一種神經(jīng)系統(tǒng)突觸位點的免疫熒光染色方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫熒光染色方法，尤其涉及一種神經(jīng)系統(tǒng)突觸位點的免疫熒光染色方法。
【背景技術(shù)】
[0002]秀麗隱桿線蟲是非常有用且具有很多優(yōu)勢的模式動物，許多科學成果是通過使用秀麗隱桿線蟲為動物模型獲得，如:獲得2002年諾貝爾獎的細胞發(fā)育的程序性死亡機制、獲得2006年諾貝爾獎的RNA干擾現(xiàn)象的機制、獲得2008年諾貝爾獎的綠色熒光蛋白發(fā)現(xiàn)及其應(yīng)用等。
[0003]目前，許多科學家開始利用秀麗隱桿線蟲進行應(yīng)用開發(fā)研究，但是在使用秀麗隱桿線蟲進行免疫熒光染色時，最大的困難在于難以將秀麗隱桿線蟲的蟲體包被在最外面的一層外皮打開，進而使用去垢劑Triton-XlOO進行細胞透膜，對細胞內(nèi)外的亞細胞結(jié)構(gòu)進行有效染色，通過破壞秀麗隱桿線蟲蟲體外皮的方法對秀麗隱桿線蟲外皮內(nèi)的組織與細胞進行染色，但這些方法都不能使秀麗隱桿線蟲蟲體保持完整的結(jié)構(gòu)域形態(tài)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種能保持秀麗隱桿線蟲蟲體結(jié)構(gòu)域形態(tài)完整的神經(jīng)系統(tǒng)突觸位點的免疫熒光染色的方法。
[0005]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是，一種神經(jīng)系統(tǒng)突觸位點的免疫熒光染色方法，包括以下步驟:
[0006](I)挑選:挑選每種表型的各生長時期沒有饑餓的秀麗隱桿線蟲2-4盤；
[0007](2)速凍:用線蟲磷酸鹽緩沖液洗脫步驟(I)挑選的秀麗隱桿線蟲，并用線蟲磷酸鹽緩沖液將洗脫后的秀麗隱桿線蟲收集到試管中，將試管放在冰上5min，吸去上清液，然后用Iml CldH2O對秀麗隱桿線蟲重復(fù)洗滌3次，再吸去上清液，用80ul的體積分數(shù)為0.025%的戊二醛溶液懸浮秀麗隱桿線蟲；
[0008]取兩塊載玻片，將秀麗隱桿線蟲的戊二醛懸浮液轉(zhuǎn)移到一塊載玻片上，用另一塊載玻片合蓋在載有秀麗隱桿線蟲戊二醛懸浮液的載玻片上方，使秀麗隱桿線蟲被上下兩塊載玻片夾住呈三明治型，然后用無塵紙將三明治型載玻片邊緣的液體吸去，使線蟲蠕動困難，然后將三明治型載玻片放置在干冰上，放置時間30min以上；
[0009](3)固定:將步驟(2)速凍后的載玻片從干冰中取出，將三明治型載玻片迅速掰開，秀麗隱桿線蟲的外表皮被打開，保持了秀麗隱桿線蟲蟲體的組織結(jié)構(gòu)與形態(tài)的完整性，然后將載玻片浸沒在固定液中，使載玻片上的秀麗隱桿線蟲蟲體與固定液充分接觸；
[0010]將在固定液中浸沒后的載玻片轉(zhuǎn)移到離心管中，離心管中裝有40mllx磷酸鹽緩沖液，同種基因型的秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)移在同一離心管中，保存溫度為4°C，使秀麗隱桿線蟲從載玻片上洗脫到離心管中，并使秀麗隱桿線蟲收集在離心管的管底，吸去上清液，將秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)移到試管中，再次吸去上清液，把試管中的沉積物保存在冰上；
[0011](4)抗體染色:向步驟(3)固定后的秀麗隱桿線蟲中抗體非特異性蛋白加入500uL體積分數(shù)為0.2 %聚乙二醇辛基苯基醚和質(zhì)量分數(shù)為0.2 %明膠，在常溫下封閉30min，然后重懸秀麗隱桿線蟲，每一染色組取約20uL的秀麗隱桿線蟲放到EP管中，靜置3-5min后，移除上清液，保留秀麗隱桿線蟲，將一抗抗體溶液加到EP管中，并輕輕混勻，將EP管側(cè)放在支架上，并將支架放在搖床上搖動過夜，室溫為4°C，第二天，將EP管正放，并靜置5min，移除一抗抗體上清液；
[0012]用ImL體積分數(shù)為0.2 %聚乙二醇辛基苯基醚和質(zhì)量分數(shù)為0.1 %明膠進行洗滌，洗滌后將放有EP管的支架放在轉(zhuǎn)動搖床上，搖動20min，使重懸的秀麗隱桿線蟲自然沉淀下來，重復(fù)此操作四次，使上清液完全去除；
[0013]每一染色組加入50uL的二抗抗體稀釋溶液到EP管中，并在二抗抗體稀釋溶液中加入DAPI進行核染色，然后將EP管側(cè)放在支架上，并將支架放在搖床上搖動過夜，溫度為4°C，第二天，將EP管正放，并靜置5min，移除二抗抗體上清液；
[0014]用ImL體積分數(shù)為0.2%聚乙二醇辛基苯基醚和質(zhì)量分數(shù)為0.1 %G明膠進行洗滌，洗滌后將EP管的支架放在轉(zhuǎn)動搖床上，搖動20min，使重懸的秀麗隱桿線蟲自然沉淀下來，重復(fù)此操作四次；
[0015]用IX磷酸鹽緩沖液進行洗滌，將EP管的支架放在轉(zhuǎn)動搖床上，搖動20min，使重懸的秀麗隱桿線蟲自然沉淀下來，然后用15uL的封片液對已經(jīng)染色的秀麗隱桿線蟲進行封片;
[0016]即神經(jīng)系統(tǒng)突觸位點的免疫熒光染色完成。
[0017]進一步，所述步驟(2)中，載玻片為耐冰凍載玻片，載玻片的內(nèi)側(cè)設(shè)有磨砂，將兩塊載玻片有磨砂的一面相對合蓋，使載玻片上沒有磨砂的部分緊密貼合，并在載玻片的磨砂部分用鉛筆標記。
[0018]進一步，所述步驟(2)中，秀麗隱桿線蟲被上下兩塊載玻片夾住后，在體式顯微鏡下觀察秀麗隱桿線蟲的蠕動狀態(tài)。
[0019]進一步，所述步驟(3)中，固定液為丙酮和甲醇，先將載玻片浸沒在丙酮中5分鐘，使載玻片上的秀麗隱桿線蟲蟲體與丙酮充分接觸，然后取出用吸水紙快速吸除多余的丙酮，并快速將載玻片浸沒在甲醇中5分鐘，使載玻片上的秀麗隱桿線蟲蟲體與甲醇充分接觸，然后取出用吸水紙快速吸除多余的甲醇。
[0020]進一步，所述丙酮和甲醇在_20°C至_30°C下預(yù)冷，分別裝在染色缸中，并將染色缸放在泡沫盒中，染色缸周圍用干冰圍住。
[0021]進一步，所述步驟(3)中，固定液為質(zhì)量分數(shù)為4%多聚甲醛的Ix磷酸鹽緩沖液，在通風處操作，將載玻片浸沒在質(zhì)量分數(shù)為4%多聚甲醛的Ix磷酸鹽緩沖液中，使載玻片上的秀麗隱桿線蟲蟲體與含4%多聚甲醛的Ix磷酸鹽緩沖液充分接觸。
[0022]進一步，所述步驟(3)中，通過用手掰開使合蓋的載玻片迅速分開。
[0023]進一步，所述步驟(3)中，通過用鑷子夾住載玻片，在磷酸鹽緩沖液中輕輕晃動3-5下，使秀麗隱桿線蟲從載玻片上洗到離心管中，并使秀麗隱桿線蟲收集在離心管的管底，吸去上清液，用巴斯德玻璃吸管將秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)移到試管中，再用真空吸器吸去上清液，把試管中的沉積物保存在冰上。
[0024]進一步，所述步驟(3)中，秀麗隱桿線蟲通過重力作用自然沉淀收集在管底，或者通過離心收集在管底，所述離心的條件為1500轉(zhuǎn)/min，離心時間為2min。
[0025]進一步，所述步驟(4)中，封片液為抗熒光衰減封片液。
[0026]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0027](I)凍結(jié)效率高，成本低，在正常的生理條件下，就能夠迅速凍結(jié)秀麗隱桿線蟲蟲體；
[0028](2)固定效果好，通過提供可選與可優(yōu)化不同種固定液對蛋白進行固定，大大提高固定效果和固定率；
[0029](3)能有效保持細胞結(jié)構(gòu)的完整性，染色操作方便，能有效將秀麗隱桿線蟲蟲體外皮打開，很好地保持機體各種組織與細胞結(jié)構(gòu)的完整性，方便對秀麗隱桿線蟲外皮包被內(nèi)的組織與細胞進行染色；
[0030](4)染色率高，能夠僅僅使用10uL的抗體溶液對動物體各種組織與細胞特別是神經(jīng)系統(tǒng)細胞與亞細胞結(jié)構(gòu)如神經(jīng)系統(tǒng)突觸位點的標記蛋白進行有效地染色。
【具體實施方式】
[0031 ]以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0032]實施例1
[0033]本實施例中所用材料:耐冰凍的載玻片;預(yù)先制成片狀，尺寸為10_20cm長的干冰；純丙酮和甲醇作為固定液，保存在_20°C，使用時，將固定液的輕微毒性覆蓋。
[0034](I)挑選:秀麗隱桿線蟲挑選每個表型中沒有饑餓的各個生長時期的線蟲至少2-4盤，Dauers時期的秀麗隱桿線蟲和含卵的秀麗隱桿線蟲染色不明顯。
[0035](2)速凍:
[0036]1、用線蟲磷酸鹽緩沖液M9buffer洗脫挑選的秀麗隱桿線蟲，并將秀麗隱桿線蟲收集在一個1.5mL的試管中；
[0037]2、將試管放在冰上5min，并用吸管吸去上清液；
[0038]3、用Iml (IdH2O對秀麗隱桿線蟲重復(fù)洗滌3次，并用吸管吸去上清液；
[0039]4、用80ul體積分數(shù)為0.025%戊二醛溶液懸浮秀麗隱桿線蟲；
[0040]5、取出耐冰凍的載玻片，將一塊載玻片有磨砂的一面朝上并用鉛筆標記載玻片，然后使用玻璃吸管，將戊二醛的秀麗隱桿線蟲懸浮液轉(zhuǎn)移到載玻片的中間，再用手拿起另外一個載玻片，使帶磨砂的一面朝下，小心地蓋在秀麗隱桿線蟲懸浮液上面，慢慢的將手拿的載玻片放下，使載玻片沒有磨砂的部分重疊，用鉛筆標記的部分不重疊，使兩塊載玻片呈三明治型；
[0041]6、在體式顯微鏡下觀察秀麗隱桿線蟲的蠕動狀態(tài)，并將三明治型的載玻片靜置3-5min，然后用無塵紙巾吸走多余的水份直至成年秀麗隱桿線蟲被上下兩片載玻片夾住而蠕動困難，立即用手拿住下面一片載玻片并將三明治型的載玻片轉(zhuǎn)移到表面平整的干冰上，并將三明治型的載玻片放置在干冰上至少30min。
[0042](3)固定:
[0043]1、準備兩個染色缸，一個用于裝-20—30°C預(yù)冷的丙酮，另一個用于裝-20—30°C預(yù)冷的甲醇，將兩個染色缸放在一個泡沫盒中，并在染色缸周圍用干冰圍??；
[0044]2、為每一種基因型的秀麗隱桿線蟲準備一個50mL的離心管，并在離心管內(nèi)裝上40ml IxPBS(磷酸鹽緩沖液)緩沖液，貼上標簽放在冰中保存待用；
[0045]3、從干冰上取出速凍的三明治型的載玻片，并用雙手快速地將兩塊載玻片掰開，這時秀麗隱桿線蟲外表的外表皮就會被打開，保持了秀麗隱桿線蟲蟲體各組織結(jié)構(gòu)與形態(tài)的完整性;然后把載玻片上沒有放線蟲的一面迅速地背靠背并放在一起，并立即將載玻片浸沒在裝有冷凍丙酮的染色缸中5min;然后將背靠背放置的載玻片從丙酮中取出來，用吸水紙快速吸除多余的丙酮并快速將載玻片浸沒在裝有冷凍的甲醇中5min，然后將載玻片從甲醇中取出，用吸水紙吸除多余的甲醇后，放在含有40ml Ix PBS的離心管中，每種基因型的秀麗隱桿線蟲蟲系放同一個50mL的離心管；
[0046]4、用鑷子夾住載玻片，在PBS中輕輕晃動3-5下，使固定的秀麗隱桿線蟲從載玻片上洗脫下來；
[0047]5、對不同基因型的秀麗隱桿線蟲蟲系進行速凍后進行固定時，只要重復(fù)1-4的操作即可；
[0048]6、將秀麗隱桿線蟲保存在50mL離心管中過夜，保存溫度為4°C，使線蟲隨重力自然沉淀到管底，或者通過在1500轉(zhuǎn)/min的離心條件，離心2min把線蟲收集到離心管管底，然后吸去上清液，用巴斯德玻璃吸管把線蟲轉(zhuǎn)移到1.5ml試管中，再用真空吸器去除上清液，把
1.5ml試管中的沉積物放在在冰上保存。
[0049](4)抗體染色: