南美白對蝦海藻糖-6-磷酸合成酶基因及其檢測與應(yīng)用
【專利摘要】南美白對蝦海藻糖?6?磷酸合成酶基因及其檢測與應(yīng)用，涉及海藻糖。通過提取南美白對蝦Litopenaeus vannamei的總RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄，通過引物擴增，鑒定了1個海藻糖?6?磷酸合成酶基因，根據(jù)該序列信息，設(shè)計最佳的引物，用于實時定量PCR方法，為檢測該基因在對蝦中的轉(zhuǎn)錄表達水平提供了基礎(chǔ)。通過實時定量PCR方法檢測海藻糖?6?磷酸合成酶基因在對蝦中的轉(zhuǎn)錄水平，可以將其應(yīng)用于評價對蝦抗高滲的能力，為其在對蝦良種選育與種質(zhì)資源評價等領(lǐng)域提供信息和方法。
【專利說明】
南美白對蝦海藻糖-6-磷酸合成酶基因及其檢測與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ] 本發(fā)明涉及海藻糖，尤其是涉及南美白對奸(Litopenaeus vannamei)海藻糖-6-磷酸合成酶基因及其檢測與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 海藻糖是一種天然、安全的糖類，它由兩個葡萄糖分子以a，a-l，l_糖苷鍵構(gòu)成的 非還原性糖，自身性質(zhì)非常穩(wěn)定，具有優(yōu)良的抗逆保護等特殊的生物學(xué)功能。許多在逆性環(huán) 境下（如干燥脫水、高溫、冷凍、高滲等狀態(tài))表現(xiàn)非凡耐受力的生物物種，都與它們體內(nèi)合 成、積累大量海藻糖有直接的關(guān)系。海藻糖通過保護生物膜、蛋白質(zhì)等大分子不被變性失 活，來維持生命體的生命過程和生物特征。外源性的海藻糖對生物體和生物膜、蛋白質(zhì)等大 分子同樣具有突出的保護作用，使得海藻糖可作為生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的活性大分子的優(yōu)良保 護劑，并且在食品加工領(lǐng)域也發(fā)揮作用。海藻糖-6-磷酸合成酶是海藻糖合成途徑中的關(guān)鍵 酶，對該酶基因的克隆和研究，有助于實現(xiàn)海藻糖在生物體內(nèi)的富集，是人們研究海藻糖合 成途徑的關(guān)注點。
[0003] 我國養(yǎng)殖對蝦面臨種質(zhì)退化嚴(yán)重、養(yǎng)殖地域環(huán)境差異大、主要養(yǎng)殖種類遺傳多樣 性下降、生長慢且規(guī)格不均一、品種抗逆性差(包括耐氨氮和密度脅迫等)等問題。健康優(yōu)質(zhì) 苗種繁育缺乏統(tǒng)一的規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)，良種配套養(yǎng)殖技術(shù)研究滯后，因地域環(huán)境差異大，良種示 范推廣效果差強人意。另外，近年來，由于一些對蝦養(yǎng)殖地區(qū)飽受厄爾尼諾之苦，夏季持續(xù) 的干旱無雨，使得海區(qū)鹽度連連爆表，鹽度已經(jīng)突破35%。大關(guān)，更有甚者池塘鹽度在40% 〇上 下徘徊，這給海水養(yǎng)蝦埋下了不少隱患。因此，利用檢測海藻糖-6-磷酸合成酶轉(zhuǎn)錄水平作 為對蝦抗高滲、抗逆評價的方法，將有助于對蝦良種選育與種質(zhì)資源評價。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的第一個目的是提供南美白對奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合 成酶基因；
[0005] 本發(fā)明的第二個目的是提供南美白對奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合 成酶蛋白序列；
[0006] 本發(fā)明的第三個目的是提供南美白對奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合 成酶的基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測方法。
[0007] 本發(fā)明的第四個目的是提供南美白對奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合 成酶在評價對奸抗高滲的應(yīng)用。
[0008] 所述南美白對奸1^1:〇口61^6118 vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因 Lvtps的分子 類型為cDNA，序列特征:長度為2535bp，類型為核酸，鏈性為雙鏈，拓撲結(jié)構(gòu)為線性，所述南 美白對奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因 Lvtps的序列如下所示，記為 SEQ ID No.l：

[0011] 南美白對奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因其核苷酸序列采用 以下方法獲得:提取南美白對奸Li topenaeus vannamei的RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進一 步以cDNA為模板，經(jīng)PCR擴增得到SEQ ID No. 1的序列；相關(guān)的核苷酸序列通過預(yù)測獲得基 因編碼的多肽SEQ ID No.2:

[0014] 南美白對奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶LvTPS的分子類型為蛋 白質(zhì)，序列特征:長度為844aa，類型為氨基酸，所述南美白對奸Litopenaeus vannamei海藻 糖-6-磷酸合成酶LvTPS的序列如下所示，記為SEQ ID No.2。
[0015] 南美白vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因 Lvtps的檢測方法， 包括以下步驟：
[0016] 一個南美白對奸Litopenaeus vannamei總RNA提取的步驟；
[0017] 一個南美白對it!下Litopenaeus vannamei cDNA反轉(zhuǎn)錄的步驟；
[0018] 一個南美白對奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因轉(zhuǎn)錄水平的檢 測步驟。
[0019] 所述南美白對ifLitopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因的核苷酸序列 采用以下方法獲得:提取南美白對奸Li topenaeus vannamei的RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA， 進一步以cDNA為模板，經(jīng)PCR擴增得到SEQ ID No. 1的序列。根據(jù)核苷酸序列設(shè)計最佳的引 物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4,用于實時定量PCR方法，檢測基因的轉(zhuǎn)錄表達水平。
[0020] 所述引物序列SEQ ID No.3:ACAGGTGATTCCCGTGAGGCTGCCT
[0021] 所述引物序列SEQ ID No.4:AATGCTCGTTGACTTGCCTGTAAGC
[0022] 本發(fā)明通過提取南美白對奸Litopenaeus vannamei的總RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄，通過引 物擴增和鑒定了 1個海藻糖-6-磷酸合成酶基因，根據(jù)該序列信息，設(shè)計最佳的引物，用于實 時定量PCR方法，為檢測該基因在對蝦中的轉(zhuǎn)錄表達水平提供了基礎(chǔ)。通過實時定量PCR方 法檢測海藻糖-6-磷酸合成酶基因在對蝦中的轉(zhuǎn)錄水平，可以將其應(yīng)用于評價對蝦抗高滲 的能力，為其在對蝦良種選育與種質(zhì)資源評價等領(lǐng)域提供信息和方法。
[0023] 本發(fā)明以南美白對奸Litopenaeus vannamei為研究材料，對高鹽度對4下與低鹽度 蝦的基因轉(zhuǎn)錄表達差異進行比較研究，篩選獲得了一種海藻糖-6-磷酸合成酶基因。研究發(fā) 現(xiàn)高鹽度對蝦中該基因轉(zhuǎn)錄表達水平明顯高于低鹽度蝦，平均達到2倍以上水平，說明南美 白對奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶的表達與對奸抗高滲存在密切的聯(lián) 系，具有重要的應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0024] 圖1為南美白對奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因?qū)崟r定量PCR 擴增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖譜（1: lkb DNA Marker;2:以對蝦cDNA為模版的PCR產(chǎn)物）。
[0025] 圖2為南美白對奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因?qū)崟r定量PCR 擴增產(chǎn)物的溶解曲線圖譜。
[0026] 圖3為南美白對奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因在高鹽度對 蝦與低鹽度對蝦中轉(zhuǎn)錄水平的情況(高鹽度對蝦為養(yǎng)殖于鹽度32%。的海水中對蝦，低鹽度 對蝦為養(yǎng)殖于鹽度5%。的海水中對蝦）。
【具體實施方式】
[0027] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如分子克隆實驗室手冊（1、薩姆布魯克，拉塞爾（著），黃培堂(譯），《分子克隆實驗指南》， 科學(xué)出版社，2002年，第三版.）中所述的實驗條件，或按照試劑或儀器生產(chǎn)廠商所建議的條 件。
[0028] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施，其具體步驟是：
[0029] 1 ·南美白對it!下Litopenaeus vannamei總RNA的提取
[0030] 取100mg南美白對奸1^1:〇口61^6118 vannamei肌肉組織，加入液氮磨成粉末，加入 lmL TRIzol (Invitrogen公司）混勾后轉(zhuǎn)入1 · 5mL離心管，室溫靜置5min裂解細胞；加入 0.2mL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置10min;4°C，12000g離心15min;將上層液體轉(zhuǎn)移至一新 的無 RNase離心管中，加入0.5mL異丙醇，混勾，室溫放置8min; 4°C，12000g離心10min;棄去 液體，加入lmL 75 %乙醇漂洗;4°C，7500g離心5min;棄去液體，沉淀稍加干燥后溶于適量 RNase-free的水中；用微量紫外分光光度計測量總RNA在0D23Q、0D26Q和0D 28Q的吸光度，判定 總RNA的濃度與純度。
[0031 ] 2.南美白對奸1^1:〇卩611&6118 vannamei cDNA反轉(zhuǎn)錄
[0032] 在0.5mL離心管制備cDNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，包括2yg總RNA，lyL 6mer隨機引物 (200ng)，lyL dNTP(lOmM)，用DEPC處理過的H20將總體積補至13yL;反應(yīng)體系65°C處理 5min，立即放入冰浴中l(wèi)min;稍離心，加入下列組分:4yL 5 X First-Strand Buffer，lyL DTT(0.1M)，lyL RNase Inhibitor(40U/yL)(TaKaRa公司）和lyL Superscript? III reverse transcriptase(20〇υ/μυ (Invitrogen公司）；反應(yīng)體系輕彈混勾，稍離心；25°C 5min，50°C 溫育 60min，70°C 處理 15min 終止反應(yīng)。
[0033] 3·南美白對4下1^1:〇口611&6118 vannamei海藻糖_6_磷酸合成酶基因 Lvtps的PCR擴增
[0034] 以南美白對奸Litopenaeus vannamei cDNA為模板，通過引物分別擴增得到海藻 糖-6-磷酸合成酶基因的開放閱讀框。
[0035] 在25yL的反應(yīng)體系中含lyL模板，lyL正反引物（20yM)，2yL dNTP(各2.5mM)，5yL 5 XPrimerSTAR? Buffer，0.5yL PrimerSTAR? HS DNA Polymerase(2.5UAxL)(TaKARa公 司），用H20將總體積補至25μΙ^ΡΟ?反應(yīng)條件為 ：98°C10s、58°C10s、72°C2min(30cycles);4 °C保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后與T載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞ToplO中，菌落PCR后選 取有DNA片段的陽性克隆測序。
[0036] 根據(jù)擴增獲得的核苷酸序列推導(dǎo)出氨基酸序列，分別含有844個氨基酸的多肽，其 氨基酸序列詳見SEQ ID No.2。
[0037] 4.南美白對奸1^1：(^61136118 vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因 Lvtps轉(zhuǎn)錄水平 的檢測方法
[0038] 正向引物：ACAGGTGATTCCCGTGAGGCTGCCT(SEQ ID Νο·3)
[0039] 反向引物：AATGCTCGTTGACTTGCCTGTAAGC(SEQ ID Νο·4)
[0040] 在20yL的反應(yīng)體系中含模板，0.5yL正向引物（20μΜ)，0.5μL反向引物（20μΜ)， 0.5yLSYBR_Premix Ex Taq?(Tli RNaseH Plus)(2X)(TaKARa公司），用Η20將總體積補至 20μΙ^ΡΟ?反應(yīng)條件為：95°(：158、55 1€2〇8、721€2〇8(3(^7(3168);4°(：保存。以南美白對蝦 Litopenaeus vannamei看家基因 tubulin的轉(zhuǎn)錄水平作為內(nèi)參對照。
[0041 ] 5.南美白vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因?qū)}度變化的響 應(yīng)
[0042] 從對蝦養(yǎng)殖場(海水鹽度2.8 % )取回凡納濱對蝦后，在高鹽池和低鹽池中分別對 對蝦進行馴養(yǎng)，每天提高或降低〇. 2 %，直至鹽度分別達到3.2 %或0.5 %，待對蝦充分適應(yīng) 環(huán)境后，分別各取高鹽蝦和低鹽蝦5只，取肌肉組織液氮凍存，提取總RNA，去除基因組DNA， 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過實時定量PCR確定不同鹽度環(huán)境對蝦海藻糖-6-磷酸合成酶基因的轉(zhuǎn)錄 表達水平，發(fā)現(xiàn)該基因在高鹽度對蝦中水平較高（圖1、2、3)，推測其與對蝦抗高滲相關(guān)。該 基因和檢測方法能夠被作為評價對蝦抗?jié)B能力的指標(biāo)應(yīng)用。
【主權(quán)項】
1 ·南美白對奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因 Lvtps，其特征在于其 分子類型為cDNA，序列特征:長度為2535bp，類型為核酸，鏈性為雙鏈，拓撲結(jié)構(gòu)為線性，所 述南美白對奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因 Lvtps的序列如下所示，記 為SEQID No.l:2.如權(quán)利要求1所述南美白對奸1^1：(^61136113￥3111131116；[海藻糖-6-磷酸合成酶基因 Lvtps，其特征在于其核苷酸序列采用以下方法獲得：提取南美白對奸Litopenaeus vannamei的RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進一步以cDNA為模板，經(jīng)PCR擴增得到SEQ ID No. 1 的序列；相關(guān)的核苷酸序列通過預(yù)測獲得基因編碼的多肽SEQ ID No.2:3 ·南美白對奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶LvTPS，其特征在于其分子 類型為蛋白質(zhì)，序列特征：長度為844aa，類型為氨基酸，所述南美白對蝦 Litopenaeusvannamei海藻糖_6_磷酸合成酶LvTPS的序列為SEQ ID Νο·2。 4 ·南美白vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因 Lvtps的檢測方法，其 特征在于包括以下步驟： 一個南美白對奸Litopenaeus vannamei總RNA提取的步驟； 一個南美白對奸Litopenaeus vannamei cDNA反轉(zhuǎn)錄的步驟； 一個南美白對奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測步 驟。5. 南美白對奸Litopenaeus vannamei海藻糖-6-磷酸合成酶基因的核苷酸序列，其特 征在于采用以下方法獲得:提取南美白對奸Litopenaeus vannamei的RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄 成cDNA，進一步以cDNA為模板，經(jīng)PCR擴增得到SEQ ID No. 1的序列。根據(jù)核苷酸序列設(shè)計最 佳的引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4,用于實時定量PCR方法，檢測基因的轉(zhuǎn)錄表達水平： 所述引物序列SEQ ID No.3:ACAGGTGATTCCCGTGAGGCTGCCT 所述引物序列SEQ ID No.4:AATGCTCGTTGACTTGCCTGTAAGC。6. 如權(quán)利要求1所述南美白對奸1^1：(^61136113￥3111131116；[海藻糖-6-磷酸合成酶基因 Lvtps在評價對奸抗高滲能力中應(yīng)用。7. 如權(quán)利要求1所述南美白對奸1^1：(^61136113￥3111131116；[海藻糖-6-磷酸合成酶基因 Lvtps在對蝦良種選育與種質(zhì)資源評價中應(yīng)用。
【文檔編號】C12N9/10GK105950637SQ201610489793
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月28日
【發(fā)明人】阮靈偉, 施泓, 徐洵
【申請人】國家海洋局第三海洋研究所