專利名稱：一種重組抗opn單克隆抗體及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及免疫學技術(shù)領域。具體地說，本發(fā)明涉及一種新的抗OPN單克隆抗體，及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
Osteopontin(OPN)為早期的T淋巴細胞活化分子1(Eta1)，是具有多種功能的分泌型糖蛋白。其可能的功能包括參與骨骼代謝，免疫調(diào)節(jié)，創(chuàng)傷愈合，細胞生存及腫瘤的進展。根據(jù)基因結(jié)構(gòu)及染色體位置，OPN是整合素結(jié)合配體家族成員，為一小分子的N連接糖蛋白(SIBLING)，該家族還包括骨骼唾液酸蛋白(BSP)，牙基質(zhì)蛋白1(DMP1)，牙齒唾液酸磷酸蛋白(DSPP)以及磷酸化糖蛋白細胞外基質(zhì)(MEPE)。人OPN cDNA編碼314個氨基酸殘基的前體蛋白，其中包含16個氨基酸的信號肽，剪切后形成298個氨基酸的成熟蛋白。OPN為一高度酸化的多功能域的蛋白，理論分子量約33kDa，但由于高度的糖苷化及磷酸化，其分子量可以達到75kDa。
OPN主要由骨骼、腎臟和上皮組織表達，但也可在子宮內(nèi)膜組織、內(nèi)皮細胞、T細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞及許多的腫瘤組織中檢測到。在某些病理過程中組織中OPN的表達會上調(diào)，包括動脈硬化、瓣膜狹窄、心肌梗塞及類風濕性關(guān)節(jié)炎。OPN在數(shù)種生物體液中都可檢測到，包括人血漿、血清、乳汁及尿液，在某些惡性腫瘤、爆發(fā)性肝炎、結(jié)核及自身免疫性疾病如多發(fā)性硬化和紅斑狼瘡中其表達上調(diào)。
OPN的活性可通過一系列受體介導，包括許多整合素和透明質(zhì)酸受體CD44。OPN含有多個與整合素結(jié)合的功能域。其典型的Arg-Gly-Asp(RGD)位點可與數(shù)種αv類型的整合素(αvβ1，αvβ3，αvβ5)及α5β1，α8β1結(jié)合，含有l(wèi)opinavir(LPV)的區(qū)域可以結(jié)合α4β1，SVVYGLR位點可以結(jié)合α4β1，α4β7和α9β1。OPN和可以結(jié)合CD44的變異體，可能通過與整合素的共同作用促進細胞遷移。細胞內(nèi)的OPN通過與CD44及ERM(ezrin/radixin/moesin)蛋白的相互作用或是通過調(diào)節(jié)細胞表面的CD44表達而促進細胞的遷移。
OPN及其蛋白酶解產(chǎn)物具有相互調(diào)節(jié)的作用。OPN被凝血酶、MMP-3、MMP-7或MMP-12酶解后產(chǎn)生OPN片段，與完整的OPN具有不同的生物學功能。例如，凝血酶、MMP-3、MMP-7酶切后可以增強整合素依賴的細胞粘附和遷移。反之，OPN通過包括轉(zhuǎn)化/活化前體或是再活化TIMP抑制的酶的機制活化MMP-2和MMP-3。
如其命名，OPN在骨骼的代謝中發(fā)揮一定的作用。在體外，OPN可刺激破骨細胞向骨骼粘附，如果抑制這種相互作用，則可以阻斷骨骼的再吸收。OPN基因敲除的小鼠骨骼的發(fā)育表觀上是正常的，但表現(xiàn)出出生后某些部位骨骼再吸收的缺陷，因此也支持OPN對破骨細胞的作用。OPN還直接參與調(diào)節(jié)礦物晶體的形成及生長。在體內(nèi)和體外，OPN與羥基磷灰石結(jié)合可抑制晶體的形成。炎癥反應的介導因子包括LPS，NO，IL-1β，和TNFα均可刺激OPN的表達。OPN調(diào)節(jié)巨噬細胞的分化和聚集。OPN還具有趨化因子及T細胞共刺激分子的功能，其可促進Th1細胞因子IL-12的產(chǎn)生。OPN基因敲除的小鼠表現(xiàn)為Th1反應的缺陷以及易于發(fā)生細菌和病毒的感染。但OPN在某些條件下也可抑制炎癥反應。如在體外，OPN可抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞數(shù)種炎性介質(zhì)的釋放。
由于OPN具有重要的生理及病理學意義，因此，檢測OPN的血清濃度具有潛在的生理及病理學意義，所以迫切需要一種能有效、快速檢測OPN在血清中濃度的產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的需要解決的技術(shù)問題之一是提供一種重組的抗OPN單克隆抗體，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
本發(fā)明需要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種編碼上述抗OPN單克隆抗體的DNA分子。
本發(fā)明需要解決的第三個技術(shù)問題是提供一種上述單克隆抗體的用途。
本發(fā)明需要解決的第四個技術(shù)問題是提供一種該單克隆抗體的制備方法。
為達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明一方面提供了一種重組的抗OPN抗體，該抗體含有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其特征在于，輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
本發(fā)明另一方面提供了編碼上述單克隆抗體的DNA分子。
在一個較佳的實例中，該DNA分子含有SEQ ID NO3所示的編碼所述單抗輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，以及SEQ ID NO4所示的編碼所述單抗重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。
本發(fā)明第三方面提供了一種表達載體，該表達載體含有上述DNA序列以及與該序列操作性相連的表達調(diào)控序列。
本發(fā)明第四方面提供了一種宿主細胞，其特征在于，它被上述表達載體轉(zhuǎn)化。在一個較佳的實例中，該宿主細胞是CHO細胞。
本發(fā)明第五方而提供了一種抗OPN單克隆抗體檢測OPN濃度的的方法，其特征在于，所述的方法為常規(guī)的ELISA法。
本發(fā)明第六方面提供了一種制備上述單克隆抗體的方法，其特征在于，該方法包括a)提供一表達載體，該表達載體含有上述DNA序列以及與該序列操作性相連的表達調(diào)控序列；b)用步驟a)所述的表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞c)在適合所述單克隆抗體表達的條件下培養(yǎng)步驟b)所得的宿主細胞；和d)分離純化獲得所述單克隆抗體。
本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明的單克隆抗體能快速、靈敏的檢測患者血清中OPN的濃度。


圖1載體pMG18，并且標明了其中的元件及酶切位點。
圖2本發(fā)明所構(gòu)建的pM載體。其中，hCMV pro為人巨細胞病毒早期啟動子；Ck為小鼠κ輕鏈恒定區(qū)基因；IgG1 constant為小鼠γ1重鏈恒定區(qū)基因；pA為多聚腺苷化信號；DHFR為二氫葉酸還原酶基因；AmpR為氨芐青霉素抗性基因。
圖3本發(fā)明所構(gòu)建的pM(H+L)載體，含有重組抗OPN抗體重鏈全長和輕鏈全長基因。
圖4抗OPN單克隆抗體與市售OPN單克隆抗體檢測OPN靈敏度的比較實驗結(jié)果。
具體實施例方式
本發(fā)明涉及一種重組的抗OPN單克隆抗體，該抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其特征在于，輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
本文所用的術(shù)語“單克隆抗體(單抗)”指從一類基本均一的群體獲得的抗體，即該群體中包含的單個抗體是相同的，除少數(shù)可能存在的天然發(fā)生的突變外。單克隆抗體高特異性地針對單個抗原位點。而且，與常規(guī)多克隆抗體制劑(通常是具有針對不同決定簇的不同抗體)不同，各單克隆抗體是針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性外，單克隆抗體的好處還在于它們是通過雜交瘤培養(yǎng)來合成的，不會被其它免疫球蛋白污染。修飾語“單克隆”表示了抗體的特性，是從基本均一的抗體群中獲得的，這不應被解釋成需要用任何特殊方法來生產(chǎn)抗體。
本文所用的術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”是有相同結(jié)構(gòu)特征的約150000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由兩個相同的輕鏈(L)和兩個相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數(shù)目不同。每條重鏈和輕鏈也有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(qū)(VH)，其后是多個恒定區(qū)。每條輕鏈的一端有可變區(qū)(VL)，另一端有恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個恒定區(qū)相對，輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)相對。特殊的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區(qū)之間形成界面。
本文所用的術(shù)語“可變”表示抗體中可變區(qū)的某些部分在序列上有所不同，它形成各種特定抗體對其特定抗原的結(jié)合和特異性。然而，可變性并不均勻地分布在整個抗體可變區(qū)中。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中稱為互補決定區(qū)(CDR)或超變區(qū)中的三個片段中?？勺儏^(qū)中較保守的部分稱為構(gòu)架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)中各自包含四個FR區(qū)，它們大致上呈p一折疊構(gòu)型，由形成連接環(huán)的三個CDR相連，在某些情況下可形成部分p折疊結(jié)構(gòu)。每條鏈中的CDR通過FR區(qū)緊密地靠在一起并與另一鏈的CDR一起形成了抗體的抗原結(jié)合部位(參見Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669頁(1991))。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是它們表現(xiàn)出不同的效應功能，例如參與抗體的依賴于抗體的細胞毒性。
單克隆抗體可用本領域技術(shù)人員熟知的各種方法來制得。例如，單克隆抗體可用雜交瘤方法(由Kohler等，Nature，256495(1975)首先提出)制得，或用重組DNA方法(美國專利No.4,816,567)制得。單克隆抗體也可用例如Clackson等，Nature，352624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)所述的技術(shù)從噬菌體抗體庫中分離獲得。
本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明重組抗OPN單克隆抗體的DNA分子。在一個較佳的實例中，該DNA分子含有SEQ ID NO3所示的編碼所述單抗輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，以及SEQ ID NO4所示的編碼所述單抗重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。
在獲得編碼本發(fā)明重組抗OPN單克隆抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列后，通常可通過以下方法來制備本發(fā)明的單克隆抗體。
首先，提供含有編碼本發(fā)明單克隆抗體的核苷酸序列以及與該序列操作性相連的表達調(diào)控序列的表達載體。
本文所用的術(shù)語“表達調(diào)控序列”通常指參與控制核苷酸序列表達的序列。表達調(diào)控序列包括與目標核苷酸序列操作性相連的啟動子和終止信號。它們通常還包括核苷酸序列適當翻譯所需的序列?！安僮餍韵噙B”是指線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果啟動子或增強子增加了編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與編碼序列是操作性相連的。
編碼本發(fā)明單克隆抗體的DNA序列可用本領域技術(shù)人員熟知的常規(guī)手段來制得。例如，可根據(jù)本發(fā)明公開的序列人工合成或用PCR法擴增得到編碼該單克隆抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。然后，用本領域熟知的各種方法通過選擇合適的酶切位點將這些核苷酸序列插入合適的表達載體中，使它們分別在表達載體所攜帶的重鏈恒定區(qū)編碼序列和輕鏈恒定區(qū)編碼序列之前，并使它們在同一讀框內(nèi)。
本發(fā)明中所用的表達載體是本領域技術(shù)人員已知的各種市售的表達載體，例如購自Qiagen和Promega公司的表達載體，以及可購得的表達載體pMG 18(《根據(jù)INCP-9質(zhì)粒序列進行環(huán)境監(jiān)測的工具的開發(fā)》(DEVELOPMENT OFTOOLS FORENVIRONMENTAL MONITORING BASED ON INCP-9PLASMIDS SEQUENCES)，A.Created，R.Krasowiak，M.Titok，C.M.ThomasSchool of Biological Sciences，University of Birmingham，Edgbaston，Birmingham B15 2TT，UK and Faculty of Biology，Dept of Microbiology，Belarus State UniversityScoring Av.4，Minsk 220080 Belarus)。
隨后，用上述獲得的表達載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細胞?！八拗骷毎币话惆ㄔ思毎驼婧思毎３Ｓ玫脑怂拗骷毎睦影ù竽c桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。在本發(fā)明中，較佳的宿主細胞是CHO細胞。用表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞的方法有很多種，所用的轉(zhuǎn)化程序取決于待轉(zhuǎn)化的宿主。將異源多核苷酸導入哺乳動物細胞中的方法是本領域所知的，其包括葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、Polybrene(1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物)介導轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染以及將DNA直接顯微注射到胞核中。在本發(fā)明中，較佳的方法是電穿孔法或脂質(zhì)體介導法等。例如可采用Invitrogen公司的脂質(zhì)體法試劑盒來轉(zhuǎn)染CHO細胞。
然后，在適合本發(fā)明單克隆抗體表達的條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化所得的宿主細胞。然后用常規(guī)的免疫球蛋白純化步驟，如蛋白A-Sepharose羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、離子交換層析、疏水層析、分子篩層析或親和層析等本領域技術(shù)人員熟知的常規(guī)分離純化手段純化得到本發(fā)明的重組抗OPN單克隆抗體。
所得單克隆抗體可用常規(guī)手段來鑒定。單克隆抗體的結(jié)合特異性可用免疫沉淀或體外結(jié)合試驗(如放射性免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)來測定。單克隆抗體的結(jié)合親和力例如可用Munson等，Anal.Biochem.，107220(1980)的Scatchard分析來測定。
下面將結(jié)合實施例進一步詳細地描述本發(fā)明。然而應當理解，列舉這些實施例只是為了起說明作用，而并不是用來限制本發(fā)明。
實施例1 從抗體庫中篩選OPN的抗體基因可變區(qū)1)鼠源抗體庫的構(gòu)建Osteopontin(購自R&D System)與弗氏佐劑免疫Balb/C小鼠，免疫4次后，小鼠血清1∶500稀釋后與OPN顯強陽性反應，取免疫后小鼠脾臟，按照Marks等人J.Mol.Biol.，222，581-597.Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227，381-388.Haidaris CG等人J Immunol Methods.2001 Nov 1；257(1-2)185-202，Griffiths，A.D.等人EMBO J.，13，3245-3260(1994).Nissim，A.等人EMBO J.，13，692-698(1994)中描述的方法，構(gòu)建鼠源抗體庫。
2)篩選將復蘇的抗體庫菌株1毫升加入新鮮LB培養(yǎng)基14毫升，于50毫升三角瓶中37℃培養(yǎng)16小時。
12000rpm高速離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至無菌的50毫升離心管中，保存?zhèn)溆谩４_保其滴度應在2×1011以上。用純化的OPN作為抗原，用常規(guī)方法包被25毫升細胞培養(yǎng)瓶。包被后的細胞瓶中加入不少于3×1010噬菌體，37℃溫育1小時。倒掉瓶中的液體，用10毫升加入了1％Tween-20的PBS洗滌培養(yǎng)瓶10次。在培養(yǎng)瓶中加入1毫升對數(shù)期的TG1細胞，37℃溫育震蕩培養(yǎng)16小時。
重復上段所述步驟4次。
將上述獲得的細胞稀釋至105細胞/毫升后在加有0.1氨芐青霉素的1.5％瓊脂平板上培養(yǎng)，獲得單克隆。
取上述平板上的克隆在96孔深孔板上進行培養(yǎng)，每孔一個克隆，共作960個克隆(10塊96孔板)。
將上述深孔板在96孔板離心機上5000RPM離心20分鐘后，將上清轉(zhuǎn)移到新的無菌深孔板，封口后保藏于4℃?zhèn)溆谩?br> 取96孔板10塊，每孔中加入OPN(10微克/毫升)10微升常規(guī)包被后，分別加入上述保存的上清10微升，37℃溫育1小時后用含有1％Tween-20的PBS洗滌20次。加入1微升HRP標記的羊抗M13單抗(購自Pharmacia公司)，37℃溫育30分鐘后用1％Tween-20的PBS洗滌10次。
加入含有0.025％DAB顯色劑的PBS 200微升和1微升1％的H2O2，37℃溫育顯色20分鐘后在讀板機上讀取595納米處的光吸收。
根據(jù)光吸收讀數(shù)確定顯色反應強的孔，這些孔相對應的克隆即為親和力較強的抗體可變區(qū)克隆。本試驗結(jié)果共篩選出316個陽性克隆，根據(jù)其讀數(shù)確定其中5個親和力最強的克隆，用于下一步的研究。
3)抗體可變區(qū)編碼序列向表達載體的克隆使上述5個克隆的菌株在100毫升LB培養(yǎng)基中擴增，然后按照生產(chǎn)商說明書用Promega公司的pMG18質(zhì)粒DNA抽提純化試劑盒純化質(zhì)粒DNA。
用XbaI和NheI限制性酶酶切上述質(zhì)粒DNA后在1.5％瓊脂糖凝膠電泳上分離酶切片段，取357bp左右的帶進行膠回收，所得片段即為重鏈可變區(qū)。PCR擴增后，進行序列測定。用XbaI和BsiWI限制性酶酶切上述質(zhì)粒DNA后在1.5％瓊脂糖凝膠電泳上分離酶切片段，取339bp左右的帶進行膠回收，所得片段即為輕鏈可變區(qū)。PCR擴增后，進行序列測定。確定正確序列后，化學合成法合成輕鏈全長序列，5’端設計HindIII酶切位點，恒定區(qū)為小鼠κ輕鏈恒定區(qū)序列，3’端設計EcoRI酶切位點。
PCR法自小鼠脾細胞擴增IgG1重鏈恒定區(qū)序列，并將CH1起始氨基酸突變?yōu)锳la-Ser，同時含有了NheI酶切位點，3’端設計BamHI酶切位點，擴增后測序驗證無誤后，NheI和BamHI雙酶切小鼠IgG1恒定區(qū)片段和pMG18，將小鼠IgG1恒定區(qū)連入pMG18，構(gòu)建的新載體命名為pM，見圖2。
用XbaI和NheI限制性酶酶切表達載體pM。該表達載體的酶切圖譜如圖2所示。然后將上述重鏈可變區(qū)插入該表達載體的XbaI/NheI位點中。同樣，利用HindIII和EcoRI限制性酶將抗體輕鏈全長cDNA插入到pM載體的HindIII/EcoRI位點中，從而構(gòu)建得到含有重組抗OPN抗體重鏈全長和輕鏈全長基因的表達載體pM(H+L)，見圖3。
4)CHO細胞的轉(zhuǎn)染與重組克隆的篩選上述構(gòu)建的帶有抗體基因的表達載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株中接種于100毫升LB培養(yǎng)基中進行擴增，用Qiagen公司的超純質(zhì)粒DNA純化試劑盒(Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit)抽提純化質(zhì)粒DNA。采用Invitrogen公司的脂質(zhì)體法試劑盒，將上述純化的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染CHO細胞，操作參照廠家的說明書進行。
轉(zhuǎn)化的CHO細胞在HAT選擇培養(yǎng)基上進行連續(xù)9周的選擇，最后在96孔板上進行極限稀釋培養(yǎng)，連續(xù)進行3次，進行單克隆化。
挑出的單克隆細胞系在RPMI 1640培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，對上清進行Western印跡試驗，根據(jù)染色反應判斷表達強度，挑選出12個表達強的克隆作為候選細胞株。
5)單克隆抗體的純化用ProteinA親和層析柱從細胞培養(yǎng)上清中直接分離純化出上述單克隆抗體，經(jīng)SDA-PAGE電泳證明，所得產(chǎn)物純度大于90％。親和層析的產(chǎn)物再次經(jīng)過分子篩層析，獲得了純度＞98％的樣品。將這些樣品用于以下的進一步分析與研究中。
實施例2 抗體基因在CHO細胞中的表達強度將上述篩選得到的12個高表達候選克隆培養(yǎng)于10cm的組織培養(yǎng)皿中，如下所述用ELISA法測定抗體的表達量。將羊抗鼠IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃過夜，經(jīng)2％BSA于37℃封閉2小時，加入待測的培養(yǎng)上清和標準品(鼠IgG1)，37℃孵育2小時，加入HRP一羊抗鼠IgG(κ)進行結(jié)合反應，37℃孵育1小時，加入TMB于37℃作用10分鐘，最后用H2SO4終止反應，測A450值。下表1中顯示了上述篩選獲得的12個候選克隆的表達量。
表1 候選克隆在CHO細胞中的表達量

從上表1可以看出，7G2，9B2和9H4具有很高的表達水平。
實施例3 抗OPN單克隆抗體基因的DNA測序根據(jù)系譜，對上述獲得的7G2細胞株的抗OPN抗體基因進行DNA測序。結(jié)果如下SEQ ID NO3顯示了其輕鏈可變區(qū)基因序列(5’到3′，339bp)其推測的氨基酸序列顯示在SEQ ID NO1中；SEQ ID NO3顯示了其重鏈可變區(qū)基因序列(5′到3′，357bp)，其推測的氨基酸序列顯示在SEQ ID NO2中。
實施例4 單克隆抗體親和力研究按以下方法對各克隆的細胞培養(yǎng)液進行純化。10000rpm離心除去細胞和細胞碎片，100Kd截留分子量的濾膜超濾濃縮至1/10體積，超濾緩沖液是100mMTris-HCl，pH7.5。過SPA-sepharose親和層析柱，上樣液為100mM Tris-HCl，pH7.5，洗脫液為20mM檸檬酸，pH3.0，100mM NaCl。分子篩(Sephadex G200)層析。洗脫液為100mM Tris-HCl，pH7.5，得純品。
親和力測定采用Scatchard分析法(Munson等人，1980，Anal.BioChem.，107220)進行。結(jié)果表明，7G2，9B2和9H4三種單抗的親和力分別達到5.6×10-10，1.78×10-10和8×10-7。
實施例5 抗OPN單克隆抗體的對OPN的檢測試驗1.試劑和材料1.1待檢測樣品和標準品。
1.2抗OPN單抗構(gòu)建的工程細胞經(jīng)無血清發(fā)酵，proteinA親和層析純化獲得。
1.3兔抗人OPN多克隆血清(Osteopontin與弗氏佐劑免疫新西蘭大白兔，取血清檢測，1∶2000稀釋后，與OPN呈強陽性反應，取血清備用。
1.4羊抗兔IgG(H+L)多抗，HRP標記，稀釋度1∶1000-4000，Southern Biotech。
1.5HRP顯色底物TMB，上?？迫A公司，分A液及B液，臨用前，兩者等體積混合。
1.6終止液0.5mol/L硫酸。
1.7pH＝7.2的PBS稱取KH2PO40.21g，NaCl 9.0g，Na2HPO4.12H2O 0.97g，加注射用水溶解至1000ml。
1.8包被緩沖液20mmol/l pH＝9.6的碳酸鈉緩沖液。
1.9封閉緩沖液稱取3g牛血清白蛋白，加入pH7.2的PBS溶解至100ml。
1.10洗滌緩沖液取1ml Tween20，加入PBS至1升。
1.11酶標儀。
1.12低吸附96孔酶標板Nunc。
1.13其它多道加樣器、吸嘴等2.方法夾心ELISA法2.1抗OPN單抗稀釋于包被緩沖液中，濃度1.0μg/ml，包被96孔酶標板，0.1ml/well，37℃2h。
2.2洗滌洗滌緩沖液洗滌2遍，每次均在吸水紙上拍干。
2.3封閉封閉緩沖液加滿孔后37℃2h。
2.4洗滌洗滌緩沖液洗滌3遍，每次均在吸水紙上拍干。
2.5加抗原加入用封閉緩沖液稀釋至100，50，25，12.5，6.25(pg/mL)的OPN標準品，0.1ml/well，設2復孔，同一板內(nèi)加入適當稀釋的待檢測樣品，0.1ml/well，設2復孔。
2.6 37℃2h。
2.7洗滌洗滌緩沖液洗滌5遍，每次均在吸水紙上拍干。
2.8加入兔抗人OPN多克隆抗血清，37℃2h。
2.9洗滌洗滌緩沖液洗滌5遍，每次均在吸水紙上拍干。
2.10加入HRP標記的羊抗兔IgG二抗加入用PBS 1∶2000稀釋的二抗，37℃1h。
2.11洗滌洗滌緩沖液洗滌5遍，每次均在吸水紙上拍干。
2.12顯色加顯色底物100μL/孔，避光顯色5～20min(顯色時間視顯色情況而定)，加終止液50μL/孔。
2.13酶標儀讀數(shù)測量450nm光吸收，以630nm為參考波長。
2.14用標準品濃度(對數(shù))與A450/630nm值做直線回歸方程。
該方法檢測OPN靈敏度高(6.52pg/mL)，特異性強(與小鼠血清、食蟹猴血清等均無交叉反應)，準確性與精密度均可達到藥物代謝動力學的要求。
實施例6抗OPN單克隆抗體與市售OPN單克隆抗體檢測OPN靈敏度的比較試驗1.試劑和材料
1.1人OPN(R&D Systems)。
1.2市售mouse anti human OPN mAb(R&D Systems，MAB14331)。
1.3本專利公開的抗OPN單抗構(gòu)建的工程細胞經(jīng)無血清發(fā)酵，proteinA親和層析純化獲得。
1.4兔抗人OPN多克隆血清(Osteopontin與弗氏佐劑免疫新西蘭大白兔，取血清檢測，1∶2000稀釋后，與OPN呈強陽性反應，取血清備用。
1.5羊抗兔IgG(H+L)多抗，HRP標記，稀釋度1∶1000-4000，Southern Biotech。
1.6HRP顯色底物TMB，上?？迫A公司，分A液及B液，臨用前，兩者等體積混合。
1.7終止液0.5mol/L硫酸。
1.8pH＝7.2的PBS稱取KH2PO40.21g，NaCl 9.0g，Na2HPO4.12H2O 0.97g，加注射用水溶解至1000ml。
1.9包被緩沖液20mmol/l pH＝9.6的碳酸鈉緩沖液。
1.10封閉緩沖液稱取3g牛血清白蛋白，加入pH7.2的PBS溶解至100ml。
1.11洗滌緩沖液取1ml Tween20，加入PBS至1升。
1.12酶標儀。
1.13低吸附96孔酶標板Nunc。
1.14其它多道加樣器、吸嘴等2.方法夾心ELISA法2.1本專利公開的抗OPN單抗及市售mouse anti human OPN mAb稀釋于包被緩沖液中，濃度1.0μg/ml，包被96孔酶標板，0.1ml/well，37℃2h。
2.2洗滌洗滌緩沖液洗滌2遍，每次均在吸水紙上拍干。
2.3封閉封閉緩沖液加滿孔后37℃2h。
2.4洗滌洗滌緩沖液洗滌3遍，每次均在吸水紙上拍干。
2.5加抗原本專利公開的抗OPN單抗包被孔中加入用封閉緩沖液稀釋至100，50，25，12.5，6.25(pg/mL)的OPN標準品，0.1ml/well，設2復孔，市售mouseanti human OPN mAb包被孔中加入用封閉緩沖液稀釋至100，50，25，12.5，6.25(ng/mL)的OPN標準品，0.1ml/well，設2復孔。
2.6 37℃2h。
2.7洗滌洗滌緩沖液洗滌5遍，每次均在吸水紙上拍干。
2.8加入兔抗人OPN多克隆抗血清，37℃2h。
2.9洗滌洗滌緩沖液洗滌5遍，每次均在吸水紙上拍干。
2.10加入HRP標記的羊抗兔IgG二抗加入用PBS 1∶2000稀釋的二抗，37℃1h。
2.11洗滌洗滌緩沖液洗滌5遍，每次均在吸水紙上拍干。
2.12顯色加顯色底物100μL/孔，避光顯色5～20min(顯色時間視顯色情況而定)，加終止液50μL/孔。
2.13酶標儀讀數(shù)測量450nm光吸收，以630nm為參考波長。
2.14用標準品濃度(對數(shù))與A450/630nm值做直線回歸方程。
實驗結(jié)果表明，本專利公開的抗OPN單抗包被孔與市售mouse anti human OPNmAb包被孔顯色程度基本一致，而OPN濃度相差3個數(shù)量級，即本專利公開的單抗檢測人OPN的靈敏度比市售單抗高1000倍。見圖4盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點對于本領域技術(shù)人員來說是明顯的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對本發(fā)明作各種變化和改動。因此，所附權(quán)利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動。
序列表<110>上海中信國健藥業(yè)有限公司<120>一種重組抗OPN單克隆抗體及其制備方法和用途<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>103<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(103)<223>輕鏈可變區(qū)<400>1Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly5 10 15Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser20 25 30Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Lys Leu Leu Ile Ser Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser85 90 95Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110Arg<210>2<211>119<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(119)<223>重鏈可變區(qū)<400>2Met Ala Gln Val Gln Leu Glu Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro5 10 15Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Thr Phe Thr20 25 30Thr Tyr Val Met His Typ Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu35 40 45Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Asn Glu50 55 60Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Asn Thr
65 70 75 80Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr85 90 95Tyr Ser Asp Ser His Tyr Gly Gly Ser Pro Ala Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Leu Val Thr Val Ser Ala115<210>3<211>339<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(339)<223>輕鏈可變區(qū)<400>3GATAT TTTGA TGACC CAGAC TCCAC TCTCC CTGCC TGTCA GTCTT GGAGA TCAAG CCTCC60ATCTC TTGCA GATCT AGTCA GAGCC TTGTA CACAG TAATG GAAAC ACCTA TTTAC ATTGG120TACCT GCAGA AGCCA GGCCA GTCTC CAAAG CTCCT GATCT ACAAA GTTTC CAACC GATTT180TCTGG GGTCC CAGAC AGGTT CAGTG GCAGT GGATC AGGGA CAGAT TTCAC ACTCA AGATC240AGCAG AGTGG AGGCT GAGGA TCTGG GAGTT TATTT CTGCT CTCAA AGTAC ACATG TTCCG300TGGAC GTTCG GTGGA GGCAC CAAGC TGGAA ATAAA ACGT 339<210>4<211>357<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)...(357)<223>重鏈可變區(qū)<400>4ATGGC CCAGG TTCAG CTGGA GCAGT CTGGA CCTGA GCTGG TAAAG CCTGG GGCTT CAGTG60AAGAT GTCCT GCAAG TCTTC TGGAT ACACA TTCAC TACCT ATGTT ATGCA CTGGG TGAAG120CAGAA GCCTG GGCAG GGCCT TGAGT GGATT GGATA TATTA ATCCT TACAA TGATG GTAGT180AAGTA CAATG AGAAG TTCAA AGGCA AGGCC ACACT GACTT CAGAC AAATC CTCCA ACACA240GCCTA CATGG AGCTC AGCAG CCTGA CCTCT GAGGA CTCTG CGGTC TATTA CTGTG CAAGC300CACTA CGGTG GTAGC CCTGC TTACT GGGGC CAAGG GACTC TGGTC ACTGT CTCTG CG 35權(quán)利要求
1.一種重組抗OPN單克隆抗體，它包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其特征在于，輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2.一種DNA分子，其特征在于，它編碼權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
3..根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA分子，其特征在于，該DNA分子含有SEQ ID NO3所示的編碼所述單抗輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，以及SEQ ID NO4所示的編碼所述單抗重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。
4.一種表達載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的DNA序列以及與該序列操作性相連的表達調(diào)控序列。
5.一種真核宿主細胞，其特征在于，它被權(quán)利要求4所述的表達載體轉(zhuǎn)化。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的真核宿主細胞，其特征在于，所述的真核宿主細胞是CHO細胞。
7.一種用如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體檢測OPN濃度的方法，其特征在于，所述的方法為ELISA法。
8.一種制備權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的方法，其特征在于，該方法包括a)提供一表達載體，該表達載體含有權(quán)利要求3所述的DNA序列以及與該序列操作性相連的表達調(diào)控序列；b)用步驟a)所述的表達載體轉(zhuǎn)化真核宿主細胞；c)在適合所述單克隆抗體表達的條件下培養(yǎng)步驟b)所得的真核宿主細胞；和d)分離純化獲得所述單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組抗OPN單克隆抗體，輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本發(fā)明還公開了編碼該單克隆抗體的DNA分子，表達該單克隆抗體的載體以及被該表達載體轉(zhuǎn)化的真核宿主細胞。本發(fā)明提供的抗OPN單克隆抗體能快速檢測血清中OPN的濃度，靈敏度高，特異性強。
文檔編號G01N33/577GK101066999SQ20071008514
公開日2007年11月7日 申請日期2007年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月17日
發(fā)明者李博華, 錢衛(wèi)珠 申請人:上海中信國健藥業(yè)有限公司