專利名稱：：一種微量肝組織體外孵育進行cyp450酶活性檢測的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬生物化工
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種酶的活性檢測方法，特別是涉及一種微量肝組織體外孵育進行CYP450酶活性檢測的方法
背景技術(shù)：
：細胞色素P450是一類參與內(nèi)源性和外源性化合物代謝的酶，該酶主要存在于生物體的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，屬于混合功能氧化酶系統(tǒng)中的一種，由CYP450(細胞色素P450酶)酶系作用的藥物生物轉(zhuǎn)化是藥物代謝的重要環(huán)節(jié)，同時許多藥物又對CYP450酶系活性有抑制或誘導作用。藥酶CYP450某一亞型受到誘導或抑制時均可誘發(fā)藥物相互作用，例如同時服用西米替丁和特非那丁，由于特非那丁主要由細胞色素CYP3A(CYP450亞酶)代謝，而西米替丁對CYP3A有強抑制作用，合并用藥會引起特非那丁血藥濃度升高而致心臟毒性，從而誘發(fā)尖端扭轉(zhuǎn)型室速。藥物如果對細胞色素P450(CYP450)酶有抑制作用，則會引起藥物相互作用，而藥物相互作用就可能引起嚴重的不良反應。因此在藥物的研發(fā)過程中進行臨床前(體外)和臨床(體內(nèi))相互作用研究非常重要，對于藥物的臨床應用有重要意義。肝臟是生物體對藥物代謝的主要臟器，研究藥物的肝臟代謝對于藥物體內(nèi)代謝途經(jīng)研究有著重要意義，目前細胞色素P450與藥物代謝之間關(guān)系研究日趨增多，利用肝微粒體作為體外孵育體系對細胞色素P450酶系進行研究已經(jīng)是公認的成熟的實驗平臺，但是常規(guī)肝微粒體測定法需要的肝臟組識量大，達5g，而且手續(xù)很繁雜，超速離心后再要進行高速離心。超速離心不僅設備昂貴(約需4-7萬美金)，而且離心時間長(70min)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是建立一種可靠、簡便的微量肝組織體外孵育進行CYP450酶活性檢測的方法，用液相色譜串聯(lián)質(zhì)潛法檢測探針底物和相應代謝產(chǎn)物濃度，以它們的代謝比，求出P450酶的活性，從而預測與細胞色素P450酶相關(guān)的代謝性藥物相互作用。為達到上述目的，采用的技術(shù)方案是，臨床用肝微量穿刺法取0.10.2g微量肝組織，或動物試驗處死小鼠取出肝臟，建立微量肝組織體外孵育體系，再用液相色譜串聯(lián)質(zhì)潛法(簡稱LC-MS/MS)檢測探針底物和相應代謝產(chǎn)物濃度，以它們的代謝比，求CYP450酶的活性。具體步驟是1.溶液配制l.l勻漿液KC16g、三羥甲基氨基甲垸(簡稱Tris)3.0g加入至500ml蒸餾水中；1.2孵育液:500ml蒸餾水中加入K2HP(Xllg，再用HC1調(diào)節(jié)pH至7.4;1.3沉淀劑三氯乙酸(簡稱TCA)加蒸餾水制成重量體積比10%(mg/ml)的溶液備用；1.4探針底物和代謝產(chǎn)物儲備液分別稱取適量探針底物A和相應的代謝產(chǎn)物B，用甲醇溶解并稀釋至所需濃度lmg/ml的甲醇溶液；這里所述探針底物A和相應的代謝產(chǎn)物B是指非那西丁(簡稱PN)/對乙酰氨基酚(簡稱ACE)、或咖啡因/副黃嘌呤(CYP1A2)、或右美沙芬/右非烷(CYP2D6)、或甲苯磺丁脲/4-羥基甲苯磺丁脲/羧基甲苯磺丁脲(CYP2C9)、或奧美拉唑/5-羥基奧美拉唑(CYP2C19)、或咪達唑侖A'-羥基咪達唑侖(CYP3A4)2.樣品處理2.1臨床用肝微量穿刺法取0.10.2g微量肝組織，或動物試驗處死小鼠取出肝臟稱重。2.2.以重量體積比1:3(mg/ml)比例加入步驟1.1所述勻漿液，制成勻漿，再在4°C以下lOOOOg離心20min得到上清液。3.孵育體系3.1配制設孵育體系終體積為250ul，在離心管中按要求加入下列各物質(zhì)稱12.2mgMgCl26H20溶于lml蒸餾水中，取用25u1;稱6.0mgP-煙酰胺腺苷二核苷磷酸(簡稱P-NADP)溶于lml孵育液中，取用25"1;稱22.6mg磷酸葡萄糖(簡稱6—G-p)溶于lml孵育液中，取用25nl;取5"16—G-p酶于100u1的孵育液中稀釋，取用5p1;加入步驟1.2所述孵育液95u1;加入步驟2.2所述勻漿上清液50y1;以及加入25u1經(jīng)稀釋到濃度為lOOug/ml的步驟1.4所述藥物探針底物A儲備液的甲醇溶液，。3.2孵育將上述配制好的孵育體系，置于37'C恒溫水浴中孵育30min，再在4'C以下10000g離心20min后，取離心上清液100ul，加步驟1.2所述孵育液350u1，混合均勻后取100u1，加步驟1.3配制的沉淀劑TCA溶液100u1，再混勻，取混合液用20%的甲醇稀釋10倍，作為單探針藥物LC-MS/MS測定進樣樣品，再用液相色譜串聯(lián)質(zhì)潛法檢測探針底物和相應代謝產(chǎn)物濃度，以它們的代謝比，求出P450酶的活性，評價藥物對肝臟P450亞酶的影響。本發(fā)明的有益效果是與常規(guī)肝微粒體測定方法相比，本發(fā)明的優(yōu)點是-1.微量常規(guī)的肝微粒體提取法需要取肝臟組織5g，而本發(fā)明只需要0.l0.2g的微量肝組織就可以進行細胞色素P450酶活性的檢測。在臨床和動物實驗中能取到的肝臟只能是很微量的，因此本發(fā)明不僅可用于動物實驗，而且可用于臨床微量肝組織肝藥酶活性檢查。2.省時簡便肝微粒體孵育體系的處理過程需差速離心，即先用超速離心，再用高速離心，本發(fā)明不僅省去了設備昂貴的超速離心這一步，大大節(jié)約了檢測的成本和時間，而且更接近肝組織代謝過程，更好地模擬了肝酶代謝環(huán)境。3.確立了可以評價酶代謝活性的指標代謝比。以下結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步說明-圖1為藥物C灌胃劑量與藥物代謝比關(guān)系圖。具體實施例方式實施例1:1.溶液配制l.l勻漿液KC16gTris3.Og加入至500ml蒸餾水中1.2孵育液:500ml蒸餾水中加入K2HP04llg，再用HC1調(diào)節(jié)pH至7.4;1.3沉淀劑TCA加蒸餾水制成10X(W/V)的溶液備用。1.4探針底物和代謝產(chǎn)物儲備液PN、ACE分別稱取適量，用甲醇溶解并稀釋至所需濃度110mg/ml的甲醇溶液。2.樣品2.l健康昆明鼠20只，雄性，隨機分成四組，每組5只稱重，第一天禁食12小時后灌胃，對照組給予生理鹽水，其他三組分別給予藥物C(如黃連素衍生物)高中低相應劑量藥物，低劑量組0.3mg/ml、中劑量組0.6mg/ml、高劑量組L2mg/ml。2.2.每天灌胃，晚上禁食，持續(xù)8天，第八天或微量肝穿刺取0.10.2g肝組織、或處死小鼠取出肝臟、稱重，以1:3(mg/ml)比例加入步驟1.1所述勻漿液，制成勻漿，再在4'C以下10000g離心20min得到上清液。3.孵育體系3.1配制設孵育體系終體積為250"1，在離心管中按要求加入下列各物質(zhì)稱12.2mgMgCl2.6H20溶于lml蒸餾水中，取用25uI;稱6.Omge-NADP溶于lml孵育液中，取用25"1;稱22.6mg6—G-p溶于lml孵育液中，取用25iU;取5ul6—G-p酶于100的孵育液中稀釋，取用5ul;加入步驟1.2所述孵育液95"1;加入步驟2.2所述勻漿上清液50n1;以及加入步驟1.4所述藥物PN的甲醇溶液25u1，濃度為100ug/ml。3.2孵育將上述配制好的孵育體系，置于37'C恒溫水浴中孵育30ndn，再在4。C以下10000g離心20min后，分別取所得勻漿上清液100u1，加步驟1.2所述孵育液350ul，混合均勻后取100ul，再加步驟1.3所述沉淀劑TCA100yl，取混勻后混合液用20%的甲醇稀釋10倍，作為單探針藥物LC-MS/MS法測定的進樣樣品備用。4.單探針藥物LC-MS/MS法測定4.1標準品和質(zhì)控品的配制從步驟1.4所述探針底物和代謝產(chǎn)物儲備液中將PN、ACE用步驟1.2所述孵育液稀釋成lmg/ml(稀釋液)，按PN:ACE-1:1比例，與步驟1.2所述孵育液配制得各物質(zhì)的標準品和質(zhì)控品，濃度范圍1Ug/ml—500ug/ml。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注S:標準品工作液；Q:質(zhì)控品工作液。4.2.樣品于各尖底管中分別加入步驟4.1所述各溶液50n1，再加入步驟2.2所述肝臟勻漿上清液1001以及步驟1.2所述孵育液350u1混勻，再取混合液100n1加入100y1的沉淀劑，再混勻，用20%的甲醇稀釋10倍。4.3液相色譜條件分析柱CapcelPakCl8(2.0mmI.D.X100mm,5um，No:AKIA01046)，預柱；流動相0.1%的甲酸水溶液和0.1%的甲酸乙腈溶液；流速0.3ml/min;柱溫室溫；進樣體積20ul;分析時間7.5min;保留時間PN:5.47min;ACE:4.05min。梯度洗脫程序為03分鐘，水相從90%變成45%;3.03.1分鐘，水相回復至90%，平衡4min。4.4質(zhì)譜條件質(zhì)譜條件電噴霧離子源，正離子掃描；霧化氣12;碰撞氣12;氣簾氣10;離子源電壓5500;離子源溫度450;MRM掃描分析，離子選擇通道分別為180.0/110.0(PN)，152/110.0(ACE)。其他參數(shù)見下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注Ql一級質(zhì)譜;Q3三.級質(zhì)潛；DP去簇電壓；FP聚焦電壓；EP入口電壓CE碰撞能；CXP出口電壓；4.5測定取步驟4.1配制的標準品、質(zhì)控品和步驟4.2配制的樣品各10u1進樣。4.6計算步驟2.1所述樣品，肝臟生化功能及CYP1A2酶活性的變化數(shù)據(jù)列于下表(每只小鼠測三次)，用外標法以峰面積計算，得代謝比。NO.PNng/mlACEng/ml比值每只平均代謝率每組平均代謝率空白組1-126490.90.341-229789.90.301-33081110.362-13091030.332-230089.40.302-3303930.313-12181250.573-23071090.363-33151300.414-12951180.404-23191240.394-32881280.445-12431740.725-22041350.665-32451650.670.330.310.450.410.680.44中劑量組1-11861650.891-21841500.821-31521460.962-11691731.022-21451521.052-31851630.883-12011510.753-21771510.853-31731710.994-11561561.004-21821290.711901802011861812042522422332482472591741981691521371531601671591221261451291041301471501670.800.760.760.860.920.780.480.520.620.520.420.500.840.760.990.770.850.540.480.860.70低劑量組1-123i譽2312322330^>123444翻52■4-31581530.970.895-11391481.065-21701110.655-31701630.960.890.90高劑量組1-12851220.431-22351190.511-32491060.430.452-11961380.702-22041660.812-31781480.830.783-11481551.053-21472011.373-31321951.481.304-12301400.614-21721620.944-31241281.030.865-11501821.215-288.61701.925-31371891.381.500.98結(jié)論由上表數(shù)據(jù)可見，藥物C灌胃量增加，平均代謝率也相應增加，證明藥物C是CYP1A2的誘導劑。實施例2.高中低劑量藥物C給小白鼠灌胃后CYP1A2酶活性變化的確證實驗1.健康昆明鼠32只，雄性，隨機分成四組，每組8只，稱重。2.空白對照組(生理鹽水)，低劑量組0.64mg/ml、中劑量組1.6mg/ml、高劑量組4mg/ml劑量組。3.第一天禁食12小時后灌胃，對照組給予生理鹽水，其他各組給予高中低相應劑量藥物。4.每天灌胃，晚上禁食，持續(xù)8天，第八天處死小鼠取出肝臟。5..肝臟加非那西丁探針藥進行體外孵育，以LC-MS/MS檢測評價藥物C對肝臟CYP1A2的影響。溶液配制和孵育方法，以及LC-MS/MS檢測方法均與實施例1相同。驗證了實施例1的可重復性，再次證明藥物C是CYP1A2的誘導劑。權(quán)利要求1.一種微量肝組織體外孵育進行CYP450酶活性檢測的方法，其特征在于臨床用肝微量穿刺法取0.1～0.2g微量肝組織，或動物試驗處死小鼠取出肝臟，建立微量肝組織體外孵育體系，再用液相色譜串聯(lián)質(zhì)潽法檢測探針底物和相應代謝產(chǎn)物濃度，以它們的代謝比，求出P450酶的活性。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種微量肝組織體外孵育進行CYP450酶活性檢測的方法，其特征在于具體步驟是1)溶液配制1.l)勻漿液KC16g、Tris3.Og加入至500ml蒸餾水中；1.2)孵育液500ml蒸餾水中加入1(2朋04llg,再用HC1調(diào)節(jié)pH至7.4;1.3)沉淀劑TCA加蒸餾水制成10%(W/V)的溶液備用；1.4)探針底物和代謝產(chǎn)物儲備液分別稱取探針底物A和相應的代謝產(chǎn)物B適量，用甲醇溶解并稀釋至所需濃度lmg/ml的甲醇溶液2)樣品處理2.1)臨床用肝微量穿刺法取0.10.2g微量肝組織，或動物試驗處死小鼠取出肝臟稱重；2.2)以1:3(W/V)比例加入步驟1.1)所述勻漿液，制成勻漿，再在4'C以下10000g離心20min得到上清液；3)孵育體系3.1)配制設孵育體系終體積為250u1，在離心管中按要求加入下列各物質(zhì)稱12.2mgMgCl26H20溶于lml蒸餾水中，取用25n1;稱6.Omge-NADP溶于lml孵育液中，取用25u1;稱22.6mg6—G-p溶于lml孵育液中，取用25nl;取5ul6—G-p酶于100u1的孵育液中稀釋，取用5ul;加入步驟1.2)所述孵育液95u1;加入步驟2.2)所述勻漿上清液50u1;以及加入25u1稀釋到濃度為100ug/ml的步驟1.4)所述藥物探針底物A儲備液的甲醇溶液；)孵育將上述步驟3.1)配制的孵育體系，置于37nC恒溫水浴中孵育30min，再在4。C以下10000g離心20min后，分別取離心上清液IOOU1，加步驟1.2)所述孵育液350ul，混合均勻后取100ul，加步驟1.3)配制的沉淀劑TCA100nl，再混勻，取混合液用20%的甲醇稀釋10倍；4)單探針藥物LC-MS/MS法測定將上述步驟3.2)配制的孵育液作為單探針藥物LC-MS/MS測定進樣樣品，再用液相色譜串聯(lián)質(zhì)潛法檢測探針底物和相應代謝產(chǎn)物濃度，以它們的代謝比，求出P450酶的活性，預測與細胞色素P450酶相關(guān)的代謝性藥物相互作用。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種微量肝組織體外孵育進行CYP450酶活性檢測的方法，其特征在于所述探針底物A/相應的代謝產(chǎn)物B是非那西丁/乙酰氨基酚、或咖啡因/副黃嘌呤、或右美沙芬/右非烷、或甲苯磺丁脲/4-羥基甲苯磺丁脲或/羧基甲苯磺丁脲、或奧美拉唑/5-羥基奧美拉唑、或咪達唑侖/l-羥基咪達唑侖。全文摘要一種微量肝組織體外孵育進行CYP450酶活性檢測的方法，其特征在于臨床用肝微量穿刺法取0.1～0.2g微量肝組織，或動物試驗處死小鼠取出肝臟，建立微量肝組織體外孵育體系，再用單探針藥物進行液相色譜串聯(lián)質(zhì)潽法檢測探針底物和相應代謝產(chǎn)物濃度，以它們的代謝比，求出P450酶的活性。本發(fā)明的優(yōu)點是1.微量只需要0.1～0.2g的微量肝組織就可以進行細胞色素P450酶活性的檢測，不僅可用于動物實驗，而且可用于臨床微量肝組織肝藥酶活性檢查；2.省時簡便省去了常規(guī)方法中需設備昂貴的超速離心，不僅大大節(jié)約了檢測的成本和時間，而且更好地模擬了肝酶代謝環(huán)境；3.確立了可以評價酶代謝活性的指標代謝比。文檔編號G01N30/00GK101308119SQ20081003612公開日2008年11月19日申請日期2008年4月16日優(yōu)先權(quán)日2008年4月16日發(fā)明者琛余,紅周,周菊珍,淵張,施孝金,李春霞,李雪寧,王書云,陳偉力申請人:上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院