專利名稱：一種精子熒光染色測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及熒光染色，尤其涉及核酸染色，更涉及精子熒光染色。
背景技術(shù)：
精子密度、精子膜完整性以及精子的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)是臨床男科實(shí)驗(yàn)室評(píng)估精液
質(zhì)量的最常用的指標(biāo)。使用計(jì)算機(jī)輔助精子分析(CASA)可以較精確的提供精 子動(dòng)力學(xué)的量化數(shù)據(jù)，但目前臨床上用的CASA不能用于精子密度的檢測，因 為它難以將精子從非精子的顆粒碎片中區(qū)分開來。CASA系統(tǒng)的另一個(gè)缺點(diǎn)是不 能區(qū)分不動(dòng)的精子和死精子，特別是需輔助生殖治療的男性患者，如果不動(dòng)精 子(D級(jí))的百分?jǐn)?shù)超過50%，則應(yīng)檢測精子的存活率，而且存活率評(píng)估可核
查精子活力評(píng)估的準(zhǔn)確性。
精子存活率檢測最常用的是伊紅染色和精子尾部低滲膨脹試驗(yàn)，兩種方法
最大的缺點(diǎn)是重復(fù)性差，不同實(shí)驗(yàn)室間的結(jié)果差異很大，而且操作過程中，對(duì) 精子的活率有顯著的影響，有的精子甚至已經(jīng)不動(dòng)了。
因此，本領(lǐng)域迫切需要提供一種熒光染色方法，它能準(zhǔn)確區(qū)分死細(xì)胞和活 細(xì)胞，對(duì)非細(xì)胞成分拒染，同時(shí)又沒有細(xì)胞毒性，即染料的加入不影響細(xì)胞正 常的生命活動(dòng)，那么畫A熒光染色CASA代替現(xiàn)有的CASA指日可待了 。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種精子熒光染色測定方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供染料碘化丙啶(PI)和Transgreen在精子熒 光染色測定中的用途。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種試劑盒，用于精子存活率熒光染色測定。
在本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了一種精子熒光染色測定方法，它包括步驟 (1)將精子、菲啶類染料和花菁類染料混合，得到混合溶液，所述的菲啶類 染料選自碘化丙啶、溴乙錠；花菁類染料選自Transgreen;(2)測定混合溶液中精子的熒光值。 在另一優(yōu)選例中，它包括步驟
(1) 將精子、碘化丙啶和Transgreen混合，得到混合溶液；
(2) 計(jì)數(shù)混合溶液中綠色精子和/或紅色精子的個(gè)數(shù)，其中綠色精子是活精 子，紅色精子是死精子。
在另一優(yōu)選例中，計(jì)數(shù)混合溶液中大于等于200個(gè)精子中綠色精子的個(gè)數(shù)。 在另一優(yōu)選例中，混合溫度為20 — 37。C，更佳地為30 — 37。C。 在另一優(yōu)選例中，所述的步驟(1)為將精子和碘化丙啶混合3 — 15分鐘后，
加入Transgreen，得到混合溶液。
在另一優(yōu)選例中，精子和碘化丙啶混合5 — 10分鐘，更佳地，為4一9分鐘。 在另一優(yōu)選例中，加入Transgreen混合5 — 20分鐘，進(jìn)行步驟(2)的測定。
更佳地，加入Transgreen混合3—10分鐘。
在另一優(yōu)選例中，精子和碘化丙啶混合的溶液濃度為12 — 48uM。 在另一優(yōu)選例中，精子和碘化丙啶混合的溶液濃度為18 — 36uM，更佳地，為
21 — 30uM。
在另一優(yōu)選例中，所述的步驟(1)為將精子和Transgreen混合3 —15分 鐘后，加入碘化丙啶，得到混合溶液。
在另一優(yōu)選例中，精子和Transgreen混合5 —10分鐘，更佳地，為4一9分鐘。
在另一優(yōu)選例中，加入碘化丙啶混合2 — 10分鐘，進(jìn)行步驟(2)的測定。更
佳地，加入碘化丙啶混合3 — 7分鐘。
在另一優(yōu)選例中，精子和Transgreen混合的溶液濃度為50 — 200nM。 在另一優(yōu)選例中，精子和Transgreen混合的溶液濃度為75 — 150nM，更佳地，
為90 — 120nM。
在另一優(yōu)選例中，所述的步驟(1)為將精子、碘化丙啶和Transgreen — 起加入，得到混合溶液。
在另一優(yōu)選例中，精子、碘化丙啶和Transgreen —起加入后混合10 — 30分 鐘，較佳地為10 — 20分鐘，更佳地為15 — 20分鐘。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種菲啶類染料和花菁類染料形成的復(fù)合染料 的用途，所述的復(fù)合染料用于精子存活率熒光染色測定。在另一優(yōu)選例中，所述的菲啶類染料選自碘化丙啶、溴乙錠；花菁類染料選
自Transgreeno
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種試劑盒，它含有-
(a) 菲啶類染料，所述的菲啶類染料選自碘化丙啶、溴乙錠；和
(b) 花菁類染料，所述的花菁類染料選自Transgreen。
據(jù)此，本發(fā)明提供了一種熒光染色方法，它能準(zhǔn)確區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞， 對(duì)非細(xì)胞成分拒染，同時(shí)又沒有細(xì)胞毒性，即染料的加入不影響細(xì)胞正常的生 命活動(dòng)。


圖1顯示了 Transgreen染料和PI染料對(duì)精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響，即各組在
不同時(shí)間測定的活率；其中
T組表示精子懸液；A組表示精子懸液+ Transgreen; B組表示精子懸液十 PI; A+B組表示精子懸液+ Transgreen/PI。
圖2顯示了 Transgreen與PI加入時(shí)間先后對(duì)精子存活率統(tǒng)計(jì)的影響，即
各組在不同時(shí)間測定的存活率結(jié)果比較；其中
T組表示精子懸液；A60 + B組表示Transgreen預(yù)染60分鐘后加PI; B組 表示PI預(yù)染60分鐘后加Transgreen; (A+B) 60組表示Transgreen/PI復(fù)合 染料染色60分鐘。
具體實(shí)施例方式
發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)了一種精子存活率熒光染色方法， 本發(fā)明提供的方法是將精子懸液與PI和Transgreen混合，在適宜的溫度下培 養(yǎng)。該方法(1)可以精準(zhǔn)地了解精子的密度；(2)可以準(zhǔn)確地了解精子的存 活率；(3)可以有效地排除非精子因素的干擾；(4)可有效保持存活精子的 活力。
本發(fā)明提供的精子熒光染色測定的方法是將精子懸液分別與菲啶類染料， 花菁類染料或復(fù)合染料混合共孵育。
5在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，是將精子懸液與復(fù)合染料Transgreen/PI混合 共孵育。溶液中會(huì)有染成綠色和紅色的精子，綠色的精子是活精子，紅色的精 子是死精子，測定混合溶液中大于等于200個(gè)精子中綠色精子所占的比例即為 精子的存活率。
然后可以運(yùn)用一些分析軟件，得到有關(guān)精子密度、存活情況、活力等的參 數(shù)。所述的分析軟件包括但不限于計(jì)算機(jī)輔助精子精液質(zhì)量分析系統(tǒng)、動(dòng)(靜) 態(tài)圖像分析系統(tǒng)、熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀。
精子質(zhì)膜的完整性對(duì)于受精十分重要。目前臨床男科實(shí)驗(yàn)室依然用精子伊 紅Y染色或精子尾部低滲膨脹試驗(yàn)作為常用的活體精子染色技術(shù)，這些方法存 在著一定的主觀性、可變性以及靈敏度差等缺點(diǎn)。熒光染色技術(shù)有靈敏度高、 便于觀察等特點(diǎn)，如果將熒光染色技術(shù)動(dòng)態(tài)地應(yīng)用于計(jì)算機(jī)輔助精子自動(dòng)分析 系統(tǒng)及流式細(xì)胞儀，則可以在短時(shí)間內(nèi)同時(shí)得到精子的活率、存活率及密度等 數(shù)據(jù)，而且可以將精子分成五級(jí)(A，B，C，D，E) ， D級(jí)(含D級(jí))以上為活精子， 即有生命力的，E級(jí)為死精子。
PI是一類只對(duì)死精子或細(xì)胞染色的核染料(紅色)，而Transgreen染料 是一種膜通透性的核染料，可以快速穿透任何細(xì)胞膜(或細(xì)胞壁)而與DNA結(jié) 合，因此死活精子都著色(綠色)。Transgreen與PI同時(shí)存在的情況下，PI 能取代Transgreen與DNA結(jié)合。結(jié)果導(dǎo)致活細(xì)胞呈綠色，死細(xì)胞呈紅色。
本發(fā)明方法所使用的染料中，除了花菁類染料，也可以是本領(lǐng)域熟知的其 它具有膜通透性的核染料，例如但不限于，Hoechst33342，只要所用的染料可
以將精子從非精子的顆粒碎片中區(qū)分開來。優(yōu)選花菁類染料，更優(yōu)選 TrMsgreen。
本發(fā)明方法所使用的染料中，除了菲啶類染料，也可以是本領(lǐng)域熟知的其
它的死細(xì)胞或死精子的核染料，例如但不限于，Hoechst33258，只要所用的染 料可以將精子從非精子的顆粒碎片中區(qū)分開來。優(yōu)選菲啶類染料，更優(yōu)選PI。
本發(fā)明還提供了一種復(fù)合染料的用途，所述的復(fù)合染料包括菲啶類染料和 花菁類染料。可以將該復(fù)合染料與精子混合、孵育，測定綠色精子在所有精子 中所占的比例，從而獲得精子密度計(jì)數(shù)及精子的活率。
所述的菲啶類染料選自PI、溴乙錠；所述的花菁類染料選自Transgreen。本發(fā)明也提供了一種染料PI的用途，就是將它與精子和Transgreen混合、 孵育，從而獲得精子密度計(jì)數(shù)及精子的活率。
本發(fā)明也提供了一種染料Transgreen的用途，就是將它與精子和PI混合、 孵育，從而獲得精子密度計(jì)數(shù)及精子的活率。
本發(fā)明提供一種試劑盒，在所述的試劑盒中含有(a)菲啶類染料和(b) 花菁類染料。所述的菲啶類染料選自PI、溴乙錠；所述的花菁類染料選自 Tr過nsgreen。
在所述的試劑盒中還可以含有進(jìn)行精子或細(xì)胞培養(yǎng)的緩沖液及說明書。 本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于
1、 本發(fā)明提供的方法簡便、快速且可動(dòng)態(tài)評(píng)價(jià)精子存活率；
2、 本發(fā)明提供的方法靈敏度高、快速方便及價(jià)格低廉；
3、 本發(fā)明提供的方法為精子密度及精子存活率的精確計(jì)算提供可能。
下面將結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于 說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建 議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和份數(shù)按重量計(jì)。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟 悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于 本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
實(shí)施例l 精子熒光染色
材料與方法研究對(duì)象
正常生育男性，精子密度"0xl0Vml， 3+1 級(jí)精子>50%, WBC<lxl06/ml， 禁欲3-5d后，手淫法留取精液于潔凈的玻璃器皿內(nèi)。精液液化后，通過上游法 優(yōu)化精子，并調(diào)整密度為60xl06/ml，總活率>90%。
試劑
碘化丙啶(PI)購自Sigma公司；
Transgreen熒光分子探針購自上海淦峰生物技術(shù)有限公司。 儀器
計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)(配有熒光裝置和恒溫裝置)，由安萊公司提供 的VideoTest Cytogenetics自動(dòng)精子圖像分析系統(tǒng)； C02培養(yǎng)箱，購自Heraeus。 方法
一、 精子運(yùn)動(dòng)功能分析
將處理好的精子懸液分成四組
a組，精子懸液-,
b組，精子懸液+ Transgreen (終濃度為100nM); c組，精子懸液+ PI (終濃度為24uM); d組，精子懸液+ Transgreen/PI 。
在37。C， 5%(202培養(yǎng)箱孵育，每隔30分鐘，各取10ul，應(yīng)用計(jì)算機(jī)輔助 精液分析系統(tǒng)分析精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)精子活動(dòng)率、曲線速度(VCL)、直線速度 (VSL)、平均路徑(VAP)、頭側(cè)擺幅度(ALH)。
二、 精子存活率比較
a組，精子懸液，培養(yǎng)60分鐘后加入PI;
b組，精子懸液+ Transgreen (終濃度為100nM)，培養(yǎng)60分鐘后加入PI; c組，精子懸液+ PI (終濃度為24uM) ， 60分鐘后加入Transgreen; d組，精子懸液+ Transgreen/PI，培養(yǎng)60分鐘。
計(jì)算a組200個(gè)精子中未染色精子所占的百分?jǐn)?shù)及b-c各組200個(gè)精子中 綠色精子所占的百分?jǐn)?shù)。
三、 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
采用STATA 8.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行Log-rank生存檢驗(yàn)及相關(guān)多因素分析， 比較各個(gè)實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組之間的運(yùn)動(dòng)參數(shù)和存活率差異。結(jié)果
一、 Transgreen染料和PI染料對(duì)精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)的影響
在0—120min內(nèi)，a， b， c， d四組精子在活率(見圖1)、曲線速度(VCL)、 直線速度(VSL)、平均路徑(VAP)、頭側(cè)擺幅度(ALH)的差異均無顯著性。
結(jié)果表明，Transgreen/PI復(fù)合染料在120分鐘內(nèi)，對(duì)精子各運(yùn)動(dòng)參數(shù)均 沒有顯著影響。
二、 Transgreen與PI加入時(shí)間先后對(duì)精子存活率統(tǒng)計(jì)的影響 Transgreen與PI染料不分先后，且加入時(shí)間相隔60分鐘，對(duì)精子存活率
的計(jì)數(shù)沒有影響。(見圖2)
結(jié)果表明，Transgreen和PI染料與精子，特別是與死精子DNA的結(jié)合始 終會(huì)達(dá)到一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡，已經(jīng)結(jié)合上Transgreen的死精子當(dāng)有PI加入后， 在很短的時(shí)間內(nèi)Transgreen染料仍然會(huì)被PI置換下來。
另一方面，Transgreen, PI以及Transgreen/PI復(fù)合染料在2個(gè)小時(shí)甚至 更長的時(shí)間內(nèi)，不影響精子的存活率。
討論
在精子培養(yǎng)懸液中，分別加入PI， Transgreen及Transgreen/PI混合染 料，培養(yǎng)120分鐘或更長時(shí)間，染料不影響精子的各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)；Transgreen/PI
復(fù)染后精子存活率與PI單染法的統(tǒng)計(jì)結(jié)果沒有差異。
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在120分鐘時(shí)間內(nèi)，Transgreen/PI復(fù)合染料不影響精子細(xì)胞 運(yùn)動(dòng)，另外由于Transgreen與DNA結(jié)合的親和力比PI低，因此即使Transgreen 預(yù)染60分鐘后的精液標(biāo)本，只要再與PI孵育5分鐘，死精子上的綠色熒光 (Transgreen)會(huì)被紅色的熒光(PI)代替，各組精子存活率的統(tǒng)計(jì)沒有差異。
因此Transgreen/PI復(fù)染，是一種靈敏度高、快速方便又價(jià)廉的精子存活 率檢測新方法，適合在熒光顯微鏡、CASA系統(tǒng)和流式細(xì)胞儀上作動(dòng)態(tài)及靜態(tài)分 析，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而己，并非用以限定本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù) 內(nèi)容范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)內(nèi)容是廣義地定義于申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍中，任 何他人完成的技術(shù)實(shí)體或方法，若是與申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍所定義的完全相 同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋于該權(quán)利要求范圍之中。
權(quán)利要求
1.一種精子熒光染色測定方法，其特征在于，它包括步驟(1)將精子、菲啶類染料和花菁類染料混合，得到混合溶液，所述的菲啶類染料選自碘化丙啶、溴乙錠；花菁類染料選自Transgreen；(2)測定混合溶液中精子的熒光值。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，它包括步驟(1) 將精子、碘化丙啶和Transgreen混合，得到混合溶液；(2) 計(jì)數(shù)混合溶液中綠色精子和/或紅色精子的個(gè)數(shù)，其中綠色精子是活精 子，紅色精子是死精子。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(1)為將精子和碘 化丙啶混合3 — 15分鐘后，加入Transgreen,得到混合溶液。
4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，精子和碘化丙啶混合的溶液濃度 為12 — 48uM。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(1)為將精子和 Transgreen混合3 — 15分鐘后，加入碘化丙啶，得到混合溶液。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，精子和Transgreen混合的溶液濃 度為50 — 200nM。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟(1)為將精子、碘 化丙啶和Transgreen —起加入，得到混合溶液。
8. —種菲啶類染料和花菁類染料形成的復(fù)合染料的用途，其特征在于，所述 的復(fù)合染料用于精子存活率熒光染色測定。
9. 如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的菲啶類染料選自碘化丙啶、 溴乙錠；花菁類染料選自Transgreen。
10. —種試劑盒，其特征在于，它含有(a) 菲啶類染料，所述的菲啶類染料選自碘化丙啶、溴乙錠；和(b) 花菁類染料，所述的花菁類染料選自Transgreen。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種精子熒光染色方法，它是將精子與PI，Transgreen及Transgreen/PI混合，置37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱共孵育。運(yùn)用計(jì)算機(jī)輔助精子精液質(zhì)量分析系統(tǒng)，分析熒光染料加入后精子各運(yùn)動(dòng)參數(shù)的改變以及Transgreen/PI復(fù)染作為計(jì)算精子存活率是可行的。
文檔編號(hào)G01N33/48GK101308131SQ200710040709
公開日2008年11月19日 申請(qǐng)日期2007年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月16日
發(fā)明者施惠娟, 健 王, 瑤 袁, 趙洪鑫 申請(qǐng)人:上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所