專利名稱：D-乳酸診斷/測(cè)定試劑盒及d-乳酸濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用具有D-乳酸特異性的D-乳酸診斷/測(cè)定試劑盒， 同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定D-乳酸濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
L-乳酸是近年來(lái)人們十分關(guān)注并發(fā)展較快的有機(jī)酸。同時(shí)L-乳酸具有 在食品、飼料、醫(yī)藥、塑料、詞料、農(nóng)藥、日用化工、造紙及電子工業(yè)等 多領(lǐng)域應(yīng)用前景。L-乳酸是大多數(shù)生物體代謝作用的終產(chǎn)物。僅少數(shù)微生物(例乳酸菌屬、 明串珠菌屬)能形成D-乳酸。生產(chǎn)酸奶時(shí)非常注意檢測(cè)乳酸鹽，以評(píng)估微 生物是否產(chǎn)生L-乳酸，D-乳酸或二者兼有。若有D-乳酸存在，則可能是微 生物造成了污染。乳酸鹽濃度的異常升高與多種疾病如糖尿病、酸毒癥等疾病有密切的關(guān) 系。L(+)-Lactate是人體中乳酸鹽代謝的主要中間產(chǎn)物，并且存在于血液 中。D(-)-Lactate也存在,但含量很低，只有L(+)-Lactate的1-5%。血乳酸測(cè)試作為一個(gè)監(jiān)護(hù)、監(jiān)測(cè)運(yùn)動(dòng)員訓(xùn)練能力的手段，把血乳酸值作 為衡量運(yùn)動(dòng)員有氧耐力水平、無(wú)氧訓(xùn)練能力、身體疲勞恢復(fù)等方面的一個(gè) 重要數(shù)據(jù)，供安排訓(xùn)練時(shí)參考。酶法分析是國(guó)際上公認(rèn)的分析方法，已被多個(gè)國(guó)際權(quán)威組織或機(jī)構(gòu)采納如IFU (國(guó)際果汁生產(chǎn)者協(xié)會(huì))，AIJN (歐盟果蔬汁及飲料生產(chǎn)者聯(lián)盟)， 及MEBAK， OICC， VDLUFA等組織廣為推崇，并確定為標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種利用具有D-乳酸特異性的酶循 環(huán)f廣增 去(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔 酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定D-乳酸濃度的 方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的D-乳酸診斷/測(cè)定試劑盒， 采用該試劑不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行 D-乳酸濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣 應(yīng)用。本發(fā)明D-乳酸濃度測(cè)定方法原理如下D-乳酸+2高鐵細(xì)胞色素(D-乳酸脫氫酶 丙酮酸+2亞鐵細(xì)胞色素c 丙酮酸+氨離子+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶 L-丙氨酸+水+輔酶丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨離子+丙酮酸+過(guò)氧化氫這種方法應(yīng)用具有D-乳酸特異性的D-乳酸脫氫酶(D-Lactate dehydrogenase; EC l丄2.4; EC U.2.5)酶(偶)聯(lián)丙氨酸脫氫酶(alanine dehydrogenase ; EC 1.4.1.1)、甘氨酸氧化酶(glycine oxidase ; EC 1.4.3.19)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法。D-乳酸脫氫酶作為作用酶，功能為將D-乳酸酶解產(chǎn)生丙酮酸。丙氨酸脫氫酶的第一個(gè)酶促作用使丙酮酸產(chǎn)生丙氨酸；甘氨酸 氧化酶作為循環(huán)酶可以一再將丙氨酸再次變回丙酮酸，使丙酮酸不斷地被 重復(fù)循環(huán)利用。丙氨酸脫氫酶又可作為顯色酶，將還原型輔酶(在340nm 處有吸收峰)氧化成為氧化型輔酶(在340nm處沒(méi)有吸收峰)，從而得以 測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度/速度，通過(guò)測(cè)量340nm處 吸光度下降的速度，可以測(cè)算氨基酸(氮)的濃度大小。實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮， 無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明D-乳酸診斷/測(cè)定試劑 盒較為理想緩沖液100 mmol/L穩(wěn)定劑500 mmol/L還原型輔酶0.25 mmol/L2高鐵細(xì)胞色素c10 mmol/L氨離子20 mmol/LD-乳酸脫氫酶10000U/L丙氨酸脫氫酶10000U/L甘氨酸氧化酶10000U/L本發(fā)明的D-乳酸診斷/測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、2高鐵細(xì)胞色素c、氨離子、D-乳酸脫氫酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、2高鐵細(xì)胞色素C、氨離子。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、D-乳酸脫氫酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶。 還原型輔酶、2高鐵細(xì)胞色素c、氨離子、D-乳酸脫氫酶、丙氨酸脫氫 酶、.甘氨酸氧化酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干 粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、2高鐵細(xì)胞色素c、氨離子。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶。 試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、D-乳酸脫氫酶。 還原型輔酶、2高鐵細(xì)胞色素c、氨離子、D-乳酸脫氫酶、丙氨酸脫氫 酶、甘氨酸氧化酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒 可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直 接使用。無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定D-乳酸濃度的方法，其還原 型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。 實(shí)施例一本實(shí)施例的D-乳酸診斷/測(cè)定試劑為單試劑, 三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 2高鐵細(xì)胞色素c包括100 mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L 20 mmol/LD-乳酸脫氫酶10000U/L 10000 U/L甘氨酸氧化酶 10000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)D-乳酸樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度/速度，從而測(cè)算出D-乳酸的濃度大小。實(shí)施例二本實(shí)施例的MMM診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括:試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑還原型輔酶 -2高鐵細(xì)胞色素C氨離子100mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 10 mmol/L 20 mmol/L試劑2(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑 D-乳酸脫氫f甘氨酸氧化酶100 mmol/L 500 mmol/L10000 U/L10000U/L10000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405證，被測(cè)D-乳酸樣品與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度/速度，從而測(cè)算出D-乳酸的濃度大小。實(shí)施例三本實(shí)施例的D-乳酸診斷/測(cè)定試劑為三試劑，包括試劑l三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶2高鐵細(xì)胞色素c 氨離子試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑甘氨酸氧化酶試劑3三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑 'D-乳酸脫氫酶100 mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 10 mmol/L 20 mmol/L100 mmol/L 500 mmol/L10000U/L10000U/L100 mmol/L 500 mmol/L 10000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測(cè)定D-乳酸濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí) 間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm， 被測(cè)D-乳酸樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方 向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度/速度，從而測(cè)算出D-乳酸的ii濃度大小。申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同， 不另一一例舉?？傊瑢?shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分析儀 器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種利用具有D-乳酸特異性的酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的D-乳酸濃度測(cè)定方法，其方法原理如下D-乳酸+2高鐵細(xì)胞色素cD-乳酸脫氫酶丙酮酸+ 2亞鐵細(xì)胞色素c丙酮酸+氨離子+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶L-丙氨酸 +水+輔酶丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨離子+丙酮酸+ 過(guò)氧化氫將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度/速度，測(cè)算出D-乳酸的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種D-乳酸診斷/測(cè)定試劑盒，主要成分包括緩沖液20-——500 mmol/L穩(wěn)定劑1—一4000 mmol/L還原型輔酶0.1——0.35 mmol/L2高鐵細(xì)胞色素c卜50 mmol/L氨離子1-50 mmol/LD-乳酸脫氫酶1000———80000 U/L丙氨酸脫氫酶1000———80000 U/L甘氨酸氧化酶1000———80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。氨離子可以用氨鹽，如氯化銨。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述D-乳酸診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、2高鐵細(xì)胞色素c、氨離子、D-乳酸 脫氫酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述D-乳酸診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、2高鐵細(xì)胞色素c、氨離子、D-乳酸 脫氫酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶組成雙劑試劑；試劑l,由緩沖 液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、2高鐵細(xì)胞色素c、氨離子組成；試劑2， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、D-乳酸脫氫酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶組成。 還原型輔酶、2高鐵細(xì)胞色素c、氨離子、D-乳酸脫氫酶、丙氨酸脫氫 酶、甘氨酸氧化酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述D-乳酸診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、2高鐵細(xì)胞色素c、氨離子、D-乳酸 脫氫酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶組成多劑試劑；試劑l，由緩沖 液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、2高鐵細(xì)胞色素c、氨離子組成；試劑2， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶組成；試劑3，由緩 沖液、穩(wěn)定劑、D-乳酸脫氫酶組成。還原型輔酶、2高鐵細(xì)胞色素c、 氨離子、D-乳酸脫氫酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶在試劑l、試劑 2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述D-乳酸診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn) 定劑1"^K)00 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用具有D-乳酸特異性的酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的D-乳酸診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定D-乳酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、2高鐵細(xì)胞色素c、氨離子、D-乳酸脫氫酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶及穩(wěn)定劑；通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度下降的程度/速度，從而測(cè)算出D-乳酸的濃度大小。
文檔編號(hào)G01N33/50GK101324560SQ200710023229
公開(kāi)日2008年12月17日 申請(qǐng)日期2007年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司