專利名稱：一種運(yùn)用一步rt-pcr法檢測(cè)犬瘟熱病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬病毒檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種運(yùn)用一步RT-PCR法檢測(cè)犬瘟熱病毒的方法。
背景技術(shù)：
^iSf!;(Canine distemper) ^(Canine distemper virus)弓 的高度接觸性、急性傳染病。CDV在分類上屬副粘病毒科麻疹病毒(MV)屬，與麻疹病毒、牛 瘟病毒之間有密切的抗原關(guān)系和共同特征，并與其超微形態(tài)和結(jié)構(gòu)完全一樣，而且與新城 疫及其他副粘病毒非常相似。犬瘟熱病毒是一種傳染性極強(qiáng)的病原體，在易感的犬和水貂 中很容易傳播。病毒存在于肝、脾、肺、腎、腦和淋巴結(jié)等多種器官與組織中，通過(guò)眼淚、鼻 液、唾液、尿液和呼出的空氣向外排出病毒。犬瘟熱一年四季均可發(fā)生，但以冬春多發(fā)，本病 有一定的周期性，每三年一次大流行，不同年齡、性別和品種的犬均可感染，但以未成年的 幼犬最為易感。臨床上以雙相熱、急性鼻卡他、結(jié)膜炎及其后出現(xiàn)的支氣管炎或肺炎、胃腸 炎和神經(jīng)癥狀為特征。犬瘟熱是當(dāng)前我國(guó)養(yǎng)犬業(yè)、毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)和野生動(dòng)物保護(hù)業(yè)危害 最大的疫病之一，經(jīng)常引起大批犬、貂、狐等動(dòng)物發(fā)病，病死率30%-80%，雪貂高達(dá)100%。這 不但給毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)(戶)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，且嚴(yán)重地影響和制約整個(gè)產(chǎn)業(yè)的快 速發(fā)展。根據(jù)CDV的流行病學(xué)資料及臨床癥狀，如雙向熱、粘膜卡他、中樞神經(jīng)癥狀及足墊 角化過(guò)度等主要癥狀，可做出初步診斷；而確診則需要依據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，如理包涵體檢查、 病毒分離等，其中檢測(cè)特異性抗體進(jìn)行診斷的前提條件是發(fā)病動(dòng)物沒(méi)有疫苗接種史，這些 方法包括瓊脂擴(kuò)散沉淀試驗(yàn)、ELISA和中和試驗(yàn)、熒光抗體技術(shù)以及其他免疫組化技術(shù)。雖 然上述方法取得了一定的效果，但有的耗時(shí)較長(zhǎng)，有的敏感性、特異性或準(zhǔn)確性較差，不能 及時(shí)確診。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種運(yùn)用一步RT-PCR法檢測(cè)犬瘟熱病毒的方法，以解決⑶V 檢測(cè)時(shí)耗時(shí)長(zhǎng)、敏感性及特異性差、準(zhǔn)確性不高的問(wèn)題。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案采用一步RT-PCR法檢測(cè)犬瘟熱病毒，針 對(duì)GeneBank中⑶V的N基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，序列如下
上游引物 CDV 1 :5’ -GGTCGGAGAATTTAGAATGAAC-3，； 下游引物 CDV 2 :5，-CCAAGAGCCGGATACATAG-3，。本方法的具體步驟如下
1)犬瘟熱病毒樣品總RNA提取，并測(cè)提取后總RNA的濃度；
2)—步RT-PCR法擴(kuò)增⑶V的N基因片段；
3)取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。步驟1)所述的犬瘟熱病毒樣品總RNA提取，包括以下步驟
3A、分泌物(鼻、眼睛、消化道)、臟器(心、肝、脾、肺、腎、)和腦組織及淋巴結(jié)的預(yù)處理 ①組織樣品的預(yù)處理取樣品稀釋液，(0. 01mol/LPBS(pH7. 2-7. 4)) IOX稀釋研磨待 檢臟器及腦組織，取100 μ 1研磨液，置1. 5ml離心管中，保存于_20°C待檢。②液體樣品(鼻液、眼部結(jié)膜分泌物、唾液、尿液)的預(yù)處理用棉簽采集的液體樣 品處理時(shí)，將采集棉簽倒置于離心管中，加入樣品稀釋(0. 01mol/LPBS(pH7. 2-7. 4) ) 4°C靜 置2h，4°C>2000-3000r/min離心IOmin,取上清200 μ 1，置1. 5ml離心管中，保存于_20°C待 檢。B、提取總 RNA
取待檢樣品200μ 1于1. 5mlEppendorf管中，加入800 μ ITrizol，充分混勻，靜置 5min，加入 200 μ 1 氯仿劇烈震蕩 30s，4°C、12000r/min 離心 lOmin，取水相 400-600 μ 1，加 入等體積的異丙醇輕輕顛倒混勻，4°C預(yù)冷IOmin后，4°C、lOOOOr/min離心lOmin，棄去上 清，加入 600 μ 175 % 乙醇，4°C、10000r/min 離心 lOmin,棄去上清，加入 20 μ IDEPC- H2O 溶 解RNA沉淀。步驟2)所述的一步RT-PCR反應(yīng)體系為 總RNA溶液
dNTPs (2. 5mM) IOXTaq Buffer MgCL2
引物 CDV 1 (20 μ Μ) 引物 CDV 2 (20 μ Μ) Ex-Taq 聚合酶(OT/μ 1) M-MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶(200υ/μ 1) Ι.ΟμΙ RNasin (40U/y 1)
10. Ομ 1 5. Ομ 1
5. Ομ 1
10 μ 1
2. Ομ 1 1· Ομ 1 0. 5μ 1
1· Ομ 1
DEPC-H2O
總體積
步驟2)所述的-
14. 5μ 1
50 μ Io
-步RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)?2°C反轉(zhuǎn)錄30min，94°C滅活反轉(zhuǎn)錄酶
-個(gè)循環(huán)，共401
2min，預(yù)變性 94°C 2min ；然后 94°C lmin，52°C lmin，72°C lmin，此步驟為-循環(huán)；最后72°C延伸IOmin0
⑶V基因組為負(fù)鏈線性RNA病毒，由15690個(gè)堿基組成，⑶V基因組中包括6 ^
非重疊基因區(qū)，它們的編碼基因按3'
5'端順序依次為N-P-M-F-H-L系
列，其中N蛋白是保護(hù)性較強(qiáng)的免疫源性蛋白，具有包裹和保護(hù)內(nèi)部基因的功能，N基因是 CDV的不同毒株、不同基因型間相對(duì)保守的結(jié)構(gòu)基因，本發(fā)明根據(jù)N基因的特點(diǎn)設(shè)計(jì)了一對(duì) 特異性引物用于一步RT-PCR快速檢測(cè)。 本發(fā)明的有益效果本發(fā)明建立了可以對(duì)多種犬瘟熱病毒易感的動(dòng)物組織樣品及 液體樣品CDV檢測(cè)的普遍方法，具有靈敏度高、快速、檢測(cè)準(zhǔn)確、易于操作、污染率低、成本 低的優(yōu)點(diǎn)。


圖1為一步RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖，從左至右1_8泳道依次
4為檢測(cè)樣品；泳道9為陽(yáng)性對(duì)照組；泳道10為陰性對(duì)照組；M為DL 2000bpmarkero
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特殊說(shuō)明為常規(guī)方法。實(shí)施例1液體樣品總RNA的提取
1)液體樣品(鼻液、眼部結(jié)膜分泌物及唾液)的預(yù)處理
分別用棉簽采集發(fā)病動(dòng)物的鼻液、眼部結(jié)膜分泌物及唾液樣品，將采集完的棉簽 倒置于離心管中，加入樣品稀釋液(0. Olmol/LPBS (pH7. 2-7. 4) ) 4°C靜置2h，2000_3000r/ min離心lOmin，取上清200μ 1，置1. 5ml Eppendorf管中，明確標(biāo)記后，放入_20°C待檢； 2)樣品總RNA的提取 取待檢樣品200μ 1于1. 5ml Eppendorf管中，加入800 μ 1 Trizol，充分混勻，靜 置5min ；加入200μ 1分析純氯仿劇烈震蕩30s，4 °C、12000r/min離心IOmin ；取水相 400-600 μ 1，加入等體積的異丙醇輕輕顛倒混勻，4°C預(yù)冷IOmin后，4°C、10000 r/min離 心IOmin ；棄去上清，加入600 μ 1 75 %乙醇，4°C、10000r/min離心IOmin ；棄去上清，加入 20 μ IDEPC-H2O 溶解 RNA 沉淀。同時(shí)以犬瘟熱病毒弱毒株細(xì)胞培養(yǎng)物作為RT陽(yáng)性對(duì)照樣品，以未接毒細(xì)胞培養(yǎng) 物作為陰性對(duì)照樣品，與檢測(cè)樣品同時(shí)進(jìn)行總RNA的提取，并做好標(biāo)記。實(shí)施例2運(yùn)用一步RT-PCR檢測(cè)液體樣品中⑶V 1、設(shè)計(jì)一步RT-PCR的擴(kuò)增引物
針對(duì)GeneBank中⑶V的N基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，序列如下 上游引物 CDV 1 :5’ -GGTCGGAGAATTTAGAATGAAC-3，； 下游引物 CDV 2 :5，-CCAAGAGCCGGATACATAG-3，； 引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。2、RT-PCR反應(yīng)體系的建立
提1)取的總RNA沉淀加入20 μ 1 DEPC-H2O使其溶解，取10 μ IRNA溶液，加入 2. 5mmol/LdNTPs 5. 0 μ 1，IOXTaq Buffer 5. 0 μ LMgCL2 10 μ 1，20pmol/μ 1 的引物 CDV 1 2. 0μ l，20pmol/y 1 的引物 CDV 2 1. 0μ l,5U/y IEx-Taq 0. 5 μ 1，200υ/μ 1 的 M-MuLV 反 轉(zhuǎn)錄酶 1. 0μ 1，40υ/μ 1 的 RNasin 1. 0μ 1, DEPC-H2O 14. 5 μ 1，反應(yīng)的總體為 50 μ 1。同時(shí)分別以陽(yáng)性對(duì)照的總RNA、陰性對(duì)照的總RNA為模板，建立RT-PCR反應(yīng)體系， 做好標(biāo)記。其中一步RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)?br> 42°C反轉(zhuǎn)錄30min，94°C滅活反轉(zhuǎn)錄酶2min，預(yù)變性94 °C 2min ；然后94 °C lmin， 52°C lmin，72°C lmin，此步驟為一個(gè)循環(huán)，共40個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。3、取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定
分別取陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及檢測(cè)組的一步RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電 泳，在紫外燈下觀察擴(kuò)增結(jié)果，
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示在陽(yáng)性對(duì)照組，第9泳道出現(xiàn)一條片段大小為240bp的特異性條 帶，在陰性對(duì)照組，第10泳道未出現(xiàn)一條片段大小為240bp的特異性條帶；在第2泳道為⑶V犬的鼻分泌物樣品檢測(cè)組，第3泳道為⑶V犬的眼部結(jié)膜分泌物樣 品檢測(cè)組，7泳道為CDV犬的唾液樣品檢測(cè)組，在這三條泳道中也均出現(xiàn)一條片段大小為 240bp的特異性條帶，說(shuō)明檢驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性；
1、4、5泳道為健康犬的鼻分泌物樣品檢測(cè)組，6泳道為健康犬的眼部結(jié)膜分泌物樣品 檢測(cè)組，8泳道為健康犬的唾液樣品檢測(cè)組，以上各泳道均無(wú)條帶出現(xiàn)，說(shuō)明檢驗(yàn)結(jié)果為陰 性；
綜上，采用此方法可準(zhǔn)確檢測(cè)到犬瘟熱病毒。
權(quán)利要求
一種運(yùn)用一步RT PCR法檢測(cè)犬瘟熱病毒(CDV)的方法，其特征在于針對(duì)GenBank中CDV 的N基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，序列如下上游引物CDV 15’ GGTCGGAGAATTTAGAATGAAC 3’；下游引物CDV 25’ CCAAGAGCCGGATACATAG 3’；以CDV 1/ CDV 2為引物，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為240bp。
1.一種運(yùn)用一步RT-PCR法檢測(cè)犬瘟熱病毒(⑶V)的方法，其特征在于針對(duì)GenBank 中CDV的N基因設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，序列如下上游引物 CDV 1 :5’ -GGTCGGAGAATTTAGAATGAAC-3，； 下游引物 CDV 2 :5，-CCAAGAGCCGGATACATAG-3，； 以CDV 1/ CDV 2為引物，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為240bp。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的運(yùn)用一步RT-PCR法檢測(cè)犬瘟熱病I 包括以下步驟1)犬瘟熱病毒樣品總RNA提取，并測(cè)提取后總RNA的濃度；2)—步RT-PCR法擴(kuò)增⑶V的N基因片段；3)取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的運(yùn)用一步RT-PCR法檢測(cè)犬瘟熱病 驟2)所述的一步RT-PCR反應(yīng)體系為總RNA溶液 dNTPs (2. 5mM) IOXTaq Buffer MgCL2 (2. 5mM) 引物 CDV 1 (20 μ Μ) 引物 CDV 2 (20 μ Μ) Ex-Taq 聚合酶(OT/μ 1) M-MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶(200υ/μ 1)Ι.ΟμΙRNasin (40U/μ 1)Ι.ΟμΙ；的方法，其特征在于步10 μ 1 5. 0μ 15. 0μ 110 μ 1 2. 0μ 1 1. 0μ 1 0. 5μ 1DEPC-H2O14. 5μ 1總體積50 μ 1。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的運(yùn)用一步RT-PCR法檢測(cè)犬瘟熱病毒的方法，其特征在于步 驟2)所述的一步RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)?2°C反轉(zhuǎn)錄30min，94°C滅活反轉(zhuǎn)錄酶2min，預(yù)變性 940C 2min;然后94°C lmin,52°C lmin,72°C lmin，此步驟為一個(gè)循環(huán)，共40個(gè)循環(huán)；最后 72°C延伸 IOmin0
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種運(yùn)用一步RT-PCR法檢測(cè)犬瘟熱病毒的方法，該方法步驟如下將RT-PCR檢測(cè)的樣品進(jìn)行預(yù)處理后，提取總RNA，通過(guò)一步RT-PCR反應(yīng)獲得特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。本發(fā)明方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作步驟簡(jiǎn)便、污染率低，檢測(cè)結(jié)果可信的特點(diǎn)，獲得的序列信息直接用于流行毒株遺傳衍化關(guān)系分析，適用于犬瘟熱的病原學(xué)診斷和流行病學(xué)研究。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK101974653SQ20101050572
公開(kāi)日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月13日
發(fā)明者吳紅云, 李建正, 范金紅 申請(qǐng)人:鄭州后羿制藥有限公司