合酶(Promega)，用[a-32P]dCTP對DNA片段進(jìn)行末端標(biāo)記。在含有50mMHepes(pH7.9)、375mMKC12、12.5mMMgCl2、0.5mMEDTA、5mMDTT和15%Ficoll的20|iL最終體積中進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。將細(xì)胞提取物在反應(yīng)緩沖液中在水上預(yù)溫育10分鐘，然后加入標(biāo)記的DNA纟笨4f,在室溫下繼續(xù)溫育15分鐘。竟?fàn)幮詫?shí)驗(yàn)中，在加入標(biāo)記的83bp探針之前，加入過量的未標(biāo)記的30bp探針。用0.5xTBE中6%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳2小時。用Biorad分子圖像儀分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。人5-HT7受體基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的鑒定按照生產(chǎn)商的方案(Ambion),用RLM-RACE技術(shù)進(jìn)行5'RACE。用小牛腸磷酸酶(CIP)(Ambion)處理10ug的人胎兒腦總RNA(Stratagene)，從分子例如核糖體RNA、片,殳mRNA、tRNA和污染的基因組DNA中去除游離的5'磷酸。經(jīng)過苯酚:氯仿(Invitrogen)提取后，RNA被沉淀并溶解在ll)aL無核酸酶的水中。取5iaL用2liL的煙草酸焦磷酸酶(TAP)(Ambion)在20pL的總體積中37。C處理1小時。TAP從全長度的mRNA中去除帽結(jié)構(gòu)，留下5'—磷酸。然后，用5pLCIP/TAP-處理的RNA、1(^L5'RACE接頭和2(iLT4RNA連接酶(Ambion)在20|aL的總體積中于37。C反應(yīng)1小時，將一個45堿基的RNA接頭寡核苷酸(5'畫GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA-3')連接到RNA群。然后，用隨機(jī)引物(Ambion)和M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Ambion)，在42。C下將該連接的RNA用于反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)一小時。用l(iL該cDNA，進(jìn)行三次連續(xù)的嵌套PCR反應(yīng)。用一個接頭特異性的外部引物(5'-GCTGATGGCGATGAATGAACACTG-3')和一個基因特異性引物Bl(5'-GGTGGTGGCTGCTTTCTGTTCTCGCTTAAA-3')進(jìn)行第一次PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)是在最終體積為50pL、在以下條件下進(jìn)行的94°C30秒、60°C30秒、和72。C1分鐘(35次循環(huán))。然后，在第二次嵌套PCR反應(yīng)中，在如上同樣的條件下，用接頭特異性的外部引物(見后)和基因特異性外部引物(5'-ATGACGTCCATGGCGATGAA-3'),對十分之一的PCR混合物進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)增反應(yīng)。最后用接頭特異性的內(nèi)部引物(5'-CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG-3')和基因特異性的內(nèi)部引物(5'-GATGGAGCCGATCACAACTT-3')，再釆用同樣的PCR條件，將十分之一的該P(yáng)CR擴(kuò)增的混合物用于第三次嵌套PCR反應(yīng)。將5|tiL的最終PCR反應(yīng)物克隆到TOPOTA克隆載體pCR2.1TOPO(Invitrogen)上，用序列分析確證陽性克隆。內(nèi)源性5-HTzmRNA水平的RT-PCR分析將人星形細(xì)胞瘤細(xì)胞接種到58cn^的培養(yǎng)皿中；接種后12小時，或用單純的培養(yǎng)基(-)，或用含10nM、100nM、500nM、l|uM，2pM或5uM光神霉素A(Serva)的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。用RNeasy總RNA分離試劑盒(Qiagen)來分離總RNA。用AMV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega)合成cDNA。然后在總體積30(aL包含10pmol的每一引物、200^MdNTP、TaqDNA聚合酶緩沖液、2，5單位的Taq和5pL的cDNA的混和溶液中，用PCR對cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR的條件為94。C,30秒；56。C，l分鐘；72。C，2分鐘；35次循環(huán)。通過6%的聚丙烯酰胺凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。5-HTy正向引物Fl:GGAACAGATCAACTACGGCAGAGT5-HT7反向引物B1:GGTGGTGGCTGCTTTCTGTTCTCGCTTAAA用F1和B1產(chǎn)生一個780bpPCR產(chǎn)物GAPDH正向引物ACCACAGTCCATGCCATCACGAPDH反向引物TCCACCACCCTGTTGCTGTA用GAPDH引物產(chǎn)生一個420bpPCR產(chǎn)物結(jié)果基因組克隆的鑒定用已公布的5-HT受體的cDNA序列(GI:17864131)，在NCBI胚細(xì)胞網(wǎng)站(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上進(jìn)行完整人基因組胚細(xì)胞的搜索。這就導(dǎo)致了一個包含人5-H丁7受體完整基因組序列的BAC克隆(GI:14547262)的鑒定。該BAC克隆自Sanger中心(http:〃www.sanger.ac.uk/)定購的，并用一套引物Pri3-Pri4(6643bp)、Pri5-Pri6(8597bp)和Pri7-Pri8(6015bp),通過PCR鑒定不同的外顯子和內(nèi)含子序列的存在。通過比較cDNA序列與人基因組DNA序列，來揭示人5-HT7受體的外顯子-內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)。該BAC克隆除了包含編碼序列和內(nèi)含子外，還包含14.025bp上游序列和28.421bp下游序列。圖2顯示了人5-HT7受體的結(jié)構(gòu)。用LoxP-Cre重組酶技術(shù)(Wade-Martins,1999;Wade-Martins，2000),將包含完整基因組插入物的BAC克隆變化為EBV栽體。用同樣的用于確認(rèn)BAC克隆的系列引物，通過PCR再次確認(rèn)EBV載體中基因組插入物的存在。該EBV載體使我們能將完整的基因組5-HT受體序列轉(zhuǎn)移到真核細(xì)胞中，并因此用于鑒定那些控制可變剪接的序列以及研究基因的啟動子調(diào)節(jié)。啟動子區(qū)的鑒定用Matlnspector(http:〃www.genomatix.de)3寸5,-側(cè)翼DNA的序列分析顯示了多個轉(zhuǎn)錄因子的共有結(jié)合位點(diǎn)。該5，-側(cè)翼區(qū)(圖l)富含GC,并在鄰近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的區(qū)域不含TATA框或CACA框(見后)。有趣的是，已鑒別了幾個神經(jīng)元-限制性的沉默子元件/抑制子元件(NRSE/RE1)的基序，這幾個基序可能對于5-HT7受體基因的神經(jīng)元限制有重要意義。對于5-HT7受體基因的調(diào)節(jié)具有重要意義的幾個其它的基序是Spl、AP2、OLF,、BARBIE、PPAR/RXR、NGFIC、Egr，等等。當(dāng)我們用Proscan(http:〃bimas,dcrt.nih.gov/molbio/proscan)和Promotorlnspector(http:〃www.genomatix.de)來鑒定5,-側(cè)翼區(qū)的;替在的啟動子時，兩個程序均顯示了在ATG密碼子的上游端-663至-68之間的推定的啟動子區(qū)。這一結(jié)果已在用不同長度的5-HT7受體啟動子區(qū)對HEK293T和NS20Y細(xì)胞的瞬時轉(zhuǎn)染中得到了證實(shí)(圖7)。在這一啟動子活性增加最多的區(qū)域內(nèi)(271bp-365bp),有一個富含GC的區(qū)和推定的Spl/MAZ和Egr-l結(jié)合位置(圖8)。這一233bp區(qū)域(SEQIDNo:6)是用BamHl和Bgll對F1000構(gòu)建體進(jìn)行限制性降解，從中剪切出來的；并將該23bp區(qū)域克隆到pGL31uc上，產(chǎn)生2331uc構(gòu)建體。啟動子區(qū)的分析為了研究5-HT7受體基因的潛在的啟動子活性，用特異性的引物組和高保真性的PfuDNA聚合酶來分離不同長度的片段(表II)。PCR片段被克隆到Zero-Blunt載體pCR2.1TOPO(Invitrogen)上，并從這里將啟動子片段亞克隆到pGL3-basic螢光素酶報道載體(Promega)上。由于此克隆策略，全部構(gòu)建體最初都缺少83bpNcoI-片段(SEQIDNo:2)。隨后將該片段插入到所有的啟動子構(gòu)建體中，從而產(chǎn)生了'+，構(gòu)建體。所有的構(gòu)建體仍缺少翻譯起始位點(diǎn)前面的27bp。圖4顯示所有片段在HEK293T細(xì)胞中均顯示相當(dāng)強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性。用2000bp片段得到了最高活性，該結(jié)果顯示2000bp片段與1000bp片段相比，存在潛在性的增強(qiáng)子元件。又一方面，用更長的啟動子片段導(dǎo)致產(chǎn)生表達(dá)水平的下降，該結(jié)果表明在位置-2000至-3000中，存在潛在的抑制子元件。可是對于全部的構(gòu)建體，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)83bpNcoI-片段不存在時，啟動子活性明顯降低。這些結(jié)果明確表明在這個83bp序列中，存在一個重要的基本啟動子或增強(qiáng)子元件。用不同長度的5-HT7推定啟動子區(qū)進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染，導(dǎo)致271bp和653bp之間區(qū)域的啟動子活性明顯增力口(圖7)。該區(qū)域的分析顯示了幾個潛在的Egr-l結(jié)合位點(diǎn)和至少一個推定的Spl結(jié)合位點(diǎn)(圖8)。利用一個SmarTest(http:〃www.genomatix.de),我們還在4立置2840直至25卯的范圍內(nèi)，鑒定了一個推定的S/MAR序列的存在。S/MAR被認(rèn)為是啟動子活性的主要控制因子，所以他們能夠阻止鄰近序列的影響。這是否就意味著全部5-HT7受體啟動子活性均存在于3000bp片段中，對此還需要用更長的啟動子片段來研究?？傊?，這些結(jié)果表明從5-HT7受體的5，-非翻譯區(qū)分離出來的片段明顯地顯示啟動子活性。人5-HT7基因中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的鑒定用從人5-HT7受體的已知序列衍生出的基因特異性的反義51物，進(jìn)行始于人胎兒腦RNA(Stratagene)的5'PACE。用一個接頭-特異性的外部引物和引物Bl進(jìn)行第一輪實(shí)^r后，就可^^測到一個800bp片段。用另一個接頭-特異性的外部引物和基因-特異性的外部引物對該片段進(jìn)一步擴(kuò)增，就產(chǎn)生了一個600bp片段。最后在第三輪PCR中，用一個接頭-特異性的內(nèi)部引物和基因-特異性的內(nèi)部引物對該片段進(jìn)一步擴(kuò)增，產(chǎn)生了一個400bp片段。這個400bp片段被克隆到TOPO-TA載體上，序列分析顯示在翻譯起始位點(diǎn)ATG的上游端的307bp位置，存在一個轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。該轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)與由Bard鑒定的公開的位點(diǎn)(GI:10880132，GI:10880130，GI:10880128)和Heidmann鑒定的公開的位點(diǎn)(GI:1857144,GI:1857142)不同。83bp片段上有趣的潛在轉(zhuǎn)錄因子的鑒定我們對HEK293T細(xì)胞的分析顯示了83bpNcoI-片段對于5-HT7啟動子活性的重要性。為了進(jìn)一步研究這一問題，我們在凝膠移位實(shí)驗(yàn)中使用了這個83bp片段(SEQIDNo:2)和內(nèi)部的30bp寡核苷酸(SEQIDNo:4)。對兩個探針進(jìn)行放射性標(biāo)記，并用HEK293T細(xì)胞和CMV-AP2瞬時轉(zhuǎn)染的HEK2WT細(xì)胞的提取物(Williams和Tjian,1991)進(jìn)行溫育。83bp片段的結(jié)果顯示來源于HEK293T細(xì)胞的幾種蛋白質(zhì)與該啟動子片段相互作用。因?yàn)樾蛄蟹治霰砻鬟@個83bp中存在一個AP2基序，我們用AP2轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞的提取物來研究它的作用。凝膠移位實(shí)驗(yàn)顯示AP2實(shí)際上與83bp片段相互作用，并且通過用一個包含AP2位點(diǎn)的較短的30bp寡核苷酸證實(shí)了這些結(jié)果。這種相互作用的特異性在一個用冷30bp的竟?fàn)幮詫?shí)驗(yàn)中得到了證明。但是，用30bp寡核苷酸作為竟?fàn)幬?，?dǎo)致了未知蛋白質(zhì)B和C之間較強(qiáng)的結(jié)合。這一結(jié)果可能表示這些蛋白質(zhì)具有重疊的結(jié)合-基序，而且它們與AP2竟?fàn)幗Y(jié)合這一位點(diǎn)?？赡艿暮蜻x蛋白質(zhì)是SREB、NRSF、Myf5、或c-ETS(圖5)。巴比妥鹽在5-HT;7啟動子活性中的作用按照Matlnspector,5-HT7受體的啟動子區(qū)內(nèi)存在一個推定的BARBIE(巴比妥鹽誘導(dǎo)型元件)。為了研究巴比妥鹽對5-HT啟動子活性的可能影響，我們用不同的啟動子構(gòu)建體瞬時轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，并用巴比妥鹽處理這些轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時(圖6a)。結(jié)果顯示24小時的巴比妥鹽(1.5mM)處理抑制了瞬時轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞中的啟動子活性。依照所用的啟動子構(gòu)建體和巴比妥鹽的種類，啟動子活性降低的水平在30-50。/。之間變化。異戊巴比妥似乎更有效，而且在2000啟動子片段中其作用更明顯。由于巴比妥鹽不影響CMV啟動子的活性，這些結(jié)果表明被觀察的作用具有5-HTr啟動子特異性。接下來，我們進(jìn)行了時程實(shí)驗(yàn)(圖6)，該實(shí)驗(yàn)表明6小時后已經(jīng)呈現(xiàn)了抑制作用，16小時后抑制作用達(dá)到最大。52小時后啟動子活性又增加。Egr-l和Spl對5-HT^啟動子調(diào)節(jié)的作用用CMV-Spl或CMV-Egrl加上5-H丁7啟動子構(gòu)建體在NS20Y細(xì)胞中進(jìn)行的瞬時轉(zhuǎn)染顯示兩種轉(zhuǎn)錄因子(Egrl和Spl)對5-HT7啟動子活性有正效應(yīng)(分別為圖9A和圖9B)。另外，兩種轉(zhuǎn)錄因子(CMV-Spl-BD和Zn-Egrl)的顯性失活構(gòu)建體對5-H丁7啟動子活性顯示負(fù)效應(yīng)。提示兩種轉(zhuǎn)錄因子在5-HT7基因調(diào)節(jié)中的作用。用CMV-Spl和CMV-Egrl力。上5-HT7啟動子構(gòu)建體在N2A細(xì)胞中進(jìn)行的共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)顯示了這兩種轉(zhuǎn)錄因子的相互作用。當(dāng)其中一個轉(zhuǎn)錄因子保持在相同水平(500ng)時，另一個的轉(zhuǎn)錄水平就得到增加，從中可以看到其對5-HT7啟動子活性的負(fù)效應(yīng)(分別為圖10A和圖IOB)。光神霉素A是一種能夠干擾Spl與DNA中的GC框結(jié)合的化合物，用光神霉素A的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Spl與5-HT7啟動子的結(jié)合對于轉(zhuǎn)錄活性的意義。在第一次實(shí)驗(yàn)中，用5-HT啟動子的F1000構(gòu)建體瞬時感染NS20Y細(xì)胞并用連續(xù)增加濃度的光神霉素A處理NS20Y細(xì)胞，該實(shí)驗(yàn)證明了啟動子活性的計量依賴性損失(圖IIA)。在1321-N1細(xì)胞中觀察到了相似的現(xiàn)象。用不同濃度的光神霉素A處理這一內(nèi)源性表達(dá)5-HT7受體的人細(xì)胞系24小時，導(dǎo)致5-HT7mRNA水平顯著降低，而一種管家基因GAPDH的水平未受影響(圖IIB)。這些結(jié)果表明Spl在5-HT7啟動子活性的"體內(nèi)"體內(nèi)調(diào)節(jié)中起重要作用。討論我們首次報道了人5-HT7受體的完整基因組結(jié)構(gòu)，包括5，-和3，-側(cè)翼區(qū)。將包含107kB第一內(nèi)含子的完整基因組序列克隆到基于EBV的載體中，使我們能研究真核細(xì)胞中5-HT7受體基因的調(diào)節(jié)。通過5，RACE實(shí)驗(yàn)，我們能夠鑒定出位于翻譯起始位點(diǎn)上游307bp位置的一個主要轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。該位點(diǎn)不同于以前鑒定的位點(diǎn)。這一現(xiàn)象能夠與至今在啟動子區(qū)內(nèi)不能鑒定到真實(shí)的CAAT元件的TATA-框的事實(shí)聯(lián)系起來。用多種軟件程序進(jìn)行的5，-側(cè)翼區(qū)的序列分析顯示和鑒定了轉(zhuǎn)錄因子的幾個基序。在這些基序中，存在一些推定的Spl和AP2位點(diǎn)，這些位點(diǎn)與5，-側(cè)翼區(qū)的富含GC的特性相關(guān)。我們分離出不同長度的啟動子片段，并在HEK293T細(xì)胞中測試了它們的轉(zhuǎn)錄活性。所有片段明顯地表現(xiàn)啟動子活性，我們的結(jié)果表明存在增強(qiáng)子區(qū)和阻抑物子區(qū)。當(dāng)構(gòu)建體中包含83bpNcoI-片段時，可觀察到轉(zhuǎn)錄明顯增加。在凝膠移位實(shí)驗(yàn)中僅用此83bp片段，該實(shí)驗(yàn)證明存在幾種相互作用蛋白。迄今為止，我們將AP2鑒定作為增強(qiáng)子區(qū)結(jié)合因子。已有報道指出AP2在幾個其它的神經(jīng)遞質(zhì)受體基因的啟動子調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，這些神經(jīng)遞質(zhì)受體包括人m3毒蠅石威性乙酰膽堿受體(Billington和Penn，2002)、oc7神經(jīng)元煙石咸性乙酰膽堿受體(Gault等，1998)和D(1A)多巴胺受體(Takeuchi等，1999)。用包含AP2位點(diǎn)的30bp片段進(jìn)行的竟?fàn)帉?shí)驗(yàn)顯示其它的轉(zhuǎn)錄因子能夠竟?fàn)幹丿B序列。這些因子例如SREBP、NRSF、Myf5、c-ETS在5-HT7受體啟動子的30bp序列中有它們的識別序列。已有研究顯示5-HT7受體在體內(nèi)(LeCorre等，19W;Yau等l"7)和體外(Shimizu等1997)受類固醇負(fù)調(diào)節(jié)，這也許在情感障礙中起作用。鑒定存在于5，-側(cè)翼區(qū)的調(diào)節(jié)序列元件GREF/PRE和PPAR/RXR為試驗(yàn)類固醇，例如地塞米松或其它核受體配體對啟動子活性的影響提供了一個手段，同時也為檢查這種活性上的差異是否由其中之一的基序引起提供了一個手段。另外，結(jié)合全長基因組克隆，現(xiàn)在已能夠研究類固醇，例如地塞米松是如何影響5-HT7受體的剪接模式。對普通的鎮(zhèn)靜劑來說，已知在高劑量時，它們能夠抑制神經(jīng)和肌肉的活性，并抑制組織中氧的消耗。在低劑量時，巴比妥鹽行使鎮(zhèn)靜劑的作用，舉例來說，它們具有鎮(zhèn)靜的作用；增加劑量具有催眠或誘導(dǎo)睡眠的作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用機(jī)制還是未知的。5-HT7受體啟動子的序列分析令人驚訝地顯示了巴比妥鹽誘導(dǎo)型元件(BARBIE)的存在。我們用1.5mM的巴比妥鹽的結(jié)果清楚地表明巴比妥鹽對5-HT7啟動活性有負(fù)效應(yīng)。這提示了5-H丁7受體在睡眠調(diào)節(jié)中的潛在作用，并支持了Ehlen等人在2001年的早期發(fā)現(xiàn)，Ehlen等證實(shí)了用8-OH-DPAT(—種對5-HT7受體具有高親和性的5-HT1A激動劑)治療的倉鼠在晝夜節(jié)律上的改變。目前，對BARBIE元件的鑒定作為研究巴比妥鹽對5-HT7受體調(diào)節(jié)的影響提供了一個工具，也為鑒定那些特異性影響巴比妥鹽誘導(dǎo)型元件活性的試劑提供了一種手段。利用Smar試驗(yàn)(http:〃www.genomatix.de),我們在3000bp片段中鑒定出S/MAR。MAR(MatrixAttachmentRegions)被認(rèn)為負(fù)責(zé)基因組DNA與核基質(zhì)或骨架的連接，這一連接是允許轉(zhuǎn)錄的必要條件(Bode等1995)。MAR的一些功能性特征包括l)將調(diào)節(jié)元件例如啟動子和增強(qiáng)子錨定到核基質(zhì)上，2)定義獨(dú)立染色質(zhì)域的邊界(包括基因的協(xié)同表達(dá)所必需的全部順式-調(diào)節(jié)元件)，3)保證啟動子和增強(qiáng)子的長期活性，4)絕緣、放棄對位置作用不敏感的功能區(qū)域。因此期望完整的5-HT7啟動子調(diào)節(jié)存在于3000bp片段中。5-HT7啟動子的富含GC的區(qū)的鑒定證實(shí)了早期的發(fā)現(xiàn)，即缺少不變的TATA和CAAT框的基因具有富含GC的區(qū)域，該區(qū)域可能代替TATA框行使作用。幾個這種基因已經(jīng)顯示能夠被Spl激活。例子包括EGF受體[Kageyama，1988#38]和雌激素受體a[deGraffenried，2002#39]。Egr-l被認(rèn)為、并被報道為在它們的富含G+C的元件中，既抑制又刺激基因啟動子的轉(zhuǎn)錄。Spl通常是一種激活因子，但當(dāng)Egr-l存在時，Spl引起復(fù)雜的反應(yīng)。Ackerman首先報道了Spl和Egr-l之間在與ADA基因啟動子的結(jié)合和激活上的竟?fàn)嶽Ackerman,1993#40]。此后，幾個才艮道指出Spl和Egr-l之間有復(fù)雜的關(guān)系。Huang說明Egr-l的表達(dá)增大了非重疊的Spl+Egr-1位點(diǎn)上Spl的激活，但當(dāng)位點(diǎn)被與Spl竟?fàn)幍慕Y(jié)合位點(diǎn)重疊時，Egr-l的表達(dá)抑制Spl的活性[Huang,1997#41]。我們的結(jié)果清楚地表明這兩種轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)5HT7受體基因中的作用。因此，影響這些轉(zhuǎn)錄因子活性的策略可能提供一種用于控制5-HT7受體水平的工具。此外，我們發(fā)現(xiàn)了一種能夠抑制5-H丁7啟動子活性的化合物-光神霉素A,該化合物干擾Spl與DNA中的GC框的結(jié)合。迄今為止，僅描述了幾種選擇性5-H丁7受體拮抗劑，例如SB258719、DR4004和SB269970(Thomas等，1998;Kikuchi等，1999;Hagan等，2000),但是至今還沒有得到選擇性激動劑。對5-HT7啟動子調(diào)節(jié)的闡明，將使我們以一種新的方式干擾5-H丁7受體的形成，并可能導(dǎo)致產(chǎn)生針對干擾5-HT7受體功能的藥物的新篩選策略。同樣，我們擁有完整的基因組克隆的事實(shí)將允許我們確定那些負(fù)責(zé)5-HT7受體可變剪接的機(jī)制。盡管至今還沒有剪接變異體之間差異的報道，但為了未來的治療性干預(yù)，為干擾潛在機(jī)制的可能性付出努力是值得的。參考文獻(xiàn)Billington，C.K.和R.B.Penn(2002)."m3muscarinicacetylcholinereceptorregulationintheairway,"AmJRespirCellMolBiol26(3):269-72。Bode,J.,T.Schlake等(1995)."Scaffold/matrix-attachedregions:structuralpropertiescreatingtranscriptionallyactiveloci."IntRevCytol162A:389-454。Bourson,A.，V.Kapps等(1997)."Correlationbetween5-HT7receptoraffinityandprotectionagainstsound-inducedseizuresinDBA/2Jmice."NaunvnSchmiedebergsArchPharmacol356(6):820-6。Ehlen,J.C.,G.H.Grossman等(2001)."Invivoresettingofthehamstercircadianclockby5-HT7receptorsinthesuprachiasmaticnucleus."JNeurosci21H4):5351-7。Gault,丄，M.Robinson等(1998)."Genomicorganizationandpartialduplicationofthehumanalpha7neuronalnicotinicacetylcholinereceptorgene(CHRNA7)."Genomics52(2):173-85。Hagan，J.J.，G,W.Price等(2000)."CharacterizationofSB-269970-A，aselective5-HT(7)receptorantagonist."BrJPharmacol130(3):539-48。Heidmann，D.E.,P.Szot等(1998)."Functionanddistributionofthreerat5勿droxytryptamine7(5-HT7)receptorisoformsproducedbyalternativeSplicing."Neuropharmacology37(12):1621-32。Kikuchi,C.，Nagaso,H.等(1999)."Tetrahydrobenzindoles:selectiveantagonistsofthe5-HT7receptor."JournalofMedicinalChemistry42(4):533-535。LeCorre,S.,T.Sharp等(1997)'"Increaseof5-HT7(serotonin-7)and5-HT1A(serotonin-lA)receptormRNAexpressioninrathippocampusafteradrenalectomy."Psvchopharmacologv(Berl)130(4):368-74。Lovenberg,T.W.,B.M.Baron等(1993)'"Anoveladenylylcyclase-activatingserotoninreceptor(5-HT7)implicatedintheregulationofmammaliancircadianrhythms."Neuron11(3):449-58。Mullins,U.L.,G.Gianutsos等(1999)."Effectsofantidepressantson5-HTreceptorregulationintherathypothalamus."Neuropsychopharmacologv21(3):352-67。Saeki,Y.，C.Fraefel等(2001)."Improvedhelpervirus-freepackagingsystemforHSVampliconvectorsusinganICP27-deleted,oversizedHSV-1DNAinabacterialartificialchromosome."MolTher3(4):591-601。Shimizu,M.,A.Nishida等(1997)."Down-regulationof5-hydroxytryptamine7receptorsbydexamethasoneinratfrontocorticalastrocytes."JNeurochem68(6):2604-9。Sleight,A.J.，C.Carolo等(1995)，"Identificationof5勿droxytryptamine7receptorbindingsitesinrathypothalamus:sensitivitytochronicantidepressanttreatment."MolPharmacol47(1):99-103。Takeuchi，S.,I.Imafiiku等(1999)'"AP-2betarepressesD(IA)dopaminereceptorgenetranscriptioninneuro2acells."BrainResMolBrainRes74(1-2):208-16。Thomas,D.R.,S.A.Gittins等(1998)."Functionalcharacterisationofthehumancloned5-HT7receptor(longform);antagonistprofileofSB-258719."BrJPharmacol124(6):1300-6。VandenBerghe，W.,S.Plaisance等(1998》"p38andextracellularsignal-regulatedkinasemitogen-activatedproteinkinasepathwaysarerequiredfornuclearfactor-kappaBp65transactivationmediatedbytumornecrosisfactor."JBiolChem273(6):3285-90。Vanhoenacker,P.,G.Haegeman等(2000)."5-HT7receptors:currentknowledgeandfutureprospects,"TrendsPharmacolSci21(2):70-7。Wade-Martins,R"J.Frampton等(l999)."Long-termstabilityoflargeinsertgenomicDNAepisomalshuttlevectorsinhumancells."NucleicAcidsRes27(7):1674-82。Wade德rtins，R.,R.E.White等(2000)'"Stablecorrectionofageneticdeficiencyinhumancellsbyanepisomecarryinga115kbgenomictransgene."NatBiotechnol18(12):1311-4。Williams,T.和R.Tjian(1991)."AnalysisoftheDNA腸bindingandactivationpropertiesofthehumantranscriptionfactorAP-2."GenesDev5(4):670-82。Yau,J.L.，J.Noble等(1997)."Impactofadrenalectomyon5-HT6and5-HT7receptorgeneexpressionintherathippocampus."BrainResMolBrainRes45"):182-6。Ying,S.W.和B.Rusak(1997)."5-HT7receptorsmediateserotonergiceffectsonlight-sensitivesuprachiasmaticnucleusneurons."BrainRes755(2):246-54。表I<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>序列表<110>詹森藥業(yè)有限公司(JanssenPharmaceuticaN.V.)<120>人5-HT7受體啟動子序列<130>JAB1720<150〉EP02077309,9<151〉2002-05-31<160〉6<17D〉Patentlnversion3.1<210〉1<211>3081<212>隱<213〉人(Homosapiens)<400〉1tggtggctcatgcctgtaatctcagcactttgggaggctgaggcaggcggatcactt眺60gttaagagtttgaggccagcctggccaacatggtgaaacccggtcccuetaaaaacaat120acaaaaatUggcaggtgtggtggcatgtgcctgUatccc鄧cUcttgggaagctgag180gcaga卿atcgcttgaacctgggaggttgaggttgcagtgagccgagatcgcgccactg240cactccagcctgggtgacagagcaagaccctgtctcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa300aaagaaagagagacccagagagctctcctaccccctUgccaggtgaggacacagcaaca360tggctaaatttactgttgccUgUcUggtaaatgtttgUgttaagccacccaggcta420tg"attt"g"atggcatcccaaagggactaaaacaagacaaaagcaaaaacUgaag480ctgttgtgaaatataaatgggctacgtgagggctgUagagtgtaggtggtaaatcaUt540tgactagaggUtaaaUca組aaaatgatUaUttcaaaatctgtgtgtaattactc600tggaatattaUtgacagagccaagacagaaUtaUagctgaactgattagggUttca660aggggaagaaUcaaaagtcaaaaUagttaa組gagttgaaaagtUaa"gaaa,720aUtcaaaagUtcttggggaaUtacUcatgaaggaatUtUaaagaccUaagaca780attccaaacctcaaaataaaaaaatggagaca"tcaatgcagtcacatatgatcttgga840taagttataaaaUtctcccagcctcUUtcctcctctgcactgaagggtgaacaaatg900gtttcUagatgcattccagcaac織ctatttgtcttttgtctgagatttcctctctcc960caagatccccagtggatgcctaaaaccccggatagtacccaatcgtaUtatactatgU1020tuttttttgatctggUag,gagggctacUagtgacUatggtggatggcaUUcl剛agtgtggatatgttggacaagggatgattcatatcctgggU卿tagagatttcatcac1140gctactcagaatagtgtgca"tgacaacttacacattgtUatUctgaaaaUtccat1200UaaUUttcggaccgtggttcaccacagaUacaaaccaagaaaagcgaaacgaa1260UacUacataagUaggttgaagaaatttcctcatccatcttaactgttagaUaUU1320gctttgtggcctaggUttatattcaactcUcctctgactcmggattggtttgctu1380tcctaggcagagaggagcctctgaaatgttgatcacagcaaaagagctgtgaacattagg1440gctttttmUttcc"U咖ctttttctga"gtgUcagggaagaaUtgggcata1500gtaatcag",cttgggtUgaa織Uacmtccttaccagctg"tg,gagct1560aacaaccttccctatctggaaaaacagagcUatacccaccUgaaga"ga卿tacU1620ttcagcactctgatcaatatactttgaggtttttattccttttcttctUttutaatcc1680gcUgggcctaacaag,aaacagaUtgatumtUgagtctt,cUcagaa"1740cactgctggcttccaatgaaaccttc織caasatggaatgaag國gtctcacaaaUal謂t雄aatcagccgctctgacagggtttggataccaaggggaattttagccaataggtaU1860aaatcaac"acacctccagg"tcctttaUga,gUUaccggtcaUtctttgct1920UtgtgtaagacttccagaatgctacgggaaaatUactctcttttca"atatuggct1980ttgaagtcUaaUt謹(jǐn)ggcaatcagggtctaUUcagagcggagaggactgtttcU2040gac"ccaggaagg"UgtcctgggtgUacccccttggaggccttgtccccagag2100c"cctcatctcctgggtgccaggggctUaggaatccccctccctccttUtUcUtc2160ttcctcttctcggagctcccaccctcaccccattcggctgcUcttUccatcUcgctt2220cttcccaUagcggtc磁aUg雄acggaagtaccUtttgttgctUgtgUgtgct2280cagagacgtttttttggttgttgttUattaag幅aaUaaatccccctcUgg"c"2340catttcgcaatgagcccaaacatccgctggctcatUggcctcttaacaaaagaaaaatg2400cccctgaactgtggctgacUgtgtgcgg3ggctggggtcggctggaggggttctaa2460gUtctatcatgcggcaagg織gcttcccgggcgaggggacccgggatcccgggaggcg2520cgtgcagcgccgccccctcacagtagggaggcgcgggagaggcggcggtgcctgcccagc2580ccgggUtcccgtcccaggagcgcgagggagcgggcagcggccggaggcggcggcggcgg2640ggacgcggcgcggctgccgcaggggagcggcggcggcggcggcggcggcggcgggcgcga2700g鵬c鵬gcgcactccgcaacttctgccgctgccgcccgggcgctctcggcgcagccga2760gctgc.tgctgc卿ctgtggagctgccagcggagcccagcccgagctccctcgactccgc2820gcgtccc鄉(xiāng)cgtccgtcgggggccgaagcgcctcccgcagggagtccccgtg鄉(xiāng)ccgc2880gctgccgcgtUcccgcagcggccgggggtccggggagtgcggggctccgag織gagcc2940aggcgccccccagcggtcggcgcgggccccatggctgggccgggcggagcggaaccggtg3000aggtgaagccccggggccggcagccggaggcgcgtggccggggcgccggctcc"gggca3060gcggccggcggcgcg"g3081<210〉2<211>83<212>DNA<213>人(Homosapiens)<400〉2catggctgggcc鵬cggagcggaaccggtgaggtgaagccccggggccggcagccggag60gcgcgtggccggggcgccggetc83<210〉3<21i〉15<212〉薩<213>人(Homosapiens)<400〉3ctccctccttttttt15<210〉4<211>30<212>DNA<213〉人(Homosapiens)<400〉4gaggtgaagccccggggccggeagceggag30<210〉5<211>154<212>DNA<213〉人(Homosapiens)<400>5ccgagacagagccaggcgccccccagcggtcggcgcgggccccatggctgggcegggegg60ageggaaccggtgaggtgaagccccggggccggcagccggaggcgcgtggccggggcgcc120ggctccatgggcagcggcacacggcggcgcgatg154<210>6<211〉233<212>隨<213>人(Homosapiens)<400>6g"cccgggaggcgcgtgcagcgccgccccctcacagUgggaggegeggg,ggcggc60ggtgcctgcccagcccgggtatcccgtcccaggagegegagggagegggeageggcegga120ggcggcggcggcggggacgcggcgcggctgccgcaggggagcggcggcggcggcggcggc180ggcggcgggcgcgaggggcggggcgcactccgcaacttctgccgctgccgccc23權(quán)利要求1.一種分離的核酸分子，所述核酸分子選自(a)SEQIDNo1的核苷酸1-3081，或其顯示5HT7受體啟動子活性的片段；(b)(a)的互補(bǔ)鏈；和(c)能夠在嚴(yán)格條件下與(a)或(b)所定義的核苷酸序列雜交的核酸。2.權(quán)利要求1的5-H丁7受體啟動子區(qū)的分離的調(diào)節(jié)元件，所迷調(diào)節(jié)元件包含選自以下的序列(a)SEQIDNo:1中位置-27至-110即SEQIDNo:2所示的核苷酸序列，或其顯示5-HT7受體增強(qiáng)子活性的片段；(b)SEQIDNo:1中位置-925至-939即SEQIDNo:3所示的核苷酸序列，或其顯示巴比妥鹽誘導(dǎo)型元件活性的片段；(c)SEQIDNo:1中位置-50至-80即SEQIDNo:4所示的核苷酸序列，或其顯示5-HT7受體啟動子調(diào)節(jié)活性的片段；(d)SEQIDNo:1中位置-X至-Y即SEQIDNo:6所示的核苷酸序列，或其顯示5-HT7受體啟動子調(diào)節(jié)活性的片段；(e)(a)、(b)、(c)或(d)的互補(bǔ)鏈；和(f)能夠在嚴(yán)格性雜交條件下與(a)、(b)、(c)或(d)所定義的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。3.—種重組DNA分子，所述重組DNA分子包含權(quán)利要求1或2的分離的核酸分子。4.權(quán)利要求2的重組DNA分子，其中所述分離的核酸分子是83bpNcol片段即SEQIDNo:2、BARBIEit件即SEQIDNo:3或233bp富含GC的基序即SEQIDNo:6。5.權(quán)利要求3或4的重組DNA分子，其中權(quán)利要求l的分離的核酸分子與編碼可檢測產(chǎn)物的核酸分子有效連接。6.權(quán)利要求4的重組DNA分子，其中所述分離的核酸分子與包含最小啟動子的報道質(zhì)粒有效連接。7.權(quán)利要求5或6的重組DNA分子，其中所述編碼可檢測產(chǎn)物的核酸分子選自編碼5HT7受體多肽的核酸序列或報道基因。8.權(quán)利要求7的重組DNA分子，其中所述報道基因選自螢火蟲安光素酶基因、(3-半乳糖苷酶基因、^喊性磷酸酶基因、細(xì)菌氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因和綠色熒光蛋白基因。9.權(quán)利要求5-8中任一項(xiàng)的重組DNA分子，其中所述報道基因是螢火蟲縈光素酶基因。10.—種載體，所述載體包含權(quán)利要求3-8中任一項(xiàng)的重組DNA分子。11.權(quán)利要求IO的載體，其中所述載體是表達(dá)載體。12.—種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞用權(quán)利要求10或11的載體轉(zhuǎn)化。13.權(quán)利要求12的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。14.權(quán)利要求12的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。15.權(quán)利要求14的宿主細(xì)胞，其中所述真核細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞，優(yōu)選HEK293細(xì)胞、NS20Y細(xì)胞或N2A細(xì)胞。16.—種用于鑒定作為人5HT7受體啟動子活性調(diào)節(jié)劑的化合物的方法，所述方法包括(a)使包含權(quán)利要求3-8中任一項(xiàng)的重組DNA分子的宿主細(xì)胞與試驗(yàn)化合物接觸；和17.權(quán)利要求16的方法，其中所述可檢測產(chǎn)物是5HT7受體蛋白或選自以下的報道基因螢火蟲螢光素酶、J3-半乳糖苷酶基因、細(xì)菌氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因和綠色熒光蛋白基因。18.—種用于鑒定能夠調(diào)節(jié)5HT7受體啟動子增強(qiáng)子活性的化合物的方法，所述方法包括(a)使用重組DNA分子轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞與試驗(yàn)化合物接觸，所述重組DNA分子包含與可檢測產(chǎn)物有效連接的83bpNcoI-片段即SEQIDNo:2;和19.一種用于鑒定能夠調(diào)節(jié)5HT7受體啟動子區(qū)內(nèi)巴比妥鹽誘導(dǎo)型元件活性的化合物的方法，所述方法包括(a)使用重組DNA分子轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞與試驗(yàn)化合物接觸，所述No:3;和(b)確定所述試驗(yàn)化合物是否調(diào)節(jié)所述可檢測產(chǎn)物的表達(dá)水平。20.—種用于鑒定能夠調(diào)節(jié)5HT7受體啟動子區(qū)內(nèi)巴比妥鹽誘導(dǎo)型元件活性的化合物的方法，所述方法包括(a)使用重組DNA分子轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞與試驗(yàn)化合物接觸，所述重組DNA分子包含與可檢測產(chǎn)物有效連接的富含GC的基序即SEQIDNo:6;和21.—種用于i:定能夠調(diào)節(jié)5HT7受體L動子增強(qiáng)子活性的化合物的方法，所述方法包括(a)在轉(zhuǎn)錄因子AP2存在下，使包含83bpNcoI-片段即SEQIDNo:2的重組DNA分子與試驗(yàn)化合物接觸；和(b)確定所述試驗(yàn)化合物是否影響所述轉(zhuǎn)錄因子與83bp增強(qiáng)子區(qū)即SEQIDNo:2的結(jié)合。22.—種用于鑒定能夠調(diào)節(jié)5HT7受體啟動子增強(qiáng)子活性的化合物的方法，所述方法包括(a)在轉(zhuǎn)錄因子Spl或Egr-l存在下，使包含富含GC的基序即SEQIDNo:6的重組DNA分子與試驗(yàn)化合物接的基序即SEQIDNo:6的結(jié)合。23.—種用于鑒定多肽的方法，所述多肽與參與5-羥色胺介導(dǎo)反應(yīng)相關(guān)的生物途徑的核苷酸序列結(jié)合，所述方法包括下述步驟(a)用權(quán)利要求3-8中任一項(xiàng)的重組DNA分子轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞系;(b)用多種人cDNA序列轉(zhuǎn)染所述宿主細(xì)胞系；(c)鑒定并分離所述報道基因的表達(dá)水平有改變的細(xì)胞；(d)從步驟(c)所分離的細(xì)胞中回收cDNA;和(e)鑒定步驟(d)回收的cDNA所表達(dá)的多肽。全文摘要本發(fā)明提供一種構(gòu)成人5HT₇受體啟動子的分離的核酸分子。也公開了其包括增強(qiáng)子和/或效應(yīng)元件例如NcoI或BARBIE的片段及其重組體的用途。因此，本發(fā)明的一個更進(jìn)一步的方面是提供重組DNA分子，其中依照本發(fā)明的核苷酸與可檢測產(chǎn)物例如螢光素酶基因或CAT基因有效連接。還提供基于細(xì)胞的篩選試驗(yàn)，用于鑒定調(diào)節(jié)與人5HT₇受體啟動子或其活性片段有效連接的基因的表達(dá)水平的化合物。文檔編號G01N21/78GK101580834SQ20091012741公開日2009年11月18日申請日期2003年5月26日優(yōu)先權(quán)日2002年5月31日發(fā)明者G·C·A·V·E·海格曼,K·L·M·萊寧,P·J·P·范赫納克申請人:詹森藥業(yè)有限公司