專利名稱：基于測(cè)定γ-分泌酶Aβ切割產(chǎn)物的比值診斷阿爾茲海默病的方法
基于測(cè)定Y -分泌酶A卩切割產(chǎn)物 的比值診斷阿爾茲海默病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于診斷阿爾茲海默病(AD)或疾病特定階段的 方法，該方法基于測(cè)定A|348、 A卩45、 A卩42、 A|338和A卩35中至少兩 種Y-分泌酶切割產(chǎn)物的比值，優(yōu)選測(cè)定A(338和A(342的比值。A(B8 和A(342的比值與其正常比值減小表明患阿爾茲海默病。本發(fā)明還提 供了適用于實(shí)施所述診斷方法的試劑盒。
為診斷阿爾茲海默病(AD)并將其與其它癡呆癥區(qū)別開(kāi)來(lái)，人們釆 用了各種方法。這些診斷方法包括為使腦部異?？梢暬?，使用計(jì)算機(jī) 斷層掃描(CT)、核磁共振成像(MRI)或正電子放射斷層掃描(PET)"掃 描"腦部。另一種診斷方法是細(xì)微精神狀態(tài)檢查(MMSE)，它以特定 的認(rèn)知問(wèn)題(短期記憶、長(zhǎng)期記憶、重復(fù)試驗(yàn))試驗(yàn)為基礎(chǔ)，因此， 可以對(duì)患者解決問(wèn)題的能力、語(yǔ)言認(rèn)知能力等作出不同的評(píng)價(jià)。熟悉 各種癡呆癥的神經(jīng)病學(xué)家、老年醫(yī)學(xué)專家和精神病學(xué)家認(rèn)為該實(shí)驗(yàn)可 以做出精確的診斷。因此細(xì)微精神狀態(tài)檢查成為當(dāng)前診斷的基礎(chǔ)。
另 一種診斷方法是基于利用選擇性試驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)，測(cè)定體液例如血 液、溶液、尿等中的疾病特有的化合物(生化標(biāo)記物、生物標(biāo)記物)。 這種方法可以測(cè)定疾病引起的濃度變化-甚至在疾病的早期，那時(shí)臨 床癥狀可能較輕并且不明顯。然而該實(shí)驗(yàn)存在問(wèn)題，因?yàn)闉榱嗽缙谠\ 斷并且準(zhǔn)確地將阿爾茲海默病與其他癡呆區(qū)分開(kāi)來(lái)，必須選擇性地檢 測(cè)低濃度的生化標(biāo)記物。為了增強(qiáng)診斷的精確性，釆用特定的生化標(biāo) 記物如p-淀粉樣蛋白和tau蛋白。tau蛋白在微管腦脊髓液(CSF)水平 被認(rèn)為能反映神經(jīng)元和軸索變性或者能夠形成神經(jīng)纖維糾結(jié)。因此， tau蛋白被認(rèn)為是神經(jīng)元功能障礙(Creutzfeldt-Jacob、阿爾茲海默病 等)的通用生物標(biāo)記物。在阿爾茲海默病以及其他的神經(jīng)退行性疾病 中tau蛋白水平適度升高(在克雅氏病中顯著升高)，其中在阿爾茲海默病中磷酸化tau蛋白顯著升高。
當(dāng)前，淀粉樣P蛋白(Ap)被認(rèn)為是最重要的診斷參數(shù)，因?yàn)?這種肽是形成腦部斑塊如外細(xì)胞沉積物(淀粉樣變性病)的原因，該
斑塊是阿爾茲海默病早期的典型癥狀。淀粉樣前蛋白1型跨膜(TM)
蛋白，經(jīng)歷數(shù)種分泌酶蛋白水解過(guò)程。首先，淀粉樣前蛋白的胞外區(qū)結(jié)
構(gòu)域主體需要由膜結(jié)合a-或(3-分泌酶切除，產(chǎn)生分泌形式的淀粉樣前 蛋白和相應(yīng)的膜結(jié)合的a-或p-細(xì)胞毒素因子的C-末端片段。由Y-分泌酶引起的(3-細(xì)胞毒素因子的調(diào)節(jié)膜內(nèi)蛋白水解(RIP)僅在外功能 區(qū)脫落之后發(fā)生并從膜中釋放出A(3肽?；钚訷 -分泌酶復(fù)合物由四種 亞基即早老因子(PS-I)、 APH-I、 PEN-2和nicastrin組成。早老因子 在跨膜序列(TMS)-6和跨膜序列(TMS)-7中含有兩個(gè)催化活性的天門(mén) 冬氨酸殘基。PS-1是蛋白內(nèi)切割，它的N端和C端片段在Y-分泌酶 的催化核心中以二聚體形式存在。細(xì)胞毒素因子N端通過(guò)nicastrin 識(shí)別，其作用為Y-分泌酶底物受體。Y-分泌酶在不同的位點(diǎn)切割， 因此產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的(3肽。由于AP肽蓄積形成淀粉樣蛋白斑因而與 阿爾茲海默病緊密相關(guān)。(3類中A(342是病理學(xué)上最相關(guān)的形式，因 為它更易于聚集并且據(jù)發(fā)現(xiàn)在阿爾茲海默病患者腦中水平升高。
最近討論的Y-分泌酶切割機(jī)理暗示以連續(xù)的蛋白水解步驟釋放 蛋白。因此，最先的切割發(fā)生在跨膜序列(TMS)細(xì)胞質(zhì)邊緣，在s位 點(diǎn)，即P-細(xì)胞毒素因子的第49位殘基。產(chǎn)物AP49仍然與膜結(jié)合并 且在連續(xù)作用方式中進(jìn)一步加工得到AP46( ^-位點(diǎn))和AP40或A卩42 (Y-位點(diǎn))(圖IA)。近來(lái)報(bào)道了通過(guò)一種類似的連續(xù)機(jī)理由Y-分泌 酶對(duì)Notch (凹口 )進(jìn)行加工。之前的研究顯示淀粉樣蛋白形成同類 二聚體，因?yàn)橐呀?jīng)觀察到它可作為其他的Y-分泌酶底物，例如受體 酪氨酸蛋白激酶ErbB-4和E-cadherin。淀粉樣前蛋白的同類二聚體形 成可能由細(xì)胞外區(qū)域兩個(gè)不同的位點(diǎn)介導(dǎo)，第一個(gè)位點(diǎn)是包含殘基 91-111的環(huán)區(qū)，第二個(gè)位點(diǎn)是與膠原結(jié)合位點(diǎn)重疊的包含殘基448-465的片段。
最近的研究中，將阿爾茲海默病患者與健康個(gè)體的A(340和A卩42 水平進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示兩組中A(340的水平?jīng)]有差異，然而阿爾 茲海默病患者的A(342水平降低。不幸的是，觀察到不同的阿爾茲海 默病患者中A|342的絕對(duì)濃度差異顯著("高"個(gè)體vs."低"個(gè)體)。 這些絕對(duì)濃度值的差異表明得到的數(shù)據(jù)受各種因素影響(樣品狀態(tài)、 使用的分析系統(tǒng)等)。因此，需要確定極限值以發(fā)展一種可靠的診斷 方法幾乎是不可能的。此外，在散發(fā)性的阿爾茲海默病的過(guò)程中，可 以觀察到淀粉狀蛋白的各種不同水平。因此，對(duì)于精確診斷阿爾茲海 默病，僅檢測(cè)A^42的濃度是不夠的。換言之，目前，尚沒(méi)有可用于 診斷阿爾茲海默病、其特定階段或者用于診斷患阿爾茲海默病風(fēng)險(xiǎn)增 加的可靠標(biāo)記物。因此，本發(fā)明根本的技術(shù)問(wèn)題是要提供一種用于可 靠的(早期)診斷阿爾茲海默病(AD)或所述疾病特定階段的標(biāo)記物。
通過(guò)提供權(quán)利要求書(shū)中表征的具體實(shí)施方式
獲得所述技術(shù)問(wèn)題 的解決方案。在導(dǎo)致本發(fā)明的試驗(yàn)期間，GxxxG基序被發(fā)現(xiàn)可介導(dǎo) APP的跨膜片段的螺旋-螺旋相互結(jié)合。該基序代表一種獨(dú)特的Y-分泌酶底物CTF的嗜同種相互作用位點(diǎn)并通過(guò)最后的Y-分泌酶切割 控制生成A卩的進(jìn)程?；蛲蛔円约半S后的蛋白種類分析顯示連續(xù)切 割發(fā)生在兩組已識(shí)別的切割物(I) 49_46_ 43_40-37-34和(II) 48_45-42-38-35 (蛋白編號(hào))。越來(lái)越多的證據(jù)表明這類蛋白通過(guò)連續(xù)
的Y-分泌酶對(duì)螺旋-轉(zhuǎn)角和螺旋-轉(zhuǎn)角切割產(chǎn)生，該切割起自C端并 發(fā)展到AP-CTF底物的N端。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)監(jiān)測(cè)疾病發(fā)展的診斷方法產(chǎn) 生了直接的影響。因此，A(338/A(342的比值對(duì)于AD的特異性診斷以 及疾病確切階段的確定均是一種理想的標(biāo)記物。此外，人們發(fā)現(xiàn)來(lái)自 兩種產(chǎn)物物種的AP38/AP37的比值能通過(guò)包括兩種產(chǎn)物品系的y-分 泌酶活性的第二讀數(shù)點(diǎn)增強(qiáng)現(xiàn)有試驗(yàn)體系的可靠性。
基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)方法，本研究結(jié)果還提供了令
6人注目的證據(jù)即APP在活細(xì)胞中形成二聚體?？紤]到APP同類二聚
體最早是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ER中形成，APP的兩個(gè)胞外域接觸位點(diǎn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)
中即可開(kāi)始相互作用。接著這兩種被俘獲的多肽鏈在脂雙層中排列對(duì)
接，并通過(guò)APP跨膜序列(TMS)中連續(xù)的GxxxG基序得到進(jìn)一步 穩(wěn)定。該基序提供了疏水環(huán)境中兩種a-螺旋二聚化的模板。與APP 類似，其他的Y-分泌酶底物，在其跨膜序列(TMS)中具有單一 GxxxG 基序，能形成全長(zhǎng)同類二聚體，例如ErbB-4， E-cadherin， Nectin-l和 APLP-I。
本研究還表明這種相互作用主要由GxxxG基序的甘氨酸殘基 G29和G33介導(dǎo)并且確立了 GxxxG基序在APP加工中起著關(guān)鍵的 功能性作用。二聚底物(野生型)和主要是單體的底物，例如A(3-CTF 突變體G331，可以同樣有效地被Y-分泌酶切割。對(duì)GxxxG突變體而 言，A(342和A(338被觀察到出現(xiàn)逆向變化，而A(340的水平卻由于突 變體G33I喪失二聚化功能出現(xiàn)專一性降低。
基于最近提供的模型，Y-分泌酶的加工是一種連續(xù)的過(guò)程，該 加工過(guò)程從跨膜序列(TMS) C端的49/48位置開(kāi)始，然后在位置46/45 和42/40處切割，從而去除螺旋轉(zhuǎn)角。正常情況下，AP-CTF的加工 在步驟42/40大部分被抑制，這導(dǎo)致A(342和A(340的水平較高。根 據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)，順序切割模型得到進(jìn)一步發(fā)展，該模型提出上述抑制是 由于底物A(3- CTF的二聚化狀態(tài)引起，而二聚體底物的兩種a-螺旋 在殘基G29和G33處形成交叉點(diǎn)導(dǎo)致了 Y-分泌酶的空間位阻(圖 5B)。 APP跨膜序TMS 二聚化是獨(dú)特的，因?yàn)樗俏ㄒ灰阎脑诳?膜序列TMS起始處帶有三份GxxxG基序的Y-分泌酶底物。APP跨 膜序列(TMS)二聚化強(qiáng)度的任何變化可通過(guò)消除空間位阻調(diào)整實(shí)際 優(yōu)選的切割位點(diǎn)。候選因素是非甾族抗炎藥(NSAIDs)，據(jù)報(bào)道該類藥 物例如舒林酸硫化物和氟吡洛芬能影響不同A|3的生成。跟GxxxG 突變體類似的是，所試驗(yàn)的非甾族抗炎藥可以降低AP42水平并選擇性增加AP38的生成，反之依然。對(duì)于大多數(shù)非甾族抗炎藥，A(340 的水平并不受影響。因此，某些非甾族抗炎藥可直接影響底物Ap-CTF二聚化的強(qiáng)度。然而，非甾族抗炎藥也有可能對(duì)PS-I的跨膜序 歹'J(TMS)-7或APH-I的跨膜序列(TMS)-4或跨膜序列(TMS)-6的 GxxxG基序產(chǎn)生影響進(jìn)而改變活性位點(diǎn)的構(gòu)象。
A(3- CTF 二聚化強(qiáng)度的減小使得Y -分泌酶進(jìn) 一步切割至N端， 產(chǎn)生A(338和A(337(圖5B)。因此，本發(fā)明的結(jié)果確認(rèn)并擴(kuò)充了現(xiàn)有 的Y -分泌酶切割模型，對(duì)這種酶的主要切割機(jī)理提供了詳細(xì)深刻認(rèn) 的識(shí)(圖5B)。對(duì)于APP，通過(guò)GxxxG基序的殘基G29和G33進(jìn)行 的跨膜序列(TM S)的二聚化決定了 Y -分泌酶的切割位點(diǎn)的發(fā)生部位 以及是否AP42能離開(kāi)膜或者產(chǎn)生更短的形式。這種高級(jí)模型預(yù)測(cè)到 Y -分泌酶不僅參與AICD的產(chǎn)生并且具有A(3清除功能，即連續(xù)的切 割底物直到膜中釋放出更多的親水性蛋白，例如A|33 8 。
總之，根據(jù)本研究的試驗(yàn)觀察，存在因Y-分泌酶活性而產(chǎn)生的 兩種不同的產(chǎn)物種類，即，(I) 49-46-43-40-37_34和(II) 48-45-42-38-35。這些種類通過(guò)Y-分泌酶的獨(dú)立切割產(chǎn)生，該切割起 自底物AP- CTF的C端并發(fā)展至其N(xiāo)端。在AD中，第二種產(chǎn)物水 平發(fā)生變化而第一種產(chǎn)物水平保持恒定。因此，產(chǎn)物種類II的Y-分 泌酶切割產(chǎn)物之間的任何比值將提供疾病及其階段的信息。由于跟同 一種類的其他產(chǎn)物相比，種類42和38的水平顯著，并且Y-分泌酶 通過(guò)底物二聚化調(diào)節(jié)，因此AP42在疾病早期增加，優(yōu)選將AP38/A(342 的比值作為標(biāo)記物。
最后可以下此結(jié)論底物(3- CTF的強(qiáng)二聚化作用對(duì)AD至關(guān)重 要，任何穩(wěn)定二聚化作用的情況均會(huì)增加形成有毒低聚物A|342的形 成。靶向APP跨膜序列(TMS)二聚化作用并干擾兩種Y-分泌酶底物 分子的G29XXXG33相互作用基序的化合物可被用作預(yù)防Ap42產(chǎn)生 的治療劑。附圖簡(jiǎn)述
圖1: APP全長(zhǎng)二聚化不依賴GxxxG基序
(A) APP-跨膜序歹'j(TMS)序列。編號(hào)三種連續(xù)的GxxxG基序的甘 氨酸殘基(灰盒)。膜植入序列用黃盒標(biāo)記。Y-分泌酶切割位點(diǎn)用箭頭 在序列上指明。
(B) APPwt-YFP和APP-YFP突變體的共聚焦顯微鏡鏡像顯示等 亞細(xì)胞定位；線10uM。
(C) 熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)方法熒光APPwt 二聚體與 APPwt-Flag競(jìng)爭(zhēng)(平均數(shù)士s.e.m., n=4,每個(gè)3-6細(xì)胞)。作為陰性 對(duì)照，APP-YFP wt與EGFR- CFP沒(méi)有相互結(jié)合。
(D) 野生型和突變體APP的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET )效能(平 均數(shù)士s.e.m.， n=5評(píng)價(jià)一式四份)。請(qǐng)注意，與D相比，C中APPwt 熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率較低，這是由于較低的質(zhì)粒含量并且因此與內(nèi) 源的APP競(jìng)爭(zhēng)。
(E) 在受體(FYPP)的選擇性光致漂白期間，供體熒光恢復(fù) (deltaFCFp)的時(shí)間過(guò)程。數(shù)據(jù)表示單細(xì)胞(灰線)和一個(gè)有代表性的 細(xì)胞群的平均數(shù)(黑線)
(F) 供體恢復(fù)(deltaFCFp)與部分受體(YFP)光致漂白的線性回歸 分析。描述了來(lái)自典型實(shí)驗(yàn)的單細(xì)胞平均值，如D中所示。
圖2 :通過(guò)G29XXXG33基序APP跨膜序列(TMS)發(fā)生二聚化 (A )表示ToxR-體系嵌合蛋白質(zhì)。所研究的跨膜序列(TMS)在 麥芽糖-結(jié)合蛋白(MBP)和ToxR轉(zhuǎn)錄激活子之間插入。經(jīng)二聚化， ToxR-區(qū)域開(kāi)始轉(zhuǎn)錄編碼(3-半乳糖苷酶的lacZ基因。
(B) ToxR-測(cè)定。指明經(jīng)測(cè)試的42wt的A卩殘基29。將測(cè)定的 wt-序列的卩-半乳糖苷酶的活性設(shè)為100 % (平均數(shù)士s.e.m., n=4 -6)。突變體G29A ，特別G33A降低了二聚化強(qiáng)度。突變體G29/33A 強(qiáng)化了單個(gè)突變體的影響而G33I表現(xiàn)出很強(qiáng)的二聚化破壞性。星號(hào)表明A(329-42wt的顯著性差異(^p < 0.01， **p < 1 x l(T15， student t-
檢驗(yàn))。
(C)全部嵌合體互補(bǔ)MBP-缺乏E.coli PD28細(xì)胞和使該細(xì)胞在 基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)進(jìn)而表明嵌合蛋白進(jìn)行了正確的膜整合。
圖3 :在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系SHSY5Y中表達(dá)和加工的APP和 SPA4CT
(A) APP-轉(zhuǎn)染細(xì)胞。22C11抗體用于檢測(cè)全長(zhǎng)的APP?？贵w W0-2 (抗原表位A卩殘基2-10 )被用來(lái)標(biāo)記sAPPalpha (sAPPa) 和免疫沉淀C-末端片段(P-CTF)和A(3。 sAPPbeta的免疫印跡用 抗體879 ( sAPPb )進(jìn)行檢測(cè)。豎線表明交換泳道的均勻標(biāo)記。
(B) SPA4CT-轉(zhuǎn)染細(xì)胞。免疫沉淀的(3-CTF的表達(dá)控制，使用抗 體W0-2(beta-CTF)進(jìn)行檢測(cè)的免疫印跡。使用抗體W0-2 (抗原表位 A(3殘基2-10)進(jìn)行檢測(cè)的免疫沉淀A卩的免疫印跡。
(C) 加工APP和構(gòu)建SPA4CT的圖示。SP:信號(hào)肽(在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被 切除)； 環(huán)環(huán)區(qū)殘基91-111; CBP:膠原結(jié)合位點(diǎn)殘基448-465; A卩A|3區(qū)域，APP外功能區(qū)的一部分和跨膜序列(TM); P-或a-分 泌酶在A(3區(qū)切割產(chǎn)生可溶性的APP(分別是sAPPbeta或sAPPalpha) 和C端片段(分別是beta-CTF或alpha-CTF)。 Y-分泌酶在膜內(nèi)切割 beta-CTF并產(chǎn)生A卩。
圖4:跨膜序列(TMS)二聚化強(qiáng)度決定了 Y-分泌酶的切割位點(diǎn)和 A(342的生成
(A， C)用來(lái)自APP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SHSYSY細(xì)胞的培養(yǎng)基作A(340-和A(342-專一性的ELISAs
(B， D)用來(lái)自SPA4CT穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SHSYSY細(xì)胞的培養(yǎng)基作 A|340-和A(342-專一性的ELISAs
(A-D)野生型wt設(shè)為1(K)o/o(平均數(shù)士s.e.m.， n = 3-6)。星號(hào)表 示與wt有顯著性差異。p〈0.01， **p<0.00001， studentt-檢驗(yàn))。二
10聚化減弱的突變體對(duì)A(340的水平?jīng)]有影響但顯著降低A(342的水平。 突變體G33I既降低了 AP40的水平也降低了 AP42的水平。突變體 G37A和G38A不能用ELISA進(jìn)行分析，因?yàn)橥蛔冇绊懥擞糜跈z測(cè) A(340或AP42的單克隆抗體的抗原表位。
(E) 來(lái)自APPwt-或APP G33I-轉(zhuǎn)染細(xì)胞的分泌A卩的MALDI-MS 譜。突變體G33I以消耗A(340或A(342為代價(jià)主要產(chǎn)生分泌的A卩37 和A(338。
(F) 用來(lái)自SPA4CT穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SHSY5Y細(xì)胞的培養(yǎng)基作針對(duì) AJ338的ELISAs突變體G29/33A設(shè)為100%(平均數(shù)± s.e.m.， n =
4)。星號(hào)表明與wt有顯著性差異。p〈0.01, **p<0.00001， studentt-
檢驗(yàn))。當(dāng)突變體的AP42水平降低并導(dǎo)致二聚化穩(wěn)定性降低時(shí)，A卩38 水平升高。
圖5: APP跨膜序列(TMS)和Y-分泌酶切割機(jī)制模型
(A) APP跨膜序列(TMS)與G29和G33螺旋-螺旋交界面的低 能量構(gòu)象的計(jì)算分子模型。
(B) 在APP跨膜序列(TMS)中假定的Y -分泌酶切割機(jī)制。順 序Y-分泌酶切割從C末端到N端進(jìn)行(以剪刀指明的位點(diǎn))。最后 切割的位點(diǎn)由跨膜殘基G29和G33介導(dǎo)的兩個(gè)APP分子的兩個(gè)螺旋 相互結(jié)合的強(qiáng)度決定。s -和G -切割不依賴于底物的二聚或單體形式
(綠色剪刀)。
穩(wěn)定的APP-跨膜序列(TMS)二聚體構(gòu)成了阻礙Y -分泌酶移動(dòng)的 空間位阻，以致最后的切割發(fā)生在殘基42/40之后并產(chǎn)生A(342和 A(340 (黃色的剪刀)。只有受擾動(dòng)的二聚體或單體底物使Y-分泌酶 繼續(xù)移動(dòng)至N-末端位點(diǎn)產(chǎn)生AP38和A(337 (紅色剪刀)。
圖6 : GxxxG突變效應(yīng)未受到APPsw或APParc突變體的削弱 將GxxxG突變體G33A， G29/33A或G33I與K670N M671L (sw) 或APParc E22G (arc)組合。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y細(xì)胞的培養(yǎng)基中測(cè)定sAPPalpha, A卩42, A卩40和A卩38的水平。將sAPPalpha, A卩42 和A卩40的總量與APPwt (設(shè)為100% )進(jìn)行比較，將A卩38跟D中 的APPsw以及H和L中的G29/33A突變體進(jìn)行比較。
CA-D)與APPwt比較的APPsw和APParc。
(E-H)GxxxG突變體與Swedish突變體組合。
(I畫(huà)L) GxxxG突變體與arctic突變體組合。I:用于arc G33I的 sAPPalpha為n=l。相對(duì)于參考值100%的顯著性用星號(hào)標(biāo)明(*p < 0.001, **p<lxl(T15, n=3-10)，線表示標(biāo)準(zhǔn)差。
圖7: APPGxxxG突變體G33A對(duì)FAD-Ps突變體具有主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)
用APPwt或者APPG33A混合PS-lwt或其突變體形式瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞。用ELISAs來(lái)定量Ap42和A(340的水平。
(A)PS-lwt或其突變體或者與APPwt混合或者與APPG33A混 合而產(chǎn)生的A卩40的水平(APPwt加PS-lwt被定為100%，平均數(shù)士 s.e.m.， n=2-4)
(B)PS-lwt或其突變體或者與APPwt混合或者與APPG33A混合 而產(chǎn)生的A(342的水平(APPwt加PS-lwt被定為100%,平均數(shù)士 s.e.m. ， n=2-4)
圖8 :結(jié)合于A卩的NSAIDs的一個(gè)子集
使用BIAcore系統(tǒng)進(jìn)行了實(shí)時(shí)結(jié)合研究。將A(342被固定在傳感 器芯片表面，對(duì)非甾體抗炎藥舒林酸硫化物，非諾貝特和布洛芬進(jìn)行 結(jié)合試驗(yàn)。
(A) 舒林酸硫化物濃度依賴性結(jié)合。
(B) 非諾貝特濃度依賴性結(jié)合，并可能誘導(dǎo)構(gòu)象的轉(zhuǎn)變。
(C) 由于對(duì)照溶劑DMSO在響應(yīng)單元誘導(dǎo)同樣的增加，布洛芬 不與A卩結(jié)合。
因此，本發(fā)明提供了一種阿爾茲海默病或或其階段的診斷方法， 所述方法包括以下步驟(a) 將來(lái)自患者的樣品與探針接觸，該探針與Y-分泌酶切割產(chǎn)物 A卩48、 A卩45、 A(342、 A(338和A卩35中的至少兩種特異性結(jié)合；和
(b) 測(cè)定所述樣品中切割產(chǎn)物的含量，其中所述切割產(chǎn)物的比值 與正常比值相比異常表明患阿爾茲海默病。
本發(fā)明還提供了 一種監(jiān)測(cè)阿爾茲海默病治療進(jìn)展的方法，所述方 法包括下述步驟
(a) 將來(lái)自患者的樣品與探針接觸，該探針與至少兩種Y-分泌酶 分離產(chǎn)物A(348、 A(345、 A|342、 A(338和A|335特異性結(jié)合；和
(b) 測(cè)定所述樣品中切割產(chǎn)物的含量，其中與治療開(kāi)始時(shí)的比值 相比，所述切割產(chǎn)物的比值正常表明有治療效果。
本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)"正常比值"指能在健康個(gè)體中發(fā)現(xiàn)并能通過(guò) 如從至少10個(gè)，優(yōu)選至少I(mǎi)OO個(gè)個(gè)體中獲得的平均值確定的比值。
適于實(shí)施本發(fā)明診斷方法的樣品為腦脊髓液(CSF)、血液、血清、 血漿或尿液，優(yōu)選腦脊髓液和血液。使用常規(guī)方法從患者中取樣，例 如通過(guò)腰推穿刺取腦脊髓液。
在本發(fā)明上述方法的優(yōu)選實(shí)施方式中，測(cè)定所述樣品中A(338和 A卩42的含量，其中跟正常比值相比A|338和A(342的比值減小表明 患阿爾茲海默病。
在本發(fā)明方法的更優(yōu)選實(shí)施方式中，測(cè)定所述樣品中含量，其中 (i)跟正常比值相比AP38和A|342的比值減??；跟正常濃度相比 A卩42的濃度增大表明處于AD早期和(ii)跟正常比值相比A|338和 A卩42的比值減??；且跟正常濃度相比AP42的濃度減小或正常表明 處于AD晚期。
在本發(fā)明診斷方法的更優(yōu)選實(shí)施方式中，AP38和A(342的比值 減小指八卩38:八|342 <=1.5;優(yōu)選<=1.2;更優(yōu)選<=1.0。
任何允許測(cè)定樣品中A(338 、 AP42等的水平的方法均可用于本 發(fā)明，例如免疫測(cè)定、粒析等，例如通過(guò)凝膠過(guò)濾、氨基酸分析等，
13優(yōu)選免疫測(cè)定和基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(MALDI-MS)。
在本發(fā)明方法的更優(yōu)選實(shí)施方式中，釆用AP38等的專一性抗體 通過(guò)免疫學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行A(338、 A(342等的含量測(cè)定，即抗A(338抗體基 本上不與AP42發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，反以亦然，抗AP42抗體基本上不與 人A(338發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。適合的抗體為巿購(gòu)獲得，例如抗體G2-10(抗 -A卩40)和G2-13 (抗A(342)購(gòu)自蘇黎世的TGC。
本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)"抗體"，優(yōu)選，涉及基本由具有不同抗原表 位特性的合并單克隆抗體組成的抗體，以及不同的單克隆抗體制劑。 單克隆抗體是釆用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法由分別含有hA|342肽 和hA卩38的片段制得(參見(jiàn)，例如,Kohler等，Nature 256期(1975), 495)。本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)"抗體"(Ab)或"單克隆抗體"(Mab)意 指包括能與蛋白特異性結(jié)合的完整分子以及抗體片段(例如，F(xiàn)ab和 F(ab')2片段)，F(xiàn)ab和F(ab')2片段缺少完整抗體的Fc片段。
在本發(fā)明方法進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，抗-A(338-抗體指A(338 的C端和抗-A(342-抗體指A(342的C端(也參見(jiàn)G2- 13抗體的產(chǎn)品信 息，TGC， Zurich)。優(yōu)選地，與抗原表位結(jié)合的抗體僅存在于將被檢 測(cè)的蛋白種類上。
本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)"抗原表位"意指包括與抗體分子特異性相互 反應(yīng)相關(guān)的任何決定子?？乖砦粵Q定子通常由化學(xué)活性表面分類的 分子例如氨基酸或糖側(cè)鏈組成并具有特定的三維特征以及特定的電 荷特性。
探針，例如抗體，可被檢測(cè)標(biāo)記，例如，使用放射性同位素，一 種生物發(fā)光化合物、 一種化學(xué)發(fā)光化合物、 一種熒光化合物、 一種金 屬螯合物或一種酶(例如辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酯酶、P-半乳糖 苷酶、蘋(píng)果酸脫氫酶、葡萄糖氧化酶、脲酶、觸酶等)標(biāo)記，當(dāng)與底 物接觸時(shí)，其依次可與底物反應(yīng)產(chǎn)生可被檢測(cè)的化學(xué)部分。該探針也 可被固定于不溶的載體上，例如玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、天然或改性纖維素、聚丙酰胺、瓊脂糖和磁珠。
適于本發(fā)明方法的免疫測(cè)定的實(shí)施例為竟?fàn)幮曰驃A心分析法。例
如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫測(cè)定法(RIA)、或免疫印跡。
合適的抗體測(cè)定指示物為本領(lǐng)域公知，包括酶標(biāo)記，例如葡萄糖氧化
酶，和放射性同位素例如碘(1251, 1211)、碳("C)、硫fS)、氚(3H)、 銦(112111)和锝("mTc)，和熒光標(biāo)記，例如熒光素和玫瑰紅。
在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明方法釆用ELISA法實(shí)施， 優(yōu)選夾心-ELISA法。適合的ELISA法和夾心-ELISA法為本領(lǐng)域技 術(shù)人員熟知。
本發(fā)明的方法可以進(jìn)行修改，例如，通過(guò)附加測(cè)定一種或多種其 他生物標(biāo)記物的濃度(例如，(i)A(342和A(340的比值；(ii)A卩37或 AP40的濃度；或(iii)磷酸化-tau的濃度(顯示在AD患者中濃度增 大)，在某些情況下，這會(huì)進(jìn)一步提高本發(fā)明方法的診斷價(jià)值。
本發(fā)明用于檢測(cè)AD治療進(jìn)展的方法可適用于任何治療，例如， 用NSAID (例如MPC-7869、 R-氟吡洛芬)或他汀類藥物(Statin) 治療。
供以上討論的診斷研究使用，本發(fā)明還提供了試劑盒。優(yōu)選地， 該試劑盒包括一種抗-Ap38-抗體和一種抗-Ap42-抗體。這些抗體可根 據(jù)以上所述進(jìn)行檢測(cè)性標(biāo)記，優(yōu)選地，通過(guò)ELISA診斷。該試劑盒 可包含與一種與固態(tài)支持體例如聚苯乙烯微量滴定皿或硝基纖維素 紙結(jié)合的抗體?；蛘?，所述試劑盒以一種放射免疫測(cè)定法(RIA)為 基礎(chǔ)并含有用放射性同位素標(biāo)記的所述抗體。在本發(fā)明試劑盒的優(yōu)選 實(shí)施方式中，抗體用酶、熒光化合物、發(fā)光化合物、放射性鐵磁體探 針或放射性化合物標(biāo)記。
最后，本發(fā)明還提供了 一種篩選用于預(yù)防和治療AD的治療劑的 方法，包括下述步驟
(a)將試驗(yàn)化合物與下組成分的寡聚物、同型二聚體或單體接觸(i)淀粉樣前體蛋白(APP)、 (ii)P-細(xì)胞毒素因子(beta-CTF)、 (iii)淀粉樣 前體蛋白-跨膜序歹'j(APP-TMS)或(iv)—種包括APP-跨膜序列(TMS) 的單體、同型二聚體或低聚物的蛋白；和
(b)測(cè)定由單體形成的寡聚物或同型二聚體或者由寡聚物或同型 二聚體形成的單體，其中由單體形成的同型二聚體或寡聚物或者由寡 聚物或同型二聚體形成的單體減少或消除，表明所述試驗(yàn)化合物可適 用于預(yù)防或治療阿爾茲海默病。
試驗(yàn)化合物可以是差別很大的化合物，可以是天然存在的化合物 也可以是合成、有機(jī)和無(wú)機(jī)化合物以及聚合物(例如寡肽，多肽，寡 核苷酸和和多聚核苷酸)，以及小分子、抗體、糖、脂肪酸、核苷酸 和核苷酸類似物，天然存在結(jié)構(gòu)的類似物(例如肽"模擬物"，核酸類
似物等)和許多其他化合物。試驗(yàn)化合物也可大規(guī)模篩選得到，例如 通過(guò)篩選大量含有合成或天然分子的化合物。因此，根據(jù)本發(fā)明的方 法的優(yōu)選實(shí)施方式中的試驗(yàn)化合物形成了部分物質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)。
大量可能有用的化合物可從天然產(chǎn)物的提取物中篩選出作為起 始原料。這類提取物有很多來(lái)源，例如下列物種真菌、放線菌類、 水藻、昆蟲(chóng)、原生動(dòng)物、植物和細(xì)菌。然后可將這些顯示活性的提取 物進(jìn)行分析以分離出活性分子。
在本發(fā)明篩選方法的優(yōu)選實(shí)施方式中，實(shí)驗(yàn)化物來(lái)自于真菌提取 物庫(kù)。真菌提取物特別優(yōu)選的庫(kù)來(lái)自于青霉素和曲霉素類。
可使用合適的細(xì)胞系在無(wú)細(xì)胞提取液或體內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。例如，用 于本發(fā)明篩選方法的細(xì)胞的實(shí)例為含有任何報(bào)告基因，置于ctx ToxR-轉(zhuǎn)錄激活啟動(dòng)子，例如，coZ/FHK12的控制之下的任何細(xì)菌 細(xì)胞。可使用由跨膜序列(TMS)和例如細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶活性物 (activity)組成的融合構(gòu)建體( construct)在真核細(xì)胞中進(jìn)行類似的 檢測(cè)。可通過(guò)酪氨酸激酶自身磷酸化的程度報(bào)道二聚化狀態(tài)。
例如可經(jīng)由培養(yǎng)基將試驗(yàn)化合物加入到細(xì)胞中。鑒定陽(yáng)性試驗(yàn)化合物的基本上合適的測(cè)定方法在生物技術(shù)和藥品行業(yè)中是公所公知 的，其他測(cè)定方法和為了說(shuō)明目的提供的上述測(cè)定方法的變體對(duì)本領(lǐng) 域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
在本發(fā)明篩選方法的優(yōu)選實(shí)施例中，細(xì)胞表達(dá)下組成分的一種低
聚物、同型二聚體或單體(i)淀粉樣前體蛋白(APP)、 (ii)(3-細(xì)胞毒素 因子(P-CTF) 、 (iii)淀粉樣前體蛋白-跨膜序列TMS或(iv)—種包括 APP-跨膜序列(TMS)的單體、同型二聚體或低聚物的蛋白，蛋白以一 種同型二聚體或寡聚物的形成不受，例如，使用報(bào)道基因影響的方式
標(biāo)記，并且允許檢測(cè)低聚物、同型二聚體或單體的形成，例如，使用 下述實(shí)施例所述的ToxR-系統(tǒng)。 一種包含報(bào)告蛋白的融合蛋白的第二 多肽片段可以是全長(zhǎng)蛋白或蛋白片段。在融合蛋白構(gòu)建中普遍使用的 蛋白，包括但不限于，(3-半乳糖苷酶、P-半乳糖苷酶、綠色熒光蛋白 (GFP)、自熒光蛋白，包括藍(lán)色熒光蛋白(BFP)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶 (GST)、熒光素酶、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)。 此外，附加表位用于融合蛋白的構(gòu)建。其他有用的測(cè)定為使用合成肽、 單體和工程二聚體/寡聚物的結(jié)合測(cè)定、允許高通量篩選的讀出測(cè)定 (基于熒光)。
本發(fā)明的篩選方法可以借助科學(xué)文獻(xiàn)和專利文獻(xiàn)所述的方案進(jìn) 行修改。例如，在單一試驗(yàn)中，可對(duì)大量可能有用的分子進(jìn)行篩選。 例如，當(dāng)對(duì)100個(gè)化合物的域進(jìn)行篩選時(shí)，原則上，可將全部1000 個(gè)化合物置于微量滴定板的孔中，同時(shí)進(jìn)行測(cè)定。1000的庫(kù)可被分 成10個(gè)100的庫(kù)并且可重復(fù)該方法直到鑒定出單個(gè)的陽(yáng)性試驗(yàn)化合 物。無(wú)論如何，合成分子大型庫(kù)的建造和同步篩選可以按照組合化學(xué) 領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。
下列實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明。 實(shí)施例l
通用方法
17(A) 質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染
ToxR-系統(tǒng)質(zhì)粒的構(gòu)建已有描述(Langosch等，J Mol Biol 263 (1996)， 525-30)。將N端帶有Myc-tag和C端帶有Flag-tag的APP695 或C端帶有Flag-tag的SPA4CT用作模板，通過(guò)定向突變引入G25A， G29A， G33A， G29/33A或G33I突變體。將cDNAs插入到 pCEP4(Invitrogen ，卡爾斯魯厄，德國(guó))，其載有抗潮霉素(hygromycine ) 基因。對(duì)于穩(wěn)定表達(dá)，遵循制造商的說(shuō)明書(shū)使用Transfectine (Bio-Rad， M[upsilon]nchen,德國(guó))和質(zhì)粒(2ng)來(lái)轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞株(ATCC 號(hào)CRL-2266)。對(duì)于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)-測(cè)量，將APP695 cDNAs用引物擴(kuò)增，使其在載體pcDNA3 (Invitrogen)中與CFP/YFP 框內(nèi)連接，全部序列均經(jīng)過(guò)雙脫氧測(cè)序確認(rèn)。
(B) 熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)
對(duì)于瞬時(shí)表達(dá)，遵循制造商的說(shuō)明書(shū)使用Fugene 6轉(zhuǎn)染試劑 (Roche Molecular Biochemicals ， 曼海姆，德國(guó))和質(zhì)粒(0.75 ju g pcDNA3-APP695- CFP和1.5 ja g pcDNA3-APP695-YFP)來(lái)轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞(ATCC編號(hào)CRL1573)。在竟?fàn)師晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移 (FRET)試驗(yàn)中，質(zhì)粒含量減少至0.35 ju g pcDNA3-APP695-CFP和 0.75 jug pcDNA3- APP695-YFP，允許加入多達(dá)1.5 Mg編碼競(jìng)爭(zhēng)者 pCEP4-APP或pcDNA3的質(zhì)粒。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)測(cè)量按 照Voigt等，J Biol Chem 280 (2005)， 5121-7中所述的方式進(jìn)行。
(C) ToxR-系統(tǒng)
裂解表達(dá)嵌合體構(gòu)造的大腸桿菌FHK1細(xì)胞，測(cè)量A(3-半乳糖苷 酶活性(Langosch等，1996)。為了控制融合蛋白正確地插入到細(xì)菌內(nèi) 膜，在MBP(Brosig和Langosch， Protein Sci 7 (1998), 1052-6)缺乏 的大腸桿菌PD28細(xì)胞中表達(dá)嵌合體。因?yàn)檎_定向的嵌合體補(bǔ)充 MBP缺乏而使細(xì)胞能在M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，48小時(shí)后通過(guò)細(xì)胞 密度可測(cè)量麥芽糖-M9基礎(chǔ)培養(yǎng)基唯一的碳源。(D) 夾心ELISA,免疫沉淀測(cè)定和免疫印跡
以2 x 10V60mm-培養(yǎng)皿的密度將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞涂布在培養(yǎng)皿 上。細(xì)胞傳代后第二天，加入4ml新鮮培養(yǎng)液并培養(yǎng)24小時(shí)。對(duì)于 AP40和A卩42-專一性ELISAs，根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)(The Genetics company (TGC),巴塞爾，瑞士)分析50 m 1培養(yǎng)液。同樣的操作方案 適用于確定A(338水平，但使用抗體BAP-29(M. Brockhaus提供，羅 氏，巴塞爾，瑞士)。從和抗血清(針對(duì)殘基1-40產(chǎn)生傳體積的條件 培養(yǎng)液中沉淀出AP。對(duì)于分泌的APP(sAPP)而言，可對(duì)部分條件培 養(yǎng)液直接進(jìn)行分析。對(duì)于全長(zhǎng)APP，將細(xì)胞在含有50 mM Tris，pH 7.4, 150 mM NaCl， 2 mM EDTA， 2% NP40和2% Triton-X100的緩沖液 中裂解。為檢測(cè)APP-和SPA4CT-轉(zhuǎn)染細(xì)胞C端片段(beta-CTF),用 Y -分泌酶抑制劑N- [N- (3， 5- 二氟苯乙?；?L-丙氨酰基)]-S-苯基 甘氨酸叔丁酯(DAPT)處理細(xì)胞24小時(shí)，裂解，并且用抗血清免疫 沉淀等量的蛋白(至APP細(xì)胞溶質(zhì)區(qū)域)。樣品通過(guò)SDS-PAGE分離， 轉(zhuǎn)移至硝基纖維素并且使用抗AP殘基2-10或879 (sAPPbeta，由P. Paganetti提供，諾華，巴塞爾，瑞士)的抗體W0-2或者抗體22C11 (羅 氏，曼海姆，德國(guó))進(jìn)行免疫標(biāo)記。
(E) 基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(MALDI-MS)
用W0-2對(duì)來(lái)自條件培養(yǎng)液的Ap進(jìn)行免疫沉淀。用高鹽(500 mM NaCl)洗脫后，再用PBS和100mM氯化銨，pH7.4沖洗蛋白質(zhì)接技 瓊脂糖。用50%乙酸對(duì)A卩進(jìn)行洗脫并且真空干燥。使用UltraflexII TOF/TOF (Bmker Daltonics,不來(lái)梅，德國(guó))對(duì)芥子酸介質(zhì)進(jìn)行 MALDI-MS分析
(F) 分子模型
對(duì)于螺旋，產(chǎn)生具有相同骨架但側(cè)鏈構(gòu)象任意變化的五個(gè)不同 的、非對(duì)稱的起始構(gòu)象。從每種起始構(gòu)象，繞長(zhǎng)軸任意旋轉(zhuǎn)螺旋0-360 度，可產(chǎn)生65,000種結(jié)構(gòu)；將其分別向幾何中心或離幾何中心平移-2到6A,沿其長(zhǎng)軸平移各螺旋士IO A并且相對(duì)于二重軸傾斜螺旋±-20度。靜電常數(shù)20用于靜電學(xué)并創(chuàng)建了能量地圖。旋轉(zhuǎn)在36度bins釆樣，傾斜2.5度bins,縱向移動(dòng)2Abins并且平移位移在0.8 A bins采樣。使用Boltzmann平均技術(shù)獨(dú)立評(píng)估每bin的平均能量。能量地圖用圖解評(píng)估，并且假定一種對(duì)稱結(jié)構(gòu)，以便舍棄符合非對(duì)稱結(jié)構(gòu)的能量最小值。為了可靠地建立螺旋東模型，已經(jīng)對(duì)相關(guān)方法進(jìn)行了說(shuō)明(Gottschalk ， J Mol Graph Model 23 (2004) ， 99-110)。(G) BIACORE
將A(3肽在pH 3.4的10 mM NaOAC中溶解至50 ju g/ml，并共價(jià)耦合到傳感器芯片表面CM5(BIAcore胺耦合試劑盒)。通過(guò)固定A卩肽提供了 2000個(gè)響應(yīng)單元(RU)。將NSAIDs溶于100% DMSO中并用1 x PBS/0.005% P20稀釋。注射10 m 1體積的NSAIDs，隨后經(jīng)歷600秒的解離階段并且注射5jil 20 mM HC1來(lái)再生表面。通過(guò)注射210jul緩沖液(l xPBS/0.005 。/。P20)檢驗(yàn)基線穩(wěn)定性。對(duì)于所有試驗(yàn)，可按照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)選擇30 u 1/min的流速。實(shí)施例2 GxxxG基序?qū)θL(zhǎng)APP同型二聚化的影響
之前的生化研究已經(jīng)指明了在同型二聚化作用中的APP外功能區(qū)有兩個(gè)不同的位點(diǎn)， 一 個(gè)位于與膠原結(jié)合位點(diǎn)疊合的氨基酸448-465位，另一個(gè)位于包含殘基91-111的環(huán)形區(qū)域(Beher等，JBiolChem 271 (1996)， 1613-20; Scheuermann等，J Biol Chem 276 (2001)，33923-9)。因此GxxxG基序提供了 APP 二聚體的第三個(gè)接觸位點(diǎn)。使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET))方法檢查是否APP 二聚化作用取決于活細(xì)胞中的GxxxG基序。將藍(lán)綠色或黃色熒光蛋白(CFP或YFP)融合到全長(zhǎng)APP695野生型(wt)或突變體結(jié)構(gòu)G33A, G33I或G29/33A的C端，這些突變體在GxxxG基序的中間進(jìn)行突變。用共聚焦顯微鏡觀測(cè)到在HEK293細(xì)胞中全部融合蛋白均顯示同樣的亞細(xì)胞分布類型(函1B)。對(duì)于APPwt-YFP和共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)效率為11.2%，第一次證明了活細(xì)胞中兩種APP分子極為接近(圖1D)。有濃度依賴性的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)信號(hào)會(huì)因?yàn)榻?jīng)非熒光的APPwt-Flag共同表達(dá)而降低，推斷出所觀測(cè)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)信號(hào)具有特異性(圖1C)。這種特異性通過(guò)APP-YFP和不相關(guān)的EGFR-CFP
(Y-分泌酶底物ErbB-4的同族成員)的共區(qū)域化得到進(jìn)一步證明(圖1C),而EGFR-CFP跟期望的的一樣，不顯示任何可檢測(cè)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)效率。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的動(dòng)力學(xué)和受體光致漂白的回歸分析顯示于圖IE和1F。為檢驗(yàn)APP跨膜序列(TMS)GxxxG基序?qū)PP同型二聚化的影響，對(duì)APP G33A、 APPG29/33A和APPG33I的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)效率進(jìn)行測(cè)量。觀察到突變體跟wt相比沒(méi)有顯著差異(圖1D)。結(jié)論是GxxxG基序的突變一般不影響APP 二聚化。因此，GxxxG-介導(dǎo)的相互結(jié)合似乎發(fā)生在通過(guò)N端接觸位點(diǎn)的二聚化開(kāi)始之后(Beher等，(1996);Scheuermann等，(2001))并且可能還影響膜內(nèi)的跨膜序歹'j(TMS)構(gòu)象。實(shí)施例3借助GxxxG基序APP跨膜序列二聚化
為了選擇性分析APP GxxxG基序作為跨膜序列(TMS)的一部分促進(jìn)螺旋自身結(jié)合的能力，使用ToxR-系統(tǒng)(Langosh等，(1996))，在細(xì)菌內(nèi)膜進(jìn)行測(cè)量短跨膜序列(TMS)同型二聚化強(qiáng)度的試驗(yàn)。到最后，構(gòu)建由周質(zhì)麥芽糖-結(jié)合蛋白(MBP)、研究中的跨膜序列(TMS),其在細(xì)菌內(nèi)膜，和細(xì)胞溶質(zhì)轉(zhuǎn)錄激活區(qū)ToxR組成的融合蛋白(Figure2A)?？缒ば虼?j(TMS)驅(qū)動(dòng)的膜內(nèi)二聚化導(dǎo)致ToxR-域極為接近，它能夠僅在二聚化狀態(tài)下激活編碼(3-半乳糖苷酶的報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。研究中TMS 二聚化強(qiáng)度由(3-半乳糖苷酶的活性來(lái)表示?？缒ば蛄?TMS)A(3殘基29到42給出一個(gè)強(qiáng)力信號(hào)，該信號(hào)跟血型糖蛋白A(GpA)
(一種經(jīng)過(guò)很好研究的自身互動(dòng)的跨膜序列)的75到87殘基給出的信號(hào)相似(圖2B)(Langosch等，(1996))。 二聚化強(qiáng)度從A卩跨膜
21序列(TMS)突變體結(jié)構(gòu)G29A和G33A到突變G29/33A逐漸減弱并被突變G33I消除。不幸的是，通過(guò)該系統(tǒng)無(wú)法測(cè)定臨近膜的殘基G25的影響，只能分析跨膜序列(TMS)序列。因?yàn)榫嘀醒隚xxxG基序的遠(yuǎn)端突變G37A和G38A不產(chǎn)生任何影響，進(jìn)而推斷G29和G33是確定A卩跨膜序列(TMS)結(jié)合的GxxxG基序的關(guān)鍵殘基。雙重突變G29/33A和突變G33I的差異可直接影響兩個(gè)螺旋不同的親和性。當(dāng)突變G29/33A仍可使兩個(gè)跨膜序列(TMS)相互接近時(shí)，存在著起穩(wěn)定作用的相互結(jié)合的范德華力。相反，G33I突變體的分支氨基酸異亮氨酸可能阻止這種接近，從而破壞二聚化。全部ToxR-嵌合體均正確插入到細(xì)菌膜并顯示了同樣的表達(dá)水平(未顯示數(shù)據(jù))。實(shí)施例4 GxxxG突變降低了 A|342水平
下一步是檢查是否GxxxG突變改變了 APP加工和AP的產(chǎn)生。產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)APP695wt或突變體G25A， G29A, G33A， G29/33A，或G33I的SH-SY5Y細(xì)胞。對(duì)于所有細(xì)胞株，通過(guò)免疫印跡，觀察到相似水平的全長(zhǎng)APP、可溶性APP(sAPPalpha和sAPPbeta) , (3-CTF和總分泌A卩圖3， A和C)。因此，GxxxG突變既不影響A(3-或a-分泌酶的切割，也不干預(yù)APP的成熟和表面表達(dá)。然而，當(dāng)將AP42, A|340和AP38種類用夾心酶聯(lián)免疫吸收測(cè)定(ELISA)定量時(shí)，顯示對(duì)wt有顯著性差異。突變體G25A、 G29A和G33A的A卩40水平?jīng)]有變化，但跟表達(dá)APPwt的細(xì)胞系相比，AP42的分泌分別顯著降低了 28%、 67%和60%(圖4， A和C)。盡管G33A比G29A更有效率地削弱跨膜序列(TMS)的二聚，G29A和G33A卻將A卩42水平降到了類似程度(圖2B)。這可能是由于細(xì)胞膜插入AP殘基29到42以及G29位于ToxR-測(cè)定中使用的嵌合體結(jié)構(gòu)的邊界(圖2B)。此外，在胞外臨近膜的位置的殘基G25好象是GxxxG 二聚化基序的延長(zhǎng)部分，因?yàn)楦蛔僄29A和G33A類似，G25A突變體降低了A卩42的水平。雙重突變G29/33A對(duì)Ap40的生成略有減少并降低模擬-轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌背景下的AP42水平(圖4， A和C)。通過(guò)免疫印跡觀察到突變G33I廢止了 AP40和A(342的生成但沒(méi)有減少總A卩(圖3A),可假定該突變體可以分泌其他的A(3種類(參見(jiàn)實(shí)施例6)。實(shí)施例5 GxxxG突變體的效應(yīng)不受APP外功能區(qū)的支配
為排除APP外功能區(qū)接觸位點(diǎn)或Ap-分泌酶活性對(duì)GxxxG突變體產(chǎn)生A卩的影響，對(duì)SPA4CT穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y細(xì)胞分泌的A卩(Dyrks等，F(xiàn)EBS Lett 309 (1992), 20-24)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)切割信號(hào)肽之后釋放出P- CTF與Y-分泌酶無(wú)關(guān)(圖3C)。通過(guò)免疫印跡分析，SPA4CT wt-或突變體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯示出相同的P- CTF和A(3表達(dá)水平(圖3B)。生成的SPA4CTwt和突變體的AP40和Ap42與從相應(yīng)的全長(zhǎng)APP結(jié)構(gòu)得到的AP水平相似，如上所述(圖4， B和D)。這表明GxxxG基序?qū)Φ鞍咨a(chǎn)的影響不受APP外功能區(qū)的支配。實(shí)施例6以消耗A(342為代價(jià)生產(chǎn)A卩38
由于通過(guò)免疫印跡觀察到APPwt和G33I和G29/33A突變體的總A(3水平似乎相似(圖3A),使用MALDI-MS對(duì)樣品進(jìn)行分析以檢測(cè)在C端截短的A(3種類的存在。在APP G331-表達(dá)細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液中，A(338和A卩37給出了最明顯的信號(hào)，其中A(340幾乎無(wú)法被檢測(cè)到(圖4E)。 APPG29/33A-表達(dá)細(xì)胞的A(3也顯示出相當(dāng)強(qiáng)力的A(338信號(hào)(數(shù)據(jù)未顯示)。為研究看上去增加的AP38(圖4E)是否以消耗A|342為代價(jià)產(chǎn)生，使用AP38專一性ELISA確定A|3- CTF分泌的A|338的水平(圖4F)。突變體G29/33A和G33I顯示，與A卩42生成終止和A(340水平降低相應(yīng)，產(chǎn)生了最高量的AP38 (突變G29/33A設(shè)為100。/。)。與雙重突變G29/33A相比，單突變體G29A和G33A產(chǎn)生較少的AP38 (分別為36%和52%)，因?yàn)樗鼈兲禺愋詼p少A(342而非A(340。與野生型(wt)相比，突變G25A的A(338水平無(wú)顯著變化。與突變體G29/33A相比，突變體G331導(dǎo)致產(chǎn)生的A卩38略微減少，而導(dǎo)致AP37的量增加(圖4E)。因此，取決于GxxxG突變，A(342和AP38的產(chǎn)生存在強(qiáng)負(fù)相關(guān)。A(342和A|338的水平逐 漸降低或升高明顯取決于單個(gè)甘氨酸取代，也歸因于其序列中的保守 或非保守突變。ToxR-測(cè)定數(shù)據(jù)表明A(342和Ap38的產(chǎn)生跟通過(guò) GxxxG基序的殘基G29和G33進(jìn)行的跨膜序列(TMS)-跨膜序列 (TMS)相互結(jié)合的二聚化強(qiáng)度密切相關(guān)。結(jié)果顯示GxxxG基序的突 變并不影響切割效率但使得Y -分泌酶切割向更多的N端位點(diǎn)移動(dòng)。 實(shí)施例7帶有G29和633的螺旋-螺旋界面在構(gòu)象上有利
為檢驗(yàn)通過(guò)GxxxG基序進(jìn)行的螺旋-螺旋相互作用在能量和構(gòu)象 上是否有利，進(jìn)行A卩殘基25到46構(gòu)象的計(jì)算機(jī)檢索。觀察到一種 低能構(gòu)象帶有一個(gè)右旋交角并且三個(gè)連續(xù)GxxxG基序的全部四個(gè)甘 氨酸都處在螺旋-螺旋界面處(圖5A)。根據(jù)該模型，殘基G29和G33 構(gòu)成界面核心，與G25 (6.7 A)和G37(5.7 A)比較，每對(duì)的Calpha-Calpha距離少于5A。
實(shí)施例8 GxxxG基序影響APP跨膜序列(TMS)里面和外面的A卩-和oc-分泌酶位點(diǎn)周?chē)阎耐蛔?，這些突變引起AD并且通常導(dǎo)致 A卩42的產(chǎn)生增加。
本實(shí)施例表明，GxxxG基序影響APP跨膜序列(TMS)里面和外 面的Ap-和oc -分泌酶位點(diǎn)周?chē)阎耐蛔?，這些突變引起AD并且通 常導(dǎo)致A(342的產(chǎn)生增加。對(duì)位于Ap-分泌酶剪切N端所謂的瑞典突 變體K670NM671L(APPsw) (Mullan等，1992， Nat Genet, 2, 340-34} 和a剪切C端的北極(arctic) 突變體E22G (APParc)進(jìn)行分析 {Kamino等，1992， AmJHumGenet， 51， 998- 1014; Nilsberth等， 2001, NatNe扁sci, 4, 887-893}。瑞典突變體K670N M671L使APP 成為BACE更好的底物，這導(dǎo)致產(chǎn)生的A卩增力口 3-6倍(Citron， 1992， Nature, 360, 672-674; Citron, 1994, Proc Natl Acad Sci U S A， 91， 11993-11997}。
北極(arctic )突變E22G與荷蘭突變E22Q和意大利突變E22K、佛蘭德突變A21G和愛(ài)荷華突變E23N均集中在A(3-序列中間，a-分泌酶切割位點(diǎn)C端(在16位)。發(fā)生北極突變E22G的患者血液中 可溶性AP42和A|340的濃度較低并且細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中由 APPE22G轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌的A卩42減少19%{Nilsberth等，2001， Nat Ne腸sci, 4, 887-893}。由于增加了對(duì)APP E22G的BACE加工，" -分泌酶活性降低《Stenh等，2002， Neuroreport, 13， 1857-1860}。 理化性質(zhì)增強(qiáng)了對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞死亡的影響，導(dǎo)致原纖維的形成加速 {Mlsberth等，2001, NatNe畫(huà)ci， 4， 887-893}。
首先，分析在轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y細(xì)胞中APP wt和瑞典或北極突 變體APP的APP加工(圖6A-D)，利用ELISA測(cè)定sAPPa, A卩42， A卩40和AJ338的水平。與APPsw轉(zhuǎn)染細(xì)胞的APPwt比較，發(fā)現(xiàn)可 溶性APP (sAPPa)降至18%， APParc降至83%。這表明APPsw和 APParc形式被轉(zhuǎn)移至A|3-分泌灘道(圖6A)。跟公開(kāi)結(jié)果相比，發(fā)現(xiàn) 可溶性A(342略微增加(15% ), A卩40增加22%(圖6 B， C) {Nilsberth 等，2001， NatNeurosci, 4， 887-893; Stenh等，2002， Neuroreport， 13， 1857-1860}。這可能是由于所用細(xì)胞系的差異所致(SH-SY5Y代 替HEK293)。有其他人也觀察到APPsw導(dǎo)致A(3總量增加，但我們 還發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的AP40/A(342的比例有所變化。鑒于因素2導(dǎo)致A(340的 量增加(圖6C), A(342增加了 4倍(圖6B)。對(duì)Ap42的比例影響較大 是新的發(fā)現(xiàn)，表明BACE在生成易聚集的A(342中發(fā)揮特異性作用。 此外，對(duì)產(chǎn)生的A(338進(jìn)行定量。由于APPwt轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生的A(338 水平接近檢測(cè)限，為利于比較，將在APPsw上清液中測(cè)量的水平設(shè) 為100%(圖6 D)。與APPwt相比A(338在APPsw中增加了 85°/。并且 發(fā)現(xiàn)A(338在APParc轉(zhuǎn)染細(xì)胞中增加了 2倍。
當(dāng)GxxxG突變與APPsw或APParc結(jié)合時(shí)，sAPPa水平未受到 削弱且與FAD突變體水平類似(APPwt設(shè)為100%)(圖6E， 1)。因 此，GxxxG突變體對(duì)BACE和cx-分泌酶活性均無(wú)影響。
25為定量FAD-GxxxG基序突變的影響，將來(lái)自APPsw和APParc 結(jié)構(gòu)分泌的A(342和A卩40的水平以及APPsw G29/33A或APParc G29/33A分泌的A(338水平設(shè)為100%。從FAD-GxxxG中測(cè)量的A卩 水平跟單獨(dú)GxxxG突變體的水平類似(圖6F-H, J-L)。 APPsw G33A 和APParc G33A顯示A(342少60%。 GxxxG突變體G29/33A和 G33I中的A|342水平低于檢測(cè)限。APPsw G33A和APParc G33A突 變體結(jié)構(gòu)的AP40水平類似于APPsw或APParc，盡管這些分別稍微 減少至93%和89。/。(圖6G， K)。雙重突變體FAD-G29/33A產(chǎn)生顯 著少的A卩40(APPsw或APParc的APPsw G29/33A 84%和APParc G29/33A 50%，單獨(dú))。不過(guò)，這跟GxxxG突變體G29/33A產(chǎn)生的A卩40 的量類似，跟APPwt相比，釋出70%的A卩40。
FAD-APP G33I轉(zhuǎn)染細(xì)胞釋出的A(340水平跟模擬轉(zhuǎn)染細(xì)胞的類 似。與單獨(dú)測(cè)量GxxxG突變體相比在APPsw或APParc轉(zhuǎn)染細(xì)胞中 AP38水平升高的程度是一致的(圖6H， L)。
總之，(i) GxxxG突變體和(ii) GxxxG突變體結(jié)合家族性AD (FAD) -突變體產(chǎn)生的可溶八|3水平相似。這表明GxxxG的作用大于淀粉樣 級(jí)聯(lián)中的FAD -突變體，并因此強(qiáng)調(diào)了 GxxxG介導(dǎo)的二聚化對(duì)產(chǎn)生 淀粉樣蛋白以及針對(duì)對(duì)淀粉樣蛋白抑制的任何治療努力的重要性。
鑒于瑞典和北極突變對(duì)通過(guò)(3-或oc-分泌酶APP的初加工有影
響，所得產(chǎn)物不受GxxxG基序的削弱。這種基序?qū)Ｒ恍缘貙?duì)加工級(jí) 聯(lián)下游的Y-分泌酶活性有影響并減少了 A(342、 A(340的產(chǎn)生同時(shí)增 加了 A(338和其它較短形式。 實(shí)施例9 PS-I家族性AD突變和GxxxG
如APP sw和APP arc突變所證明，GxxxG突變優(yōu)于APP FAD 突變。除APP外，F(xiàn)AD突變還在早老蛋白l(PSl)中發(fā)生，導(dǎo)致疾病 的早發(fā)性顯型。為檢驗(yàn)否APP基序是否能解救增強(qiáng)PS1FAD突變作 用的A(342,我們?cè)贖EK 293細(xì)胞中瞬時(shí)共表達(dá)APP wt或APP G33A以及PS-Iwt或FAD突變體并分析A|3的產(chǎn)生。產(chǎn)生下列的PS-IFAD 突變?cè)诳缒ば蛄?TMS)6中產(chǎn)生L250V和跨膜序列(TMS)7中產(chǎn)生 G384A、 S390I和G394V{Campion等，1999， Jm J/fM7w 65， 664-670; Cruts等，1995, //mw Mo/Gew^， 4， 2363-2371; Furuya 等，2003， /7Ve腳/Sc" 209, 75-77; Rogaeva等，2001， 7Ve腳/ogy, 57, 621-625}。
經(jīng)測(cè)量的用APPwt(設(shè)定為100%)或APPG33A共表達(dá)的PS-I wt產(chǎn)生的A(340水平差異為約20。/。(圖7A)。這種差異可能是由于細(xì) 胞體系(HEK293代替SH-SY5Y細(xì)胞)或瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法所致。分析揭 示了 A|340水平未受影響，不依賴過(guò)量表達(dá)APP(APP wt或APP G33A)并且不依賴于PS-I突變(圖7A)。
相反，如所預(yù)料的，相對(duì)于PS-I突變體，APP wt的AP42水平 顯著增加(圖7B)。 APP G33A將A|342水平降至共表達(dá)PS-I wt時(shí)觀察 到的水平以下(圖7B)。 PS1突變體對(duì)A(342水平的增強(qiáng)作用甚至大于拯 救作用，最有可能是通過(guò)直接影響APP/PS1的底物/酶之間的相互作用 所致。這說(shuō)明了本方法的可行性，不僅靶向Y-分泌酶底物APP的同型 二聚化以抑制Ap,還通過(guò)GxxxG基序靶向APP/PS1相互作用。 實(shí)施例10 GxxxG和NSAIDs
如上所示，在APP跨膜序列(TMS)內(nèi)的GxxxG基序的某些突 變，象G25A， G29A和G33A導(dǎo)致Ap42的產(chǎn)生顯著減少和由活細(xì) 胞釋出的A(338水平增加而A(340水平無(wú)顯著變化。在用非甾體抗炎 藥(NSAIDs)處理的APP轉(zhuǎn)染細(xì)胞中也觀察到對(duì)A卩產(chǎn)生的這種影響。 例如，特異性NSAID舒林酸硫化物減少了 A(342的生成，升高了 A卩38 水平而不影響A(340的水平(Weggen等，2001, Nature, 414， 212-216}。 同樣的，布洛芬降低了 AP42水平而未影響A(340的產(chǎn)生。不幸的是， A(338水平未進(jìn)行分析(Gasparini等，2004， J Neurochem， 91 ， 521-536;Weggen等，2001， Nature, 414， 212-216}。兩種發(fā)現(xiàn)均為獨(dú)立完 成并指出對(duì)酶復(fù)合物進(jìn)行類似的變構(gòu)調(diào)節(jié)(Beher等，2004, J Biol Chem, 279， 43419-43426; Takahashi等，2003， JBiolChem, 278， 18664-18670}。有趣地是，對(duì)于NSAIDs的另 一個(gè)子集，描述了相反 的作用方式，例如非諾貝特(Kukar等，2005, NatMed， 11， 545-550}。 非諾貝特顯著增加了 A(342水平，減少了 A(338的產(chǎn)生但對(duì)Ap40水 平?jīng)]有影響。
根據(jù)GxxxG作為螺旋-螺旋相互作用基序的上述特征(Munter 等，2007, 乂26,1702-1712)，我們假設(shè)調(diào)節(jié)NSAIDs的A(3具有
與包含該基序的A卩域結(jié)合的可能性。與GxxxG突變體類似，我們假 設(shè)Y-分泌酶底物具有二聚體穩(wěn)定或減弱作用。如果涉及螺旋-螺旋相 互作用，兩種作用均需直接將NSAIDs結(jié)合到A(3域。因此，使用BI ACORE系統(tǒng)，實(shí)施實(shí)時(shí)結(jié)合方法(圖8)。將NSAID舒林酸硫化物和 非諾貝特溶于DMSO,并用帶有清潔劑的PBS稀釋(l x PBS / 0.005 % P20)。如假設(shè)一樣，與對(duì)照溶劑相比，兩種NSAIDs以劑量-依賴 方式結(jié)合到固定的AP(圖8A， B)。對(duì)于非諾貝特，觀察到結(jié)合中的 一種構(gòu)象變化，此為一種額外的效果(圖8B)。注射布洛芬沒(méi)有顯示 對(duì)A卩的特異性結(jié)合，這可能是由于親和力在檢測(cè)限以下(圖8C)。
不過(guò)，這表明甚至在缺乏膜環(huán)境時(shí)，NSAIDs也可特異性結(jié)合到 A(3域。 一個(gè)很誘人的假設(shè)是舒林酸硫化物可能減弱A(3 二聚體的穩(wěn) 定性，而非諾貝特可能穩(wěn)定二聚體。
權(quán)利要求
1、一種用于診斷阿爾茲海默病(AD)或其特定階段的方法，所述方法包括下述步驟(a)將獲自患者的樣品與探針接觸，該探針與γ-分泌酶切割產(chǎn)物Aβ48、Aβ45、Aβ42、Aβ38和Aβ35中的至少兩種特異性結(jié)合；和(b)測(cè)定所述樣品中切割產(chǎn)物的含量，其中所述切割產(chǎn)物的比值與正常比值相比異常表明患阿爾茲海默病。
2、 一種監(jiān)測(cè)阿爾茲海默病治療進(jìn)展的方法，所述方法包括下述 步驟(a) 將獲自患者的樣品與探針接觸，該探針與Y-分泌酶切割產(chǎn)物 A(348、 A(345、 A卩42、 A卩38和A卩35中的至少兩種特異性結(jié)合；和(b) 測(cè)定所述樣品中切割產(chǎn)物的含量，其中與治療開(kāi)始時(shí)的比值 相比，所述切割產(chǎn)物的比值正常表明有治療效果。
3、 一種用于鑒別阿爾茲海默病和非阿爾茲海默病的診斷方法， 所述方法包括下述步驟(a) 將來(lái)自患者的樣品與探針接觸，該探針與Y-分泌酶切割產(chǎn)物 A(342、 A(340、和A|338中的至少兩種特異性結(jié)合；和(b) 測(cè)定所述樣品中切割產(chǎn)物的含量，其中AP38:AP42的比值大 于1并且AP42和AP40比值正常則表明未患有阿爾茲海默病。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l或2所述的方法，其中測(cè)定AP38和A(342的 比值。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中(i)Ap38和Af342的比值比 正常比值低并且AP42的濃度比其正常濃度高表明處于阿爾茲海默病 的早期階段和(ii) AP38和A|342的比值比正常比值高低且與其正常濃 度相比AP42的濃度高或者正常表明處于阿爾茲海默病的晚期。
6、 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其中AP38和A(342的比值 小于或等于1.5。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1 6任一所述的方法，其中所述的樣品為腦脊 髓液或血液。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1 ~ 6任一所述的方法，其中所述的探針為抗體。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的抗體為單克隆抗體。
10、 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中該方法按照酶聯(lián)免疫吸附 試驗(yàn)的方法實(shí)施。
11、 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)為夾 心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。
12、 根據(jù)權(quán)利要求1 ~ 11任一項(xiàng)所述的方法，包括測(cè)定至少一種 附加生物標(biāo)記物的濃度。
13、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的治療包括用非甾類 消炎藥或他汀類治療。
14、 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的非甾類消炎藥為 MPC-7869 (R-氟比洛芬)。
15、 一種適用于實(shí)施權(quán)利要求1 ~ 14任一項(xiàng)所述方法的試劑盒， 包括至少兩種抗A(3抗體。
16、 根據(jù)權(quán)利要求15所述的試劑盒，其包括至少一種抗A卩38 抗體和一種抗AI342抗體。
17、 一種篩選用于預(yù)防或治療阿爾茲海默病的治療藥物的方法， 其包括下述步驟(a) 將試驗(yàn)化合物與下組成分的寡聚物、同型二聚體或單體接觸 (i)淀粉樣前體蛋白(APP), (ii)(3-細(xì)胞毒素因子(P-CTF) ， (iii)淀粉 樣前體蛋白-跨膜序列(TMS)或(iv) —種包括淀粉樣前體蛋白-跨膜序 列(TMS)的單體、同型二聚體或低聚物的蛋白；和(b) 測(cè)定由單體形成的寡聚物或同型二聚體或者由寡聚物或同型 二聚體形成的單體，其中由單體形成的同型二聚體或寡聚物或者由寡 聚物或同型二聚體形成的單體減少或消除，表明所述試驗(yàn)化合物可適 用于預(yù)防或治療阿爾茲海默病。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于診斷阿爾茲海默病(AD)或疾病特定階段的方法，該方法基于測(cè)定Aβ48、Aβ45、Aβ42、Aβ38和Aβ35中至少兩種γ-分泌酶切割產(chǎn)物的比值，優(yōu)選測(cè)定Aβ38和Aβ42的比值。與正常比值相比，Aβ38和Aβ42的比值減小表明患阿爾茲海默病。此外，本發(fā)明公開(kāi)了用于實(shí)施所述診斷方法的試劑盒。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101460853SQ200780020798
公開(kāi)日2009年6月17日 申請(qǐng)日期2007年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月8日
發(fā)明者麗莎-瑪麗·蒙特, 杰德·莫塔普 申請(qǐng)人:柏林自由大學(xué)