專(zhuān)利名稱(chēng)：用于診斷感染的熒光化合物、其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物組合物，其用于臨床診斷傳染病(優(yōu)選眼科疾病)、以及用于鑒定 微生物。
背景技術(shù)：
對(duì)于某些危害眼睛之疾病的預(yù)防及正確治療要求對(duì)可引發(fā)該器官感染的各種微 生物進(jìn)行鑒定。如不盡早進(jìn)行診斷和治療，很多此類(lèi)眼部感染會(huì)對(duì)患者的視力造成嚴(yán)重的 影響。因此在某些情況下有必要對(duì)直接感染該器官之病原體進(jìn)行檢測(cè)，從眼睛提取易感染 組織的代表性小樣本組織碎片(活檢)或?qū)εc所述組織接觸之生理液(在此情況下即眼 淚)進(jìn)行分析。對(duì)樣品中微生物進(jìn)行檢測(cè)的常用方法經(jīng)常是基于獲得能增加可能病原體數(shù) 量的培養(yǎng)物，以輔助隨后的鑒定。培養(yǎng)階段需要1到4天的長(zhǎng)時(shí)間，此期間內(nèi)不可使用專(zhuān)門(mén) 針對(duì)感染的藥品對(duì)患者進(jìn)行治療，以免漏掉造成感染的病原體。然而此段較長(zhǎng)的等待培養(yǎng) 時(shí)間會(huì)對(duì)受感染器官產(chǎn)生極為嚴(yán)重的不良后果，因此應(yīng)該盡可能使用能縮短正確診斷所需 時(shí)間的替代檢測(cè)方法。另一方面，為預(yù)防此類(lèi)傳染病，將那些與眼睛長(zhǎng)時(shí)間接觸的物品(如隱形眼鏡和 相應(yīng)清洗液)在高度清潔的條件下進(jìn)行保存和使用以確保無(wú)菌是非常重要的。與上述方法 類(lèi)似，要獲得這些眼用物品本身或其保存環(huán)境是否被污染的可靠信息，通常需要借助費(fèi)力 的微生物培養(yǎng)方法。在此情況下，這種以細(xì)胞培養(yǎng)為基礎(chǔ)的現(xiàn)有診斷技術(shù)的復(fù)雜性限制了 其應(yīng)用頻率和應(yīng)用范圍，從而導(dǎo)致使用者的感染風(fēng)險(xiǎn)增加。此外，基于使用熒光標(biāo)記化合物直接添加到懷疑存在微生物之介質(zhì)中，已經(jīng)開(kāi)發(fā) 了熒光型檢測(cè)傳染性微生物的替代技術(shù)。如果將熒光標(biāo)記化合物導(dǎo)入傳染性微生物中，有 可能通過(guò)使用各種熒光顯示設(shè)備(如顯微鏡和流式細(xì)胞儀)檢測(cè)出感染微生物的存在及 其形態(tài)(Kawamoto, F. , Rapiddiagnosis of malaria by fluorescence microscopy with light microscopeand interference filter. Lancet 1991，337，200—202)。由于這些設(shè)備 可以識(shí)別微弱的熒光強(qiáng)度，因此原則上可以用很少的細(xì)胞進(jìn)行正確的診斷，這就在一定程 度上縮短了診斷時(shí)間。然而，因熒光標(biāo)記物缺乏特異性，直接使用熒光標(biāo)記物檢測(cè)眼部感染 的方法受到了很大的限制，這是由于傳統(tǒng)熒光標(biāo)記與眾多眼科致病微生物的親和力和其與 健康眼之細(xì)胞和組織的親和力非常相似，使得用熒光標(biāo)記對(duì)相應(yīng)病原體進(jìn)行區(qū)分出現(xiàn)了困 難。本發(fā)明目的在于使用一種簡(jiǎn)單且經(jīng)濟(jì)的方法來(lái)提高熒光標(biāo)記物對(duì)感染機(jī)體的親 和力。這種新方法是通過(guò)將熒光標(biāo)記物附著在一類(lèi)具有相對(duì)簡(jiǎn)單分子結(jié)構(gòu)的化合物上來(lái)實(shí) 現(xiàn)的，這些化合物對(duì)病原體表現(xiàn)出遠(yuǎn)高于它對(duì)健康眼細(xì)胞的親和力。這些化合物在本發(fā)明 中用于將熒光標(biāo)記選擇性導(dǎo)入病原體，它們屬于烷基磷脂類(lèi)，其中包括例如米替福新(MT)、 依地福新(ET)和伊莫福新(IM) (Croft, S. L ；Engel, J.，Miltefosine-discovery ofthe antileishmanial activity of phospholipid derivatives. Trans R Soc TropMed Hyg 2006,100 Suppl 1，S4_8)。
米替福新(MT)現(xiàn)用于乳腺癌皮膚轉(zhuǎn)移瘤的治療，在市場(chǎng)上以商品名MILTEX 銷(xiāo)售。此外因MT表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗寄生蟲(chóng)活性，在哥倫比亞、印度和德國(guó)其以商品名 IMPAVIDOaentaris股份有限公司)而被應(yīng)用于人利什曼病的治療(Soto，J. ；Soto, P.， Miltefosine :oral treatment of leishmaniasis. Expert Rev Anti Infect Ther 2006, 4，(2)，177-85)。最近MT開(kāi)始被用于犬利什曼病的治療，商品名為MILTEFORAN(Virbac)。 此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MT對(duì)其他原生動(dòng)物也有細(xì)胞毒活性，如毛滴蟲(chóng)CTrichomonas) (BIaha, C ；Duchene, M. ；Aspock, H. ；ffalochnik, J. , Invitro activity of hexadecylphospho choline (miltefosine)againstmetronidazole-resistant and—susceptible strains of Trichomonas vaginalis. J Antimicrob Chemother 2006,57, (2),273-8)>
個(gè)生 H^ E (Entamoeba histolytica) (Seifert, K. ；Duchene, Μ. ；Wernsdorfer, W. H.； Kollaritsch, H. ；Scheiner, 0. ；ffiedermann, G. ；Hottkowitz, T. ；Eibl, H. , Effects of miltefosine and other alkylphosphocholines on human intestinalparasite Entamoeba histolytica. Antimicrob Agents Chemother 2001,45, (5),1505-10)、 自由生活的阿米巴原蟲(chóng)(如棘阿米巴(Acanthamoeba sp.)或納氏蟲(chóng)(Naegleria sp.)) (Schuster, F. L ；Guglielmo, B. J. ；Visvesvara, G. S. , In-vitro activity of miltefosine and voriconazole on clinical isolates offree-living amebas Balamuthia mandrillaris, Acanthamoeba spp. , andNaegleria fowleri. J Eukaryot Microbiol 2006,53, (2),121-6 ；ffalochnik, J. ；Duchene, M. ；Seifert, K. ；Obwaller, Α. ；Hottkowitz, T. ；ffiedermann, G. ；Eibl, H. ；Aspock, H. , Cytotoxic activities of alkylphosphocholines againstclinical isolates of Acanthamoeba spp. Antimicrob Agents Chemother 2002，46，(3)，695-701)，對(duì)人類(lèi)以及其他人類(lèi)病原體有致病作用，包 括真菌、酵母菌(Obando，D. ；Widmer, F. ；Wright, L. C ；Sorrel 1, Τ. C Jolliffe, K. Α.， Synthesis, antifungal and antimicrobial activity of alkylphospholipids. Bioorg Med Chem 2007,15, (15),5158-65 ；Widmer, F. ；Wright, L. C ；Obando, D. ；Handke, R.； Ganendren, R. ；Ellis, D. H. ；Sorrell, Τ. C. , Hexadecylphosphocholine (miltefosine) has broad-spectrum fungicidalactivity and is efficacious in a mouse model of cryptococcosis. AntimicrobAgents Chemother 2006,50, (2), 414—21)禾口 月市炎鏈球菌 (Streptococcuspneumoniae)(Llull, D. , Rivas, L. , Garcia, Ε. In vitro bactericidal activityof the antiprotozoal drug miltefosine against Streptococcus pneumoniaeand other pathogenic streptococci. Antimicrob Agents Chemother. 2007, 51， (5) :1844-8)。對(duì)于MT在上述生物體內(nèi)發(fā)揮其細(xì)胞毒作用的詳細(xì)作用機(jī)制，我們還知之甚 少。針對(duì)一些特定寄生蟲(chóng)的最新研究表明，這種構(gòu)造可能是多靶標(biāo)類(lèi)型的，因?yàn)镸T在上 述寄生蟲(chóng)的細(xì)胞內(nèi)濃度很高，在利什曼蟲(chóng)中達(dá)到了毫摩爾/升范圍的值(Luque-Ortega， J. R. ；Rivas, L.，Miltefosine(hexadecylphosphocholine)inhibits cytochrome c oxidase in Leishmaniadonovani promastigotes. Antimicrob Agents Chemother 2007， 51，(4),1327-32 ；Saugar, J. M. ；Delgado, J. ；Hornillos，V. ；Luque-Ortega，J. R.； Amat-Guerri, F. ； ActinR9 Α. U. ；Rivas, L，Synthesis and BiologicalEvaluation of Fluorescent Leishmanicidal Analogues οfHexadecylphosphocholine(Miltefosine)as Probes of AntiparasiteMechanisms. J Med Chem 2007，50， (24)，5994—6003)。 @ 一假設(shè)還得到了利什曼原蟲(chóng)中出現(xiàn)MT耐藥菌株現(xiàn)象的支持，因?yàn)橹挥性谒幬锾禺愋赞D(zhuǎn)運(yùn) 到寄生蟲(chóng)體內(nèi)存在功能缺陷時(shí)才會(huì)產(chǎn)生上述耐藥菌株Geifert，K. ；Perez-Victoria, F. J. ；Stettler, Μ. ；Sanchez-Canete, Μ. P. ；Castanys，S. ；Gamarrο, F. ；Croft，S. L, Inactivation of the miltefosine transporter，LdMT，causes miltefosine resistance that is conferred to the amastigotestage of Leishmania donovani and persists in vivo.Int J Antimicrob Agents2007，30，(3)，229-35 ；Perez-Victoria, F. J.； Sanchez-Canete, Μ. P. ；Seifert，K. ；Croft, S. L ；Sundar, S. ；Castanys, S. ；Gamarrο, F.， Mechanisms ofexperimental resistance of Leishmania to miltefosine !Implications forelinical use. Drug Resist Updat 2006，9，(1-2)，26-39 ；Perez-Victoria, F. J.； Sanchez-Canete, Μ. P. ；Castanys, S. ；Gamarrο, F.，Phospholipidtranslocation and miltefosine potency require both L. donovanimiltefosine transporter and the new protein LdRos3 in Leishmaniaparasites.J Biol Chem 2006，281，(33)， 23766-75 ；Perez-Victoria, F. J. ；Gamarrο, F. ；Ouellette，Μ. ；Castanys, S.，F(xiàn)unctional cloning of themiltefosine transporter. A novel P-type phospholipid translocase fromLeishmania involved in drug resistance.J Biol Chem 2003，278，(50)， 49965-71)。這些特異性運(yùn)載蛋白屬于氨基磷脂類(lèi)轉(zhuǎn)位酶家族，但是這種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的準(zhǔn)確 鑒定僅僅在以下生物中實(shí)現(xiàn)杜氏利什曼原蟲(chóng)(Leishmania donovmi)(鑒定為L(zhǎng)dMT3) (Perez-Victoria, F. J. ；Gamarro, F. ；Ouellette，Μ. ；Castanys, S.，F(xiàn)unctional cloning of the miltefosinetransporter. A novel P-type phospholipid translocase from Leishmaniainvolved in drugresistance. J Biol Chem 2003，278，(50)，49965-71)以 ^ Sl S # # (Saccharomyces cerevisiae) ( ^ ^ ^ Lem3) (Hanson, P. K. ；Malone, L.； Birchmore, J. L. ；Nichols，J. W.，Lem3p is essential for the uptake andpotency of aIkylphosphocholine drugs，edelfosine and miltefosine.J BiolChem 2003，278， (38)，36041-50)。在利什曼原蟲(chóng)中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變解釋了利什曼蟲(chóng)中米替福新和依地福新 抗藥性的出現(xiàn)，并隨之產(chǎn)生對(duì)放射性米替福新導(dǎo)入寄生蟲(chóng)中的抑制；此外在喪失Lem3功 能的釀酒酵母菌中出現(xiàn)了對(duì)導(dǎo)入熒光磷脂NBD-PC的抑制，這與依地福新抗藥性表型有關(guān)， 是由于藥物導(dǎo)入缺陷造成的，盡管這種作用尚未經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)試(Hanson，P. K. ；Malone, L； Birchmore, J. L ；Nichols, J. W. , Lem3p is essential for theuptake and potency of alkylphosphocholine drugs,edelfosine andmiltefosine. J Biol Chem 2003,278, (38), 36041-50)。從與本發(fā)明相關(guān)的前期研究得出的結(jié)論可以總結(jié)如下i)MT和其他類(lèi)似的烷基 磷脂可選擇性進(jìn)入低等真核生物和轉(zhuǎn)化細(xì)胞中；ii)這些藥物的致死作用與大量藥物進(jìn)入 細(xì)胞內(nèi)有關(guān)；iii)MT抗藥性機(jī)制已經(jīng)在多種類(lèi)型寄生蟲(chóng)中鑒定，這是由于藥物在這些寄生 蟲(chóng)體內(nèi)積累的缺陷而造成的。近期印度和尼泊爾開(kāi)始在內(nèi)臟感染利什曼病的患者身上大量使用MT，尤其是 針對(duì)那些已對(duì)含銻藥物治療產(chǎn)生耐藥性的患者(Sundar, S. ；Chatterjee, M.，Visceral leishmaniasis-current therapeutic modalities. Indian J Med Res 2006,123, (3),345-52)；一些南美洲國(guó)家將該方案應(yīng)用于犬利什曼病的治療(Soto, J. ；Soto, P.，Miltefosine :oral treatment of leishmaniasis. Expert Rev Anti Infect Ther 2006, 4，(2)，177-85)。由于醫(yī)院在這種治療上很難正確控制藥量，可以預(yù)計(jì)將很快出現(xiàn)對(duì)MT 產(chǎn)生耐藥性的寄生蟲(chóng)。動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)表明，耐藥性寄生蟲(chóng)(由于MT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺陷)與 對(duì)藥物敏感的寄生蟲(chóng)有相同的毒力(Seifert, K. ；Perez-Victoria, F. J. ；Stettler, Μ.； Sanchez-Canete, Μ. P. ；Castanys, S. ；Gamarro, F. ；Croft, S. L. , Inactivation of the miltefosine transporter, LdMT, causes miltefosineresistance that is conferred to the amastigote stage of Leishmaniadonovani and persists in vivo. Int J Antimicrob Agents 2007,30, (3), 229-35) 因此，獲得快速可控的試劑和方法(正如本發(fā) 明中提出的)能對(duì)耐藥性菌株的出現(xiàn)做到早期檢測(cè)和應(yīng)對(duì)。另一方面，目前針對(duì)眼睛中棘阿米巴原蟲(chóng)(Acanthamoeba)(在有不良衛(wèi)生習(xí)慣的 隱形眼鏡使用者中有特別高發(fā)病率的阿米巴感染)的早期診斷，是在先排除了皰疹和真菌 感染的可能性之后進(jìn)行的，上述診斷過(guò)程的延誤隨后有時(shí)可能對(duì)視力造成不可逆轉(zhuǎn)的損 傷(Hammersmith, K. Μ. , Diagnosis and management of Acanthamoeba keratitis. Curr OpinOphthalmol 2006，17， (4)，327-31)?；谕瑯拥脑?，還可將本發(fā)明所述化合物應(yīng)用到對(duì)隱形眼鏡護(hù)理液、清洗液以 及移植角膜之保存介質(zhì)的質(zhì)量檢測(cè)上。最近，由于隱形眼鏡護(hù)理液被鐮刀菌污染造成的 事故給一大批患者造成了嚴(yán)重后果，并使生產(chǎn)商蒙受了巨大經(jīng)濟(jì)損失(Chang，D. C5Grant, G. B. ；0' Donnell, K. ；Wannemuehler, K. A. ；Noble-Wang, J. ；Rao, C. Y. ；Jacobson, L M.； Crowell, C. S. ；Sneed, R. S. ；Lewis, F. Μ. ；Schaffzin，J. K. ；Kainer, Μ. Α. ；Genese，C. Α.； Alfonso，Ε. C ；Jones，D. B. ；Srinivasan，Α. ；Fridkin，S. K. ；Park，B. J.，Multistate outbreak of Fusarium keratitis associated with useof a contact lens solution. JAMA 2006,296, (8) ,953-63 ；Centers forDisease Control and Prevent ion (CDC)， Update :Fusariumkeratitis-United States,2005-2006. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2006，55，(20)，563-4)。自由生活的原生動(dòng)物群體組成了可用來(lái)檢測(cè)水質(zhì)和環(huán)境污染的生物 (Martin-Cereceda, Μ. ；Perez-Uz, B. ；Serrano, S. ；Guinea, Α. , Dynamicsof protozoan and metazoan communities in a full scale wastewatertreatmentplant by rotating biological contactors. Microbiol Res 2001,156, (3)，225-38)，因此，可利用本發(fā)明的 化合物，通過(guò)熒光類(lèi)似物的積累和導(dǎo)入，從而對(duì)這些生物進(jìn)行檢測(cè)和顯示。先前的一些研究中已經(jīng)合成和使用過(guò)烷基磷脂的熒光類(lèi)似物1.-先前已制備相似化合物(依地福新)的類(lèi)似物，其用苯基四烯 (feniltetraeno)基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記，并注意到該標(biāo)記基本上不改變藥物的生物活性 (Quesada, E. ；Delgado, J. ；Gajate, C ；Mollinedo, F. ； Acufia, Α. U. ；Amat-Guerri, F., Fluorescent phenylpolyene analogues of the etherphospholipid edelfosine for the selective labeling of cancer cells. J MedChem 2004,47, (22),5333-5)。2.-已經(jīng)制備了用諸如苯基四烯或苯基三烯炔(feniltrienino)基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記的 MT類(lèi)似物，其保持了原藥的抗寄生蟲(chóng)活性，并且還能特異性進(jìn)入對(duì)藥物敏感的利什曼原蟲(chóng) 寄生蟲(chóng)株中，但不能進(jìn)入有耐藥性的寄生蟲(chóng)株中(Saugar，J. Μ. ；Delgado, J. ；Hornillos, V. ；Luque-Ortega, J. R. ；Amat-Guerri, F. ； Acufia, Α. U. ；Rivas, L, Synthesis andBiologicalEvaluation of Fluorescent Leishmanicidal Analogues ofHexadecylphosp hocholine(Miltefosine)as Probes of AntiparasiteMechanisms. J Med Chem 2007,50, (24),5994-6003)。3.-已將戊烷脒DB-99的熒光類(lèi)似物用于非洲錐蟲(chóng)病中對(duì)含砷藥物治療有耐藥性 ；其月中(Stewart, Μ. L ；Krishna, S. ；Burchmore, R. J. ；Brun, R. ；de Koning, H. P. ；Boykin, D. W. ；Tidwell, R. R. ；Hall, J. Ε. ；Barrett, Μ. P. , Detection of arsenical drug resistance inTrypanosoma brucei with a simple fluorescence test. Lancet 2005,366, (9484)，486-7)。在布氏錐蟲(chóng)中(引起上述感染的微生物)，戊烷脒和DB99通過(guò) 與含砷藥物相同的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入到寄生蟲(chóng)體內(nèi)。因此，這種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的缺失和功能障礙會(huì) 抑制戊烷脒和DB-99的內(nèi)化，因此也抑制其熒光標(biāo)記物的內(nèi)化，并且出現(xiàn)了含砷藥物耐藥 性的表型。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于區(qū)分性鑒定微生物的熒光化合物(后面將其稱(chēng)為本 發(fā)明的化合物)，它包括烷基磷脂類(lèi)似物和具有高度光穩(wěn)定性并發(fā)射可見(jiàn)光譜區(qū)波長(zhǎng)之光 的熒光基團(tuán)。本發(fā)明中所用的術(shù)語(yǔ)“烷基磷脂類(lèi)似物”是指通過(guò)合成獲得的一種化合物，其結(jié)構(gòu) 與烷基磷脂的結(jié)構(gòu)相似。如本發(fā)明所用，術(shù)語(yǔ)“烷基磷脂”是指結(jié)構(gòu)中包含與親水性部分 相綴合之親脂性部分的化合物，其中所述親脂性部分由碳和氫原子之線狀或環(huán)狀組合構(gòu)成 (烷基部分)，所述親水性部分由酯化或游離的磷酸基構(gòu)成(磷脂)。例如但不限制本發(fā)明 的范圍，所述烷基磷脂包括十六烷基磷酸膽堿(米替福新，MT)，1-0-十八烷基-2-0-甲 基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(依地福新，EF)和I-S-十六烷基-2-甲氧基甲基-消旋-甘 油-3-磷酸膽堿(伊莫福新，IM)。烷基磷脂類(lèi)似物的實(shí)例是示例性的，不限制本發(fā)明的范 圍，全-(E)-13-苯基十三烷-6,8,10,12-四烯基磷酸膽堿和全_(E)-13-苯基十三烷-8， 10，12-三烯-6-炔基磷酸膽堿。本發(fā)明中所用的術(shù)語(yǔ)“微生物”是指任何的原生動(dòng)物、阿米巴原蟲(chóng)、真菌、酵母 和細(xì)菌，例如但不限制本發(fā)明的范圍，其屬于下組利什曼原蟲(chóng)(Leishmania sp)、布氏錐 蟲(chóng)(Trypanosoma brucei)、克氏||1 蟲(chóng)(Trypanosoma cruzi)、毛蟲(chóng)(Trichomonas sp·)、 溶組織性?xún)?nèi)阿米巴(Entamoeba histolytica)、棘阿米巴(Acanthamoeba sp.)、納氏蟲(chóng) (Naegleria sp.)、月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、鍵刀菌(Fusarium sp.)、梨 ^HIMii (Tetrahymena pyriformis)禾口 BEilEimuthiEi J^jil0本發(fā)明中所用的術(shù)語(yǔ)“熒光基團(tuán)”，是指發(fā)射可見(jiàn)光譜區(qū)波長(zhǎng)之光并具有高 度光穩(wěn)定性的熒光基團(tuán)，例如但不限制本發(fā)明的范圍，其中包括硼二吡咯亞甲基類(lèi) (borodipirrometenos)、口占噸類(lèi)(xantenos)、羅丹明類(lèi)、花青類(lèi)(cianinas)、沙星類(lèi) (oxacinas)、口卜啉類(lèi)、香豆素類(lèi)禾口多環(huán)烴類(lèi)(hidrocarburos policiclicos),它們可以具有 或不具有取代基。本發(fā)明的一個(gè)更具體方面涉及本發(fā)明的化合物，其中所述烷基磷脂類(lèi)似物是米替 福新(MT)、依地福新(EF)或伊莫福新(IM)。
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本發(fā)明的一個(gè)更具體方面涉及本發(fā)明的化合物，其中所述烷基磷脂類(lèi)似物是米替 福新(MT)、依地福新(EF)或伊莫福新(IM)的類(lèi)似物。本發(fā)明的一個(gè)具體方面涉及本發(fā)明的化合物，其中所述熒光基團(tuán)是取代或未取代 的硼二吡咯亞甲基類(lèi)(BDP)。本發(fā)明的一個(gè)具體方面涉及本發(fā)明的化合物，其中所述烷基磷脂衍生物是米替福 新，并且所述熒光基團(tuán)是取代或未取代的BDP。本發(fā)明的一個(gè)更具體方面涉及本發(fā)明的化合物，其是BDP-MT或肚-BDP-MT。本發(fā)明的一個(gè)具體方面涉及獲得本發(fā)明化合物的方法，其包括以下步驟i)由二乙?；?dicetoalcohol)和乙酰乙酸乙酯獲得相應(yīng)的取代α-H-吡咯，ii)使所述α -H-吡咯與適當(dāng)?shù)摩?-甲酰吡咯縮合，iii)使由此形成的二吡咯亞甲基化合物與三氟化硼乙醚反應(yīng)，iv)引入磷酸膽堿基團(tuán)。本發(fā)明的另一個(gè)具體方面涉及本發(fā)明化合物在制備用于微生物鑒定方法的藥物 組合物的用途。本發(fā)明的另一個(gè)具體方面涉及診斷性藥物組合物(以下稱(chēng)為本發(fā)明的診斷性藥 物組合物)，其包含本發(fā)明的化合物，例如化合物BDP-MT或肚-BDP-MT。最后，本發(fā)明的一個(gè)具體方面是本發(fā)明的診斷性藥物組合物的用途，其中本發(fā)明 的藥物組合物用于微生物鑒定方法中。本發(fā)明的另一個(gè)更具體方面涉及本發(fā)明的診斷性藥物組合物用于生物樣品的體 外診斷方法中的用途，其中所述生物樣品來(lái)自帶有傳染性疾病的人或獸醫(yī)學(xué)個(gè)體，例如但 不限制本發(fā)明的范圍，所述傳染性疾病屬于下組角膜炎、利什曼病、非洲和美洲錐蟲(chóng)病、肺 炎鏈球菌肺炎、阿米巴病、滴蟲(chóng)病和霉菌病。本發(fā)明的另一個(gè)更具體的實(shí)施方案涉及本發(fā)明藥物組合物的用途，其中所述 傳染性疾病是由微生物引起，例如但不限制本發(fā)明的范圍，所述微生物屬于下組利什 曼原蟲(chóng)(Leishmania sp)、布氏維蟲(chóng)(Trypanosomabrucei)、克氏維蟲(chóng)(Trypanosoma cruzi)、^itil& (Trichomonas sp.) ,Μ^ ^ E (Entamoeba histolytica) Λ 阿米巴(Acanthamoeba sp.)、納氏蟲(chóng)(Naegleria sp.)、月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、,廉刀菌(Fusarium sp.)、梨形四膜蟲(chóng)(Tetrahymena pyriformis)禾口 Balamuthia本發(fā)明的另一個(gè)更具體實(shí)施方案涉及本發(fā)明診斷性藥物組合物的用途，其用于源 自眼睛的生物樣品的診斷方法中，例如所述樣品由角膜刮削獲得。本發(fā)明的另一個(gè)更具體實(shí)施方案涉及本發(fā)明診斷性藥物組合物的用途，其用于鑒 定既非人也非動(dòng)物之樣品中微生物的方法中，例如在水、人工眼睛、隱形眼鏡、隱形眼鏡護(hù) 理液或角膜保存介質(zhì)中。發(fā)明詳述本發(fā)明的基礎(chǔ)在于，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，生物活性的烷基磷脂類(lèi)似物(例如化合物 BDP-MT或肚-BDP-MT)在其結(jié)構(gòu)中含有發(fā)射可見(jiàn)光譜區(qū)波長(zhǎng)為400-700nm之光的高度光穩(wěn) 定性的焚光基團(tuán)(Slavik, J. , FluorescentProbes in Cellular and Molecular Biology led. ；CRC Press =Boca Raton, FL, 2004 ；ρ 320)，它們很容易被導(dǎo)入微生物中，并且這種導(dǎo)入可通過(guò)常規(guī)熒光顯微鏡來(lái)檢測(cè)。因此，圖像診斷專(zhuān)家可以很容易地識(shí)別出是否存在能夠 導(dǎo)入上述化合物的微生物，如真菌、原生動(dòng)物、甚至一些細(xì)菌如肺炎鏈球菌等。同時(shí)，一旦鑒 定其物種，所述專(zhuān)家就能夠推斷出對(duì)烷基磷脂治療的潛在耐藥性，這種耐藥性與化合物導(dǎo) 入缺陷以及對(duì)烷基磷脂細(xì)胞毒性之抗性的表型有直接關(guān)系。因此可以將熒光類(lèi)似物加入到懷疑有微生物存在的培養(yǎng)基或組織中，以檢測(cè)是否 存在微生物。例如，將含有所述化合物的藥物組合物直接施加到角膜上。如果確實(shí)如此，所 述熒光類(lèi)似物會(huì)迅速標(biāo)記出這些微生物，以便用常規(guī)顯微鏡觀察對(duì)微生物進(jìn)行視覺(jué)鑒定。 此外，如果所述生物含有原始藥物MT的特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，將會(huì)在微生物內(nèi)觀察到迅速出現(xiàn) 熒光。相反，如果所述生物對(duì)MT有耐藥性，在相同條件下則不能在寄生蟲(chóng)體內(nèi)觀察到熒光 的出現(xiàn)。用這種方式即能獲得可迅速簡(jiǎn)單地診斷這些微生物是否存在和/或是否存在對(duì)原 藥MT之耐藥性的方法。更具體來(lái)說(shuō)，例如作為本發(fā)明的具體實(shí)例，已經(jīng)合成并生物學(xué)測(cè)試了一系列的MT 熒光類(lèi)似物，其特征在于其將硼二吡咯亞甲基熒光基團(tuán)(BDP)引入了所述化合物的脂肪鏈 中(見(jiàn)實(shí)施例)。當(dāng)將上述類(lèi)似物添加到存在棘阿米巴營(yíng)養(yǎng)體和真菌菌絲的生理介質(zhì)中時(shí)， 所述類(lèi)似物將會(huì)迅速被導(dǎo)入上述兩種微生物體內(nèi)，使其恰當(dāng)顯現(xiàn)，以便隨后根據(jù)其形態(tài)特 征進(jìn)行有效的個(gè)體鑒定。該方法將有助于對(duì)眼中微生物進(jìn)行區(qū)分性診斷，因?yàn)橛锌赡軐⑺?述化合物以滴眼液形式施加到眼睛以直接進(jìn)行觀察。此外，上述方法還可用于診斷生物組 織或生理液樣品(如角膜碎屑)中是否存在微生物，或者用于檢驗(yàn)移植角膜保存液體或隱 形眼鏡清潔護(hù)理液。下面提到的是這些化合物的可能應(yīng)用，基于迄今為止已經(jīng)實(shí)施并在現(xiàn)有技術(shù)中總 結(jié)的研究1.-快速可靠地診斷視覺(jué)疾病，如由真菌或阿米巴(棘阿米巴)感染引起的角膜 炎。2.-快速可靠地診斷人工眼睛(隱形眼鏡等)、隱形眼鏡護(hù)理液或角膜保存介質(zhì)是 否被污染(首先要檢測(cè)上述介質(zhì)中是否存在病原微生物)。3.-快速診斷患者或動(dòng)物(狗)是否感染了抗寄生蟲(chóng)藥米替福新的耐藥性利什曼 菌株，檢測(cè)來(lái)自上述病患的生理液體(包括外周血)、組織活檢和樣品中是否存在有耐藥性 的寄生蟲(chóng)。4.-快速診斷環(huán)境衛(wèi)生程度，對(duì)與環(huán)境相關(guān)的水體系中的自由生活原生動(dòng)物進(jìn)行鑒定。5.-基于這些熒光類(lèi)似物在不同器官和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組織中的區(qū)分性鑒定，使用生物 成像技術(shù)，在細(xì)胞研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，對(duì)米替福新以及類(lèi)似烷基磷脂的藥理學(xué)和生物學(xué)性 質(zhì)，進(jìn)行宏觀和分子水平的研究。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于區(qū)分性鑒定微生物的熒光化合物(隨后將稱(chēng)為 本發(fā)明的化合物)，它包括烷基磷脂類(lèi)似物物和具有高度光穩(wěn)定性并發(fā)射可見(jiàn)光譜波長(zhǎng)區(qū) 之光的熒光基團(tuán)。本發(fā)明中所用的術(shù)語(yǔ)“烷基磷脂類(lèi)似物”是指通過(guò)合成獲得的一種化合物，其結(jié)構(gòu) 與烷基磷脂的結(jié)構(gòu)相似。如本發(fā)明所用，術(shù)語(yǔ)“烷基磷脂”是指結(jié)構(gòu)中包含與親水性部分 相綴合之親脂性部分的化合物，其中所述親脂性部分由碳和氫原子之線狀或環(huán)狀組合構(gòu)成(烷基部分)，所述親水性部分由酯化或游離的磷酸基構(gòu)成(磷脂)。例如但不限制本發(fā)明 的范圍，所述烷基磷脂包括十六烷基磷酸膽堿(米替福新，MT)，1-0-十八烷基-2-0-甲 基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(依地福新，EF)和I-S-十六烷基-2-甲氧基甲基-消旋-甘 油-3-磷酸膽堿(伊莫福新，IM)。烷基磷脂類(lèi)似物的實(shí)例是示例性的，不限制本發(fā)明的范 圍，全-(E)-13-苯基十三烷-6,8,10，12-四烯基磷酸膽堿和全_(E)-13-苯基十三烷-8， 10，12-三烯-6-炔基磷酸膽堿。本發(fā)明中所用的術(shù)語(yǔ)“微生物”是指任何的原生動(dòng)物、阿米巴原蟲(chóng)、真菌、酵母 和細(xì)菌，例如但不限制本發(fā)明的范圍，其屬于下組利什曼原蟲(chóng)(Leishmania sp)、布氏錐 蟲(chóng)(Trypanosoma brucei)、克氏||1 蟲(chóng)(Trypanosoma cruzi)、毛蟲(chóng)(Trichomonas sp·)、 溶組織性?xún)?nèi)阿米巴(Entamoeba histolytica)、棘阿米巴(Acanthamoeba sp.)、納氏蟲(chóng) (Naegleria sp.)、月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、鍵刀菌(Fusarium sp.)、梨 ^HIMii (Tetrahymena pyriformis)禾口 BEilEimuthiEi J^jil0本發(fā)明中所用的術(shù)語(yǔ)“熒光基團(tuán)”，是指發(fā)射可見(jiàn)光譜區(qū)波長(zhǎng)之光并具有高 度光穩(wěn)定性的熒光基團(tuán)，例如但不限制本發(fā)明的范圍，其中包括硼二吡咯亞甲基類(lèi) (borodipirrometenos)、口占噸類(lèi)(xantenos)、羅丹明類(lèi)、花青類(lèi)(cianinas)、沙星類(lèi) (oxacinas)、口卜啉類(lèi)、香豆素類(lèi)禾口多環(huán)烴類(lèi)(hidrocarburos policiclicos),它們可以具有 或不具有取代基。本發(fā)明的一個(gè)更具體方面涉及本發(fā)明的化合物，其中所述烷基磷脂類(lèi)似物是米替 福新(MT)、依地福新(EF)或伊莫福新(IM)。本發(fā)明的一個(gè)更具體方面涉及本發(fā)明的化合物，其中所述烷基磷脂類(lèi)似物是米替 福新(MT)、依地福新(EF)或伊莫福新(IM)的類(lèi)似物。本發(fā)明的一個(gè)具體方面涉及本發(fā)明的化合物，其中所述熒光基團(tuán)是取代或未取代 的硼二吡咯亞甲基類(lèi)(BDP)。本發(fā)明的一個(gè)具體方面涉及本發(fā)明的化合物，其中所述烷基磷脂衍生物是米替福 新，并且所述熒光基團(tuán)是取代或未取代的BDP。本發(fā)明的一個(gè)更具體方面涉及本發(fā)明的化合物，其是BDP-MT或肚-BDP-MT。本發(fā)明的一個(gè)具體方面涉及獲得本發(fā)明化合物的方法，其包括以下步驟i)由二乙酰基醇和乙酰乙酸乙酯獲得相應(yīng)的取代α-H-吡咯，ii)使所述α -H-吡咯與適當(dāng)?shù)摩?-甲酰吡咯縮合，iii)使由此形成的二吡咯亞甲基化合物與三氟化硼乙醚反應(yīng)，iv)引入磷酸膽堿基團(tuán)。本發(fā)明的另一個(gè)具體方面涉及本發(fā)明化合物在制備用于微生物鑒定方法的藥物 組合物的用途。本發(fā)明的另一個(gè)具體方面涉及診斷性藥物組合物(以下稱(chēng)為本發(fā)明的診斷性藥 物組合物)，其包含本發(fā)明的化合物，例如化合物BDP-MT或肚-BDP-MT。最后，本發(fā)明的一個(gè)具體方面是本發(fā)明的診斷性藥物組合物的用途，其中本發(fā)明 的藥物組合物用于微生物鑒定方法中。本發(fā)明的另一個(gè)更具體方面涉及本發(fā)明的診斷性藥物組合物用于生物樣品的體 外診斷方法中的用途，其中所述生物樣品來(lái)自帶有傳染性疾病的人或獸醫(yī)學(xué)個(gè)體，例如但不限制本發(fā)明的范圍，所述傳染性疾病屬于下組角膜炎、利什曼病、非洲和美洲錐蟲(chóng)病、肺 炎鏈球菌肺炎、阿米巴病、滴蟲(chóng)病和霉菌病。本發(fā)明的另一個(gè)更具體的實(shí)施方案涉及本發(fā)明藥物組合物的用途，其中所述 傳染性疾病是由微生物引起，例如但不限制本發(fā)明的范圍，所述微生物屬于下組利什 曼原蟲(chóng)(Leishmania sp)、布氏維蟲(chóng)(Trypanosomabrucei)、克氏維蟲(chóng)(Trypanosoma cruzi)、^itilg (Trichomonas sp.) ,M^RiH Ητ|< E (Entamoeba histolytica) Λ 阿米巴(Acanthamoeba sp.)、納氏蟲(chóng)(Naegleria sp.)、月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、,廉刀菌(Fusarium sp.)、梨形四膜蟲(chóng)(Tetrahymena pyriformis)禾口 Balamuthia本發(fā)明的另一個(gè)更具體實(shí)施方案涉及本發(fā)明診斷性藥物組合物的用途，其用于源 自眼睛的生物樣品的診斷方法中，例如所述樣品由角膜刮削獲得。本發(fā)明的另一個(gè)更具體實(shí)施方案涉及本發(fā)明診斷性藥物組合物的用途，其用于鑒 定既非人也非動(dòng)物之樣品中微生物的方法中，例如在水、人工眼睛、隱形眼鏡、隱形眼鏡護(hù) 理液或角膜保存介質(zhì)中。


圖1.-通過(guò)中間體1至5，合成熒光類(lèi)似物BDP-MT和K-BDP-MT。圖2.-杜氏利什曼原蟲(chóng)前鞭毛體中米替福新耐藥性的差異性檢測(cè)(MH0M/ET/67/ L82菌株)。MT敏感型(WT)(上行)或耐藥性(R40)(底行)杜氏利什曼原蟲(chóng)前鞭毛體在
下與7.5μΜ BDP-MT —起孵育2小時(shí)，用牛血清蛋白(BSA)將其清洗三次，然后用激發(fā) 波長(zhǎng)為488nm、檢測(cè)波長(zhǎng)范圍為502-555nm的共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。圖3.-用BDP-MT對(duì)兩種不同形式的卡氏棘阿米巴(Acanthamoebacastellanii) 進(jìn)行差異性染色?？ㄊ霞⒚装偷陌?a)和營(yíng)養(yǎng)體(b)在32°C下與5μΜ BDP-MT—起 孵育15分鐘，用BSA溶液(10mg/ml)進(jìn)行清洗，然后用激發(fā)波長(zhǎng)為488nm、檢測(cè)波長(zhǎng)范圍為 502-555nm的共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。圖4.-用BDP-MT對(duì)鐮刀菌和兩種形式之卡氏棘阿米巴同時(shí)進(jìn)行差異性染色?？?氏棘阿米巴的營(yíng)養(yǎng)體(a)和包囊(b)、連同鐮刀菌的菌絲(c)與5 μ MBDP-MT 一起孵育15分 鐘，隨后用BSA溶液進(jìn)行清洗，然后用激發(fā)波長(zhǎng)為488nm、檢測(cè)波長(zhǎng)范圍為502-555nm的共聚 焦顯微鏡進(jìn)行觀察。圖5.-用ET-BDP-MT對(duì)鐮刀菌和兩種形式之卡氏棘阿米巴同時(shí)進(jìn)行差異性染色。 卡氏棘阿米巴的營(yíng)養(yǎng)體(a)和包囊(b)、連同鐮刀菌的菌絲(c)與5 μ MEt-BDP-MT在30°C 下一起孵育15分鐘，隨后用BSA進(jìn)行清洗，然后用帶有CCD相機(jī)和480-520nm發(fā)射波長(zhǎng)濾 光片的熒光顯微鏡觀察熒光。圖6.-用BDP-MT對(duì)梨形四膜蟲(chóng)(作為自由活動(dòng)的原生動(dòng)物)染色。梨形四膜蟲(chóng) 與5 μ M BDP-MT 一起孵育4小時(shí)，然后用2%多聚甲醛清洗并固定，以避免其在成像過(guò)程中 移動(dòng)。最后用激發(fā)波長(zhǎng)為488nm、發(fā)射檢測(cè)范圍為502-555nm的共聚焦顯微鏡觀察梨形四膜 蟲(chóng)的細(xì)胞。實(shí)施例實(shí)施例1.結(jié)構(gòu)中添加可見(jiàn)光區(qū)熒光基團(tuán)的兩種米替福新類(lèi)似物的制備BDP-MT和 K-BDP-MT。從相應(yīng)的吡咯開(kāi)始，通過(guò)相似的兩步法方法，獲得這兩種相似的包含硼二吡咯亞 甲基類(lèi)(BDP)生色團(tuán)的熒光類(lèi)似物(圖1)。從而，在三氯氧磷存在下，使得α-H-吡咯3 與2-甲酰-3，5-二甲基-IH-吡咯縮合或者與2-甲酰-3，5-二甲基-4-乙基-IH-吡咯 縮合(MacDonald反應(yīng))。在三乙胺存在下，通過(guò)與三氟化硼乙醚反應(yīng)，所形成的相應(yīng)吡咯 亞甲基在原位轉(zhuǎn)化為各自相應(yīng)取代的BDP染料4和5。在最后的合成步驟中，在三甲基胺 存在下通過(guò)與2-氯-1，3，2- 二氧磷雜環(huán)戊烷-2-氧化物反應(yīng)從而引入磷酸膽堿基團(tuán)。如 下獲得前體化合物在碳酸鉀和冠醚18-冠-6存在下，使得乙酰丙酮與11-溴-1-十一烷 醇在丙酮中通過(guò)單烷基取代作用來(lái)獲得所述二乙?；?；乙氧羰基吡咯2由以下兩步形 成1)乙酰乙酸乙酯用亞硝酸酸鈉處理，幻在1存在下，所得的羥亞胺化合物用鋅/乙酸還 原(Johnson-Knorr合成)。通過(guò)用水/乙醇中氫氧化鈉處理使得2脫羧基從而獲得所述 α -H-吡咯3。2-甲酰-3，5- 二甲基-IH-吡咯是一種商業(yè)產(chǎn)品，而對(duì)應(yīng)的2_甲酰-4-乙 基-3，5-二甲基-IH-吡咯是在二甲基甲酰胺中通過(guò)用三氯氧磷使2，5-二甲基-3-乙 基-IH-吡咯(kriptopirrol)甲?；@得的。實(shí)施例2.通過(guò)引入BDP-MT熒光類(lèi)似物來(lái)診斷是否存在對(duì)米替福新藥物敏感或有 耐藥性的利什曼寄生蟲(chóng)。杜氏利什曼原蟲(chóng)前鞭毛體的MH0M/ET/67/L82菌株和米替福新耐藥菌株由Simon Croft教授(倫敦?zé)釒l(wèi)生與醫(yī)學(xué)院，倫敦，英國(guó))提供，并按照常用方法培養(yǎng)在沈！下在 添加10%滅活胎牛血清、慶大霉素、青霉素和2mM谷氨酰胺的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)。除了在培 養(yǎng)基中添加40μΜ MT以外，MT耐藥菌株與對(duì)MT敏感的親本菌株生長(zhǎng)條件相同。在靜止?fàn)?態(tài)下收集以上兩種寄生蟲(chóng)，用不含酚紅的RPMI 1640培養(yǎng)基清洗，并在加入7. 5 μ M BDP-MT 后，在^TC下在上述培養(yǎng)基中孵育2小時(shí)到2X IO6寄生蟲(chóng)/mL的密度。接下來(lái)在不含脂肪 酸的lOmg/mL BSA存在下用所述培養(yǎng)基清洗三次，最后用激發(fā)波長(zhǎng)為488nm、發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè) 范圍為502-555nm的Leica TCS-SP2-A0BS-UV共聚焦顯微鏡進(jìn)行活體檢測(cè)。從圖2中可以觀察到對(duì)藥物敏感的寄生蟲(chóng)菌株出現(xiàn)強(qiáng)烈的細(xì)胞內(nèi)熒光，然而在 耐藥寄生蟲(chóng)菌株中由于摻入標(biāo)記類(lèi)似物BDP-MT較差，其細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度較弱。實(shí)施例3.通過(guò)BDP-MT區(qū)分性診斷眼部寄生蟲(chóng)3. 1.卡氏棘阿米巴的包囊和營(yíng)養(yǎng)體卡氏棘阿米巴的包囊和營(yíng)養(yǎng)體是由的Carmen del人guila博士(馬德里San Pablo CEU大學(xué))提供的。營(yíng)養(yǎng)體在27°C下在含5%胎牛血清的⑶C培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，然后 用不含胎牛血清的上述培養(yǎng)基清洗，并在相同培養(yǎng)基中在32°C的溫度下將營(yíng)養(yǎng)體與5 μ M BDP-MT 一起孵育15分鐘，至7Χ IO5個(gè)營(yíng)養(yǎng)體的密度。孵育之后，用含有10mg/mL BSA的 上述培養(yǎng)基來(lái)清洗營(yíng)養(yǎng)體，然后用激發(fā)波長(zhǎng)為488nm、發(fā)射檢測(cè)范圍為502-555nm的Leica TCS-SP2-A0BS-UV共聚焦顯微鏡進(jìn)行活體觀察。由圖3可見(jiàn)卡氏棘阿米巴的營(yíng)養(yǎng)體(寄生蟲(chóng)的代謝活性形式)由于摻入了高量 的BDP-MT而顯示出了強(qiáng)烈的細(xì)胞內(nèi)熒光標(biāo)記。而在該圖的包囊中，熒光染色都集中在表面 上。由于上述實(shí)驗(yàn)是用自由活動(dòng)的微生物進(jìn)行的，因營(yíng)養(yǎng)體的移動(dòng)，其在透射圖像和熒光圖 像中的位置會(huì)有細(xì)微的差別。3.2.卡氏棘阿米巴包囊和營(yíng)養(yǎng)體以及鐮刀菌菌絲同時(shí)用熒光標(biāo)記。
真菌鐮刀菌的菌絲維持在含Saboroud培養(yǎng)基的瓊脂糖中。在32°C下在含有抗生 素且無(wú)胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增。清洗之后，在BDP-MT 5 μ M存在下， 在不含酚紅的相同培養(yǎng)基中在32°C溫度下重懸菌絲15分鐘。然后用BSA清洗三次，使用激 發(fā)波長(zhǎng)為488nm、發(fā)射檢測(cè)范圍為502-555nm的Leica TCS-SP2-A0BS-UV共聚焦顯微鏡進(jìn)行 活體觀察。摻入BDP-MT之后，菌絲、營(yíng)養(yǎng)體和包囊所有三種的熒光圖像觀察到與之前發(fā)生 很大區(qū)別，菌絲形態(tài)明顯被拉長(zhǎng)，而體積相對(duì)較小的卡氏棘阿米巴營(yíng)養(yǎng)體呈現(xiàn)出不規(guī)則的 形狀；上述兩種情況下都觀察到熒光類(lèi)似物摻入到細(xì)胞中，而在卡氏棘阿米巴的包囊(基 本上呈球狀)中僅在其表面觀察到熒光標(biāo)記，這與與之前實(shí)施例中描述的情形相同。實(shí)施例4.通過(guò)熒光類(lèi)似物肚-BDP-MT診斷病原微生物的存在。以上所提到的使用BDP-MT化合物的病原體熒光標(biāo)記技術(shù)同樣可以應(yīng)用于其他類(lèi) 似物，其中通過(guò)改變這些類(lèi)似物中熒光基團(tuán)的結(jié)構(gòu)，使激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)出現(xiàn)在可見(jiàn)光譜中 其他不同區(qū)域。為了進(jìn)一步說(shuō)明這種擴(kuò)展，本實(shí)施例中使用類(lèi)似物肚-BDP-MT。與類(lèi)似物 BDP-MT相比，該類(lèi)似物中的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)都發(fā)生了紅移。圖5中的三幅圖像包含了用 Et-BDP-MT染色后的代表性微生物實(shí)例，分別顯示了卡氏棘阿米巴營(yíng)養(yǎng)體(A)、卡氏棘阿米 巴包囊(B)和鐮刀菌菌絲(C)。將上述三種微生物在5μ M肚-BDP-MT類(lèi)似物存在下孵育 30分鐘進(jìn)行標(biāo)記。隨后使用含BSA lOmg/mL的培養(yǎng)基進(jìn)行清洗，最后用熒光顯微 鏡上(帶有480-520nm發(fā)射光濾光器)偶聯(lián)的Leica DFC350FX CCD數(shù)碼相機(jī)拍照。在上述三種微生物中均觀測(cè)到了與BDP-MT所得圖像類(lèi)似的熒光圖樣；卡氏棘阿 米巴的營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞內(nèi)有熒光標(biāo)記，相同微生物的包囊表面有熒光標(biāo)記，鐮刀菌菌絲也已被 標(biāo)記，這表明BDP-MT獲得的數(shù)據(jù)也可較容易地?cái)U(kuò)展應(yīng)用到其它結(jié)構(gòu)類(lèi)似的化合物中。實(shí)施例5.用BDP-MT對(duì)自由活動(dòng)的四膜蟲(chóng)進(jìn)行熒光標(biāo)記。原生動(dòng)物梨形四膜蟲(chóng)的細(xì)胞在蛋白酶蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基(ProteasaP印tona Glucosa Medium)中擴(kuò)增，通過(guò)離心收集細(xì)胞(密度為IO4個(gè)細(xì)胞/mL)。隨后與BDP-MT 5μΜ 一起孵育4小時(shí)，再用2%多聚甲醛清洗并固定30分鐘，最后用激發(fā)波長(zhǎng)為488nm、發(fā)射檢 測(cè)范圍為502-555nm的Leica TCS-SP2-A0BS-UV共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀測(cè)。從圖6中可以觀察到，微生物中摻入了大量的熒光化合物，這樣就能夠進(jìn)行鑒定 和定位，甚至在細(xì)胞濃度較低的地方也能如此。
權(quán)利要求
1.用于區(qū)分性鑒定微生物的熒光化合物，其特征在于，其含有烷基磷脂衍生物和具有 高度光穩(wěn)定性并發(fā)射可見(jiàn)光譜區(qū)波長(zhǎng)之光的熒光基團(tuán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的熒光化合物，其特征在于，所述烷基磷脂類(lèi)似物是米替福新(MT)、 依地福新(EF)或伊莫福新(IM)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的熒光化合物，其特征在于，所述烷基磷脂類(lèi)似物是米替福新(MT)、 依地福新(EF)或伊莫福新(IM)的類(lèi)似物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的熒光化合物，其特征在于，所述熒光基團(tuán)是具有高度光穩(wěn)定性并 發(fā)射可見(jiàn)光譜波長(zhǎng)區(qū)之光的熒光基團(tuán)，其中包括但不限于具有或不具有取代基的硼二吡 咯亞甲基類(lèi)、咕噸類(lèi)、羅丹明類(lèi)、花青類(lèi)、沙星類(lèi)、嚇啉類(lèi)、香豆素類(lèi)和多環(huán)烴類(lèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的熒光化合物，其特征在于，所述熒光基團(tuán)是以下通式所 表示的取代或未取代的硼二吡咯亞甲基類(lèi)(BDP)
6.根據(jù)權(quán)利要求5的熒光化合物，其特征在于，R1是氫或乙基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1和2任一項(xiàng)的熒光化合物，其特征在于，所述烷基磷脂類(lèi)似物是米替 福新，并且所述熒光基團(tuán)是以下通式所表示的取代或未取代的BDP
8.根據(jù)權(quán)利要求7的熒光化合物，其特征在于，R1是氫(BDP-MT化合物)或乙基 (Et-BDP-ΜΤ 化合物)。
9.獲得熒光化合物的方法，其特征在于包括以下步驟i)由二乙?；己鸵阴Ｒ宜嵋阴カ@得相應(yīng)的取代α-H-吡咯， )使所述α "H-吡咯與適當(dāng)?shù)摩?-甲酰吡咯縮合，iii)使由此形成的二吡咯亞甲基化合物與三氟化硼乙醚反應(yīng)，iv)引入磷酸膽堿基團(tuán)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)的熒光化合物在制備用于微生物鑒定方法的藥物組合 物的用途。
11.診斷性藥物組合物，其特征在于，包含根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)的化合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的診斷性藥物組合物，其特征在于，包含以下至少一種化合物 BDP-MT 禾口 Et-BDP-MT。
13.根據(jù)權(quán)利要求11和12任一項(xiàng)所述的診斷性藥物組合物在用于鑒定微生物之方法 中的用途。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的診斷性藥物組合物的用途，其用于生物樣品的體外診斷方法 中，所述生物樣品來(lái)自帶有傳染性疾病的人或獸醫(yī)學(xué)個(gè)體，例如但不限制本發(fā)明的范圍，所 述傳染性疾病屬于下組角膜炎、利什曼病、非洲和美洲錐蟲(chóng)病、肺炎鏈球菌肺炎、阿米巴 病、滴蟲(chóng)病和霉菌病。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的診斷性藥物組合物的用途，其特征在于，所述傳染性疾病由屬 于下組的微生物引起利什曼原蟲(chóng)(Leishmania sp)、布氏錐蟲(chóng)(Trypanosoma brucei)、克 氏錐蟲(chóng)(Trypanosoma cruzi)、毛滴蟲(chóng)(Trichomonas sp.)、溶組織性?xún)?nèi)阿米巴(Entamoeba histolytica)、棘阿米巴(Acanthamoeba sp.)、納氏蟲(chóng)(Naegleria sp)、月市炎鏈球 菌(Streptococcus pneumoniae)、鍵刀菌(Fusarium sp.)、梨形四膜蟲(chóng)(Tetrahymena pyriformis)禾口 Balamuthia 原蟲(chóng)。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的診斷性藥物組合物的用途，其用于源自眼的生物樣品的診斷方 法中，所述樣品例如由角膜刮削獲得。
17.根據(jù)權(quán)利要求13的診斷性藥物組合物的用途，其用于既非人也非動(dòng)物之樣品中微 生物的鑒定方法中，例如在水、人工眼睛、隱形眼鏡、隱形眼鏡護(hù)理液或角膜保存介質(zhì)中。
全文摘要
本發(fā)明涉及類(lèi)似于烷基磷脂的新的熒光化合物，在其結(jié)構(gòu)中含有高度光穩(wěn)定的熒光基團(tuán)并發(fā)射可見(jiàn)光譜波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光。所述化合物容易導(dǎo)入微生物中，從而能夠通過(guò)熒光顯微鏡來(lái)檢測(cè)和鑒定所述微生物。所述新熒光化合物還可以快速且容易地診斷病原微生物的存在性，其特征表現(xiàn)為它們對(duì)用烷基磷脂處理的抗性。
文檔編號(hào)C09K11/06GK102124076SQ200980121114
公開(kāi)日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2009年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月4日
發(fā)明者A·烏利塞斯·阿庫(kù)納費(fèi)爾南德斯, 喬斯·瑪麗亞·紹加爾克魯斯, 喬斯·瑪麗亞·雷克霍伊西德羅, 卡芒·德?tīng)柊⒓吕斩魈? 尤金伲亞·卡里洛加列戈, 弗朗西斯科·阿馬特圭里, 杰休斯·梅拉約洛韋斯, 瓦倫丁·奧尼略斯戈麥斯雷庫(kù)埃羅, 蘇珊娜·馬科斯塞萊斯蒂諾, 路易斯·伊格納西奧·里瓦斯洛佩斯 申請(qǐng)人:圣巴布羅大學(xué), 巴利亞多利德大學(xué), 康斯喬最高科學(xué)研究公司