一種免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法及其在宮頸腫瘤性病變篩查中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及腫瘤性病變的細(xì)胞學(xué)篩查技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法及其在宮頸腫瘤性病變篩查中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤性病變的細(xì)胞學(xué)篩查及診斷可以早期發(fā)現(xiàn)部分惡性腫瘤，現(xiàn)在普及開展的宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查有效降低了宮頸癌的發(fā)生率和病死率。然而，以巴氏染色為基礎(chǔ)的液基細(xì)胞檢查有其天然的缺陷:(1)、宮頸活檢中尚有一部分病變要依賴P16及Ki67的檢測才能區(qū)別出是高級(jí)別病變(HSILE)還是對炎癥的應(yīng)激性改變，這一部分病例在巴氏染色的細(xì)胞學(xué)中無能為力；(2)、取材不當(dāng)，不合格，送檢標(biāo)本中病變細(xì)胞過少；(3)、部分病例基因水平已改變且已造成P16升高，細(xì)胞周期失控，但形態(tài)學(xué)尚未改變；(4)、醫(yī)生未受嚴(yán)格長期培訓(xùn)，閱片量未達(dá)到最低要求，鏡下有很多病變細(xì)胞而醫(yī)生不敢確認(rèn)，據(jù)信，有些病理醫(yī)生一年幾千例液基片，從未發(fā)過HSILE ;(5)、醫(yī)生工作量過大，長時(shí)間疲勞閱片，導(dǎo)致漏診率上升；(6)、制片技術(shù)未過關(guān)，人為改變細(xì)胞形態(tài)，病變細(xì)胞形態(tài)失真，無法辨認(rèn)。
[0003]由于上述諸多原因，導(dǎo)致:大型三甲醫(yī)院或頂級(jí)醫(yī)療中心，包括在病理醫(yī)師訓(xùn)練嚴(yán)格的美國，假陰性率高達(dá)10%，基層醫(yī)院比例更高。至于一年下來從未發(fā)過HSILE的醫(yī)院，對于病人而言無異于災(zāi)難。參與宮頸癌篩查的人，如本已是HSILE或早癌，病理醫(yī)師發(fā)一陰性報(bào)告，以后很長時(shí)間內(nèi)，病人本身及給該病人診療的醫(yī)生都會(huì)因這份假陰性報(bào)告而忽略早癌的相關(guān)癥狀(不體檢反不會(huì)忽略)，在這一過程中，病理醫(yī)師幫了倒忙。因此，發(fā)展一種客觀的指標(biāo)幫助病理醫(yī)師從大量的細(xì)胞中輕易發(fā)現(xiàn)病變細(xì)胞具有巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。
[0004]導(dǎo)致宮頸癌的主要原因是人乳頭瘤病毒(HPV)的持續(xù)感染，超過99%的宮頸癌都由高危型HPV引起，從正常宮頸發(fā)生病變繼而進(jìn)展到宮頸癌大概約需8-12年。宮頸癌癌前病變即宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN)按嚴(yán)重程度可分為CINUCIN2和CIN3，不同階段對應(yīng)的治療策略也不同。pl6INK4a是多瘤抑制因子I (MTS1)基因pl6的蛋白產(chǎn)物，逐漸受到廣大臨床醫(yī)生的重視，它有助于輔助H&E判讀，可顯著提高CIN2、CIN3準(zhǔn)確性和病理醫(yī)師之間診斷的一致性。2012年，美國病理學(xué)會(huì)(CAP)和美國陰道鏡與宮頸病理學(xué)會(huì)(ASCCP)的指南建議，使用特定克隆號(hào)(E6H4)的pl6INK4a抗體作為檢測HPV感染是否影響到細(xì)胞周期調(diào)控的生物標(biāo)志物，該克隆號(hào)是全球唯一獲得IVD認(rèn)證的pl6INK4a抗體。在世界衛(wèi)生組織2014年出版的《女性生殖器官腫瘤分類》(WHOClassificat1nofTumoursofFemaleReproductiveOrgans)第4版中，明確指出宮頸、外陰和陰道鱗狀上皮病變的診斷采用LAST(LowerAnogenitalSquamousTermino1gyStandardizat1nofHPV-associatedNeoplasia,月工門及下生殖道HPV相關(guān)的鱗狀上皮瘤變術(shù)語標(biāo)準(zhǔn)化)術(shù)語，應(yīng)用二級(jí)分類命名法LSIlXLowgradesquamousintraepithelialles1n,低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變)和 HSIL(Highgradesquamousintra印ithelialles1n，高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變)，有利于診斷的一致性和可重復(fù)性，推薦使用pl6INK4a作為輔助LSIL和HSIL診斷的分子生物學(xué)指標(biāo)。
[0005]由CAP和ASCCP的LAST項(xiàng)目研究，通過對6，063篇摘要、I, 210篇全文以及452組數(shù)據(jù)分析進(jìn)行回顧，形成關(guān)于HPV組織病理學(xué)的命名推薦，參與討論的涵蓋病理和臨床專業(yè)的44位委員與13位專家得出共識(shí):采用二級(jí)命名法(LSIL和HSIL)更具可重復(fù)性，有利于病理醫(yī)師和臨床醫(yī)師之間的交流。此外，加入pl6INK4a檢測可幫助對CIN進(jìn)行更準(zhǔn)確的分級(jí)。建議對臨床醫(yī)生較難處理的CIN1-CIN2樣本，pl6INK4a陽性時(shí)，可歸為HSIL，判為CIN2 ；pl6INK4a陰性則可判為CINl，歸為LSIL。
[0006]此外，LAST項(xiàng)目還證實(shí)，pl6INK4a的應(yīng)用對提高診斷一致性具有高質(zhì)量證據(jù)，推薦在以下四種情況中使用pl6INK4a =HSIL和類似非腫瘤性病變需要鑒別診斷時(shí)，如不成熟鱗化、萎縮、修復(fù)性上皮增生及人工操作所致假象；有疑問的CIN2 ;不同閱片人診斷意見不同；HPV檢測、細(xì)胞學(xué)陰道鏡提示有高級(jí)別病變可能，但組織學(xué)診斷為陰性。
[0007]大量研究數(shù)據(jù)還證實(shí)，CINl/pl6INK4a陽性進(jìn)展為CIN2+的可能性遠(yuǎn)高于CINl/pl6INK4a陰性病變。因此，pl6INK4a有助于判斷低級(jí)別宮頸病變患者預(yù)后，為臨床醫(yī)生隨訪和治療提供有力依據(jù)。
[0008]pl6INK4a在病理活檢上的應(yīng)用價(jià)值甚大，如在細(xì)胞學(xué)篩查的基礎(chǔ)上加染pl6INK4a和Ki_67 (細(xì)胞增殖指數(shù))可以解決以上細(xì)胞學(xué)檢查的諸多問題。然而，現(xiàn)有的文獻(xiàn)現(xiàn)示，pl6INK4a和K1-67在組織學(xué)中對CIN病變具有高度特異性，在液基細(xì)胞學(xué)涂片中這種特異性卻消失了，絕大部分研究發(fā)現(xiàn)涂片中的底層細(xì)胞、化生細(xì)胞和萎縮細(xì)胞都可陽性，當(dāng)把液基細(xì)胞標(biāo)本做成細(xì)胞蠟塊切片以后，其特異性又回到組織學(xué)檢查的水平。如果能在細(xì)胞涂片標(biāo)本中就回復(fù)其特異性，就可以顯著降低病理醫(yī)生的工作量和誤診漏診風(fēng)險(xiǎn)，也可以完全自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化，降低篩查成本，具有明顯的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益，為病人和臨床醫(yī)生帶來福音。通過生物標(biāo)志物pl6INK4a和Ki_67，不僅有助于病理科醫(yī)生對CIN進(jìn)行準(zhǔn)確分級(jí)，并且可以幫助臨床醫(yī)生更全面的認(rèn)識(shí)癌前病變和宮頸癌的特點(diǎn)，有助于對患者選擇更合理的方式，有效管理宮頸癌前病變，才能真正降低宮頸癌發(fā)病率和死亡率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法，該方法步驟簡單，操作控制方便，靈敏度高，特異性好。
[0010]本發(fā)明的另一目的在于提供一種免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法在宮頸腫瘤性病變篩查中的應(yīng)用，該應(yīng)用可以為病理醫(yī)師提供一種有效的客觀指標(biāo)，解決腫瘤性病變細(xì)胞學(xué)篩查的假陰性及假陽性問題，明顯減輕病理醫(yī)師的工作量及負(fù)擔(dān)，解決細(xì)胞涂片中免疫化學(xué)及原位雜交染色的背景及非特異性上色問題，明顯降低腫瘤篩查的人均費(fèi)用。
[0011]本發(fā)明的另一目的在于提供一種應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法進(jìn)行腫瘤篩查的方法，該方法可以應(yīng)用不同的標(biāo)靶可對人體所有細(xì)胞學(xué)標(biāo)本進(jìn)行篩查檢測，為病理醫(yī)師提供一種有效的客觀指標(biāo)，解決腫瘤性病變細(xì)胞學(xué)篩查的假陰性及假陽性問題，明顯減輕病理醫(yī)師的工作量及負(fù)擔(dān)，解決細(xì)胞涂片中免疫化學(xué)及原位雜交染色的背景及非特異性上色問題，明顯降低腫瘤篩查的人均費(fèi)用。
[0012]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法，包括如下步驟:
A、當(dāng)檢測單個(gè)樣本的單個(gè)目標(biāo)物時(shí): Al、取樣本細(xì)胞的保存液加入添加有分離液的離心管中，離心，棄去上層廢液，得到含有樣本細(xì)胞的沉淀物；
A2、將步驟Al制得的含有樣本細(xì)胞的沉淀物加入基液后混勻，得到含有樣本細(xì)胞的懸浮液；
A3、取載玻片，將步驟A2制得的含有樣本細(xì)胞的懸浮液加入載玻片的工作區(qū)域，烘干，得到細(xì)胞涂片；
A4、取步驟A3制得的細(xì)胞涂片，用固定液進(jìn)行固定，將細(xì)胞涂片采用梯度酒精水洗，然后加入修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，再加入封閉液封閉背景后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色；
B、當(dāng)檢測多個(gè)樣本的單個(gè)目標(biāo)物時(shí):
B1、取至少兩份含有不同樣本細(xì)胞的保存液分別加入相應(yīng)的添加有分離液的離心管中，離心，棄去上層廢液，得到至少兩份含有不同樣本細(xì)胞的沉淀物；
B2、將步驟BI制得的至少兩份含有不同樣本細(xì)胞的沉淀物分別加入基液后混勻，得到至少兩份含有不同樣本細(xì)胞的懸浮液；
B3、取載玻片，在載玻片的工作區(qū)域畫至少兩個(gè)分隔區(qū)域并編號(hào)，將步驟B2制得的至少兩份含有不同樣本細(xì)胞的懸浮液分別加入相應(yīng)的分隔區(qū)域，烘干，得到細(xì)胞芯片；
B4、取步驟B3制得的細(xì)胞芯片，用固定液進(jìn)行固定，將細(xì)胞芯片采用梯度酒精水洗，然后加入修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，再加入封閉液封閉背景后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色；
C、當(dāng)檢測單個(gè)樣本的多個(gè)目標(biāo)物時(shí):
Cl、取樣本細(xì)胞的保存液加入添加有分離液的離心管中，離心，棄去上層廢液，得到含有樣本細(xì)胞的沉淀物；
C2、將步驟Cl制得的含有樣本細(xì)胞的沉淀物加入基液后混勻，得到含有樣本細(xì)胞的懸浮液；
C3、取載玻片，在載玻片的工作區(qū)域畫至少兩個(gè)分隔區(qū)域并編號(hào)，將步驟C2制得的含有樣本細(xì)胞的懸浮液分別加入每個(gè)分隔區(qū)域，烘干，得到細(xì)胞芯片；
C4、取步驟C3制得的細(xì)胞芯片，用固定液進(jìn)行固定，將細(xì)胞芯片采用梯度酒精水洗，然后加入修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，加入抗體或探針，再加入封閉液封閉背景后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色；
D、當(dāng)檢測多個(gè)樣本的多個(gè)目標(biāo)物時(shí):
D1、取至少兩份含有不同樣本細(xì)胞的保存液分別加入相應(yīng)的添加有分離液的離心管中，離心，棄去上層廢液，得到至少兩份含有不同樣本細(xì)胞的沉淀物；
D2、將步驟Dl制得的至少兩份含有不同樣本細(xì)胞的沉淀物分別加入基液后混勻，得到至少兩份含有不同樣本細(xì)胞的懸浮液；
D3、取載玻片，在載玻片的工作區(qū)域畫至少兩個(gè)分隔區(qū)域并編號(hào)，將步驟D2制得的至少兩份含有不同樣本細(xì)胞的懸浮液分別加入相應(yīng)的分隔區(qū)域，烘干，得到細(xì)胞芯片；
D4、取步驟D3制得的細(xì)胞芯片，用固定液進(jìn)行固定，將細(xì)胞芯片采用梯度酒精水洗，然后加入修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，加入抗體或探針，再加入封閉液封閉背景后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。
[0013]本發(fā)明的一種免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法，該方法步驟簡單，操作控制方便，靈敏度高，特異性好。
[0014]優(yōu)選的，所述步驟A1、B1、C1和Dl中，每升保存液由如下重量百分比的原料組成:醛類0.04%-2%、醇類10%-40%、酰胺類1%-20%、抗凝